Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 캔자스 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 지정된 지침에 따라 NIH 가이드 라인을 준수합니다. 1. 신생아 모자 분리 (NMS) <ol><li> 쓰레기 출생 매일 임신 댐을 모니터링합니다. 참고 : 태어난 쓰레기가 P0으로 간주되는 날. </li><li> (P1)에서 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다. </li><li> 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러. </li><li> 적절하게 2 패 유리 비커를 표시, 깨끗한로 홈 케이지 침구 1-2cm의 깊이를 추가합니다. 유리 비커에 홈 케이지에 존재하는 추가 농축 침구 소재, 예를 들어, nestlet, 주름 종이의 약 절반을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 같은 비커에, 개별적으로, 하나의 쓰레기에서 새끼를 모두 넣습니다. </li><li> 즉시 배치인큐베이터에서 비커는 180 분 동안 33 O C와 50 %의 습도에서 개최. </li><li> 차 컨테이너에서 댐을 제거하고 홈 케이지에 그녀를 돌려줍니다. 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 홈 케이지를 돌려줍니다. </li><li> , NMS를 받고 각 쓰레기 / 댐 깨끗한 장갑 및 보조 용기를 사용하여 각 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 그들은 제거로 180 분간 분리 기간의 끝에서와 같은 순서로 자신의 홈 케이지로 돌려 담가. </li><li> 이전에 하루에 분리 된 첫 번째 쓰레기의 홈 케이지를 검색합니다. 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다. </li><li> 인큐베이터에서 첫 번째 비커를 제거하고 새끼를 처리하는 동안 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러. </li><li> 조심스럽게 집 케이지에 비커에서, 개별적으로, 새끼를 이동합니다. </li><li> 에 비커에 남아있는 우라늄 농축과 침구를 돌려줍니다홈 케이지. </li><li> 홈 케이지에 차 컨테이너에서 댐을 돌아 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 돌아갑니다. </li><li> 물을 비이커를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 분리 절차를 통해 각각의 쓰레기에 대해 동일한 비커를 사용합니다. </li><li> 그들은 배양기에 넣고, 같은 순서로 NMS를 받고 각각의 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 각각의 쓰레기 겪고 NMS (P21)를 통해 매일 매일이 전체 절차를 반복합니다. </li><li> 음식과 물을 완벽하게 깨끗한 케이지에서 함께 동성의 한배 새끼를 배치하여 P22에 NMS와 순진한 새끼를 유아. 순진한 새끼가 태어나 NMS 마우스와 같은 조건에서 보관하지만 일반 축산 작업 이외의 추가 처리를 받게 될 수 없습니다. </li></ol> 2. Perigenital 기계 감도 <ol><li> 프레이 장치 설치 <ol><li> 테스트 룸에 마우스를 가져오고 그들이 30 적응 할 수 있도록분은 자신의 홈 케이지에 남아있다. </li><li> 연구자는 마우스, 높이 약 55cm를 깜짝 놀랄없이 아래쪽에서 접근 할 수 있도록 충분한 공간을 제공하는 높은 와이어 메쉬 탑 테이블 (79cm X 28cm) 아래에 흡수 underpad을 배치하여 테스트 영역을 준비합니다. </li><li> 분명,이 뚫린 플라스틱 챔버에서, 개별적으로, 12 마우스에 철망 테이블 상단에 (11cm X 5cm X 3.5 cm)를 놓습니다. 탈출 마우스를 방지하기 위해 챔버 위에 무거운 물체를 놓습니다. </li><li> 움츠림 역치 평가 이전 화면에 추가로 30 분 동안 마우스를 적응. </li></ol></li><li> Perigenital 기계 감도 평가 <ol><li> 경사 본 프레이 모노 필라멘트 (43)의 표준 세트를 사용하는 업 - 다운 방법을 수행. 다음과 같은 모노 필라멘트를 사용하여 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g 및 4.74 g의. <ol><li> 3.22 G 모노 필라멘트의 기초를 잡고 후퇴 모노 노출필라멘트. 참고 : 일부 모델은 후퇴 모노 필라멘트가 없을 수 있습니다. </li><li> 모노 필라멘트가 수직 배향되도록 프로브를 놓다 및 마우스, 경보 움직이며, 그 체중이 뒷발에 고르게 분배 될 때 약간까지, 정중선을 피하고, 음낭 좌우 양측에 적용 벤드는 필라멘트에서 관찰된다. </li><li> 10 초 동안이나 동물이 긍정적 인 반응을 보일 때까지 자리에 모노 필라멘트를 잡습니다. 참고 : 긍정적 인 반응은 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 모노 필라멘트 지향 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 간주됩니다. 이러한 행동을 표시하지 않고, 10 초 모노 필라멘트의인가 마우스 이동, 모노 필라멘트는 최소 1 분 길이의 휴지 기간 다음 재시험되어야한다면. 마우스 이동도도 10 초 모노 필라멘트인가에 나열된 전술 한 동작이 나타나는 경우, 부정 응답 여겨진다. </li><html><li> 실험실 노트북 또는 노트북에, 음 또는 양 중, 응답을 기록하고 3.22 g의 모노 필라멘트를 사용하여 나머지 쥐 모두에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 다시 다음 적절한 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 모두 테스트합니다. 주 : 마우스 3.22 g 모노 필라멘트로 부정 응답을 나타내 경우 동일한 방법으로 3.61 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. 마우스 3.22 g 모노 필라멘트에 양성 반응을 나타내 경우 2.83 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. </li></ol></li><li> 제 양성 반응이 관찰 된 후에 추가의 애플리케이션을위한 4, 적절한 다음 크거나 작은 각 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 시험 계속. </li><li> 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다. </li><li> Chaplan 등. (43)에 기재된 바와 같이 50 % g 움츠림 역치를 계산하는 로그 단위 시험 시리즈인가 최종 본 프레이 모노 필라멘트의 값을 사용한다. </li></ol></li></ol>제목 &quot;&gt; 3. 산성화 톨루이딘 블루 비만 세포 염색 <ol><li> 조직 처리 <ol><li> intracardially 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 45 관류 된 마우스로부터 전립선 조직 44 해부. 후위 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 한 후 4 ° CO / N에 1X PBS의 30 % 자당에 cryoprotect. </li><li> 헵탄의 작은 (30 ml)에 목욕을 준비하고 드라이 아이스에 놓습니다. </li><li> 1X PBS에서 전립선 조직을 씻어 빛 의무 닦아 사용하여 건조. </li><li> 이 동결 될 때까지 차가운 헵탄으로 전립선 조직을 삽입합니다. </li><li> 냉동 될 때까지 즉시 드라이 아이스에 장착 매체와 장소를 포함하는 cryomold에 냉동 전립선 조직을 배치합니다. </li><li> 스토어는 -20 ° C에서 cryomolds. </li><li> 가로 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm의 두께 저온부로 전립선 조직을 잘라. </li><li> 긍정적으로 충전 된 현미경 슬라이드에, 조직의 길이에 걸쳐 12 비 직렬 저온부 - 8 놓습니다. </li><li> 저장소 추가 처리 할 때까지 -20 ° C에서 슬라이드를 마쳤다. </li></ol></li><li> 산성화 된 톨루이딘 블루 준비 <ol><li> 1 % 스톡 용액을 제조 할 때까지 용액에 100 ml의 70 % 에탄올과 와류에 톨루이딘 블루 O 1 g을 넣고. 원액은 최대 3 주 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 교반 판의 상단에 배치 비커에 100ml의 물에 1g의 NaCl을 추가합니다. </li><li> 달성되는 1.0 - 0.5의 pH 범위까지 12 M 염산을 사용하여 NaCl 용액의 pH를 조정한다. </li><li> 톨루이딘 블루 스톡 용액 8 ml의 1 % NaCl 용액 32 ㎖에 결합하여 0.25 % 톨루이딘 블루 작업 용액을 준비한다. 톨루이딘 블루 원액의 전체 통합을 보장하고 소용돌이를 사용하여 혼합 아래로 피펫합니다. 작업 솔루션은 신선한 만든 및 사용 후 폐기해야합니다. </li></ol></li><li> 전립선 저온부 염색 <ol><li> 냉동고에서 처리되는 슬라이드를 제거하고 약 30 m에서 RT로 평형을 허용있다. </li><li> 개별적으로 슬라이드 마운트 조직 섹션 완전히 잠수되는 것을 보장하기 위해 1X PBS의 충분한 양을 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 약 1 초 동안 침지하여 슬라이드 조직 절편을 씻는다. 슬라이드는 종이 타월에 공기 건조하도록 허용합니다. </li><li> 충분히 0.25 % 작업 톨루이딘 블루 솔루션을 포함하는 유리 염색 항아리에 넣어 슬라이드는 슬라이드에 장착 된 조직 절편이 완전히 침수 될 수 있도록 10 동안 배양 - 동안 15 rpm으로 설정 플랫폼 로커에 15 분. </li><li> 약 1 초 동안 1X PBS에서 딥 슬라이드 초과 톨루이딘 블루를 씻어. </li><li> 슬라이드 배수를 허용하도록 그들의 양쪽되는 방식으로 슬라이드 박스 또는 선반 슬라이드를 놓는다. </li><li> 2 시간 또는 RT에서 O / N의 최소 37 ° C의 오븐에서 슬라이드를 건조. </li><li> 알코올 노출 사이의 슬라이드는 완전히 건조 있도록 신속 알코올을 사용하여 슬라이드를 탈수. 종이 수건에 배수에 의해 건조 슬라이드차 경량으로 닦아 백업 및 가장자리가 닦습니다. <ol><li> 약 1 초 동안 95 % EtOH로에서 슬라이드를 담그고 완전히 건조 할 수 있습니다. 조직이 보라색보다 더 푸른 건조 될 때까지 10 회 -이 절차 1을 반복합니다. </li><li> 약 1 초 동안 100 %의 EtOH에 슬라이드를 담그고 완전히 말리십시오. 조직이 매체 파란색으로 어두운하지만, 보라색되지 때까지 10 배 -이 절차 1을 반복합니다. </li></ol></li><li> 3 분 동안 100 % 크실렌의 슬라이드를 배양하여 얼룩을 수정합니다. 건조하도록 허용합니다. </li><li> 글리세롤, PBS, 또는 자일 렌 계 영구 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 커버 슬립. 실온에서 초과 용지 및 저장을 배출합니다. </li></ol></li><li> 정량화 비만 세포 <ol><li> 20X 배율 광학 현미경을 사용하여 (그림 2)에서 톨루이딘 블루 스테인드 조직 섹션을 시각화. </li><li> 가시 영역 내에 존재하는 비만 세포의 총 수를 계산 및 비 degranulated degranulated 및 비만 세포를 구별. 40X의 MAGNIFICAT이온 일부 비만 세포에서 과립의 상태를 확인하기 위해 필요할 수있다. 참고 : 비 degranulated 비만 세포가 없거나 희미 핵 개요 및 / 또는 세포 주위에 세분화 된 압출과 밀도 metachromasia을 나타낸다. Degranulated 비만 세포는 덜 심한 metachromasia를 나타내고 세포질 내 및 셀 경계 외부 핵 및 / 또는 자유 과립 명백한 명확한 윤곽을 갖는다. </li><li> 현재 조직 절편의 전체 비 degranulated degranulated 및 비만 세포의 총 수를 지속적으로 평가. 길이 각 조직에 걸쳐, 최소 7 추가적인 별도의 섹션에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 하기 식에 따라 각 조직 / 전체 마우스 비만 세포에 degranulated (DG)의 비율을 계산한다 (DG 비만 세포 / 총 비만 세포) × 100. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 성인 수컷 마우스에서 CP / CPPS 나타내는 symptomology를 유도하기 위해, NMS의 형태, 신생아 응력을 사용하는 방법을 제공한다. 성인, NMS 마우스는 상당한 perigenital 기계적 이질통뿐만 아니라 전립선 조직 비만 세포 탈과립의 증거를 표시. NMS의 사용으로, 그것은 종종 만성 골반통 12-14 환자에서보고 어릴 응력을 복제하는 것을 CP / CPPS의 전임상 모델을 개발할뿐만 아니라 비 침습?...

만성 골반통 자체가 질병이 아니라, 과민성 대장 증후군 (IBS)으로 진단 환자가 경험 지속적인 자발 및 / 또는 유발 통증, 간질 성 방광염 / 통증 방광 증후군 (IC / PBS), vulvodynia와 연관된 기간, 만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS). 이러한 증후군은 종종 면역계, 중추 신경계, 말초 신경계 내에서 부전 이러한 질환 (1)의 유지 보수 및 진행에 기여하는 것으로되어 있지만, 그들이, 연관된 병리 또는 식별 근본적인 원인이 없다고 많은 특성을 동반하고 공유되고 -3. 만성 골반 통증 환자의 증상을 제시 할 가능성이 추가, 비 골반 관련 hypothalamic-의 변경된 기능과 관련되어 불안, 우울증과 공황 장애 4-6, 포함 기능 통증 질환 및 기분 장애를, pituitary-부신 (HPA) 축 7-10. 초기 생활 스트레스 나 외상에 노출 HPA 이상과 관련된 만성 통증 증후군 (10, 11)과 같은 개발을위한 중요한 위험 인자, 기능 골반 통증 장애 환자의 상당 부분 집합은 학대 나 방치 등의 부작용 어린 시절의 사건을 경험 한보고한다 12-14. preweaning 기간 동안 일정 시간 동안 자신의 댐에서 새끼를 제거하는 것을 포함 신생아 산모의 분리 (NMS)의 설치류 모델은 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 지난 20 년간 사용되어왔다. 일반적으로, NMS 직접 시상 하부 내에서 유전자 발현에 영향을 미칠뿐만 아니라, 변연 구조 15-18 하류 조절을 방해하여, HPA 축의 활성화 및 결과적인 불안 같은 행동을 증가시키는 것으로 나타났다. 적절한 HPA 축 작동 중단 증가 대장 19-22에 기여하는 것으로 나타났다 </sup&gt; 및 질 (16) 감도는 NMS 설치류 모델이 표시되지만 산후 방광 염증 23-25의 장기적인 효과의 광범위한 특성에도 불구하고, 초기 생명 응력의 영향은 크게 비뇨 기관에서 배우지왔다. 따라서, 다음의 연구는 마우스에서 NMS을 수행하고 나중에 CP / CPPS위한 전임상 모델로서 남성 NMS 마우스의 사용을 확인하는 전립선 perigenital 기계적 감도 및 비만 세포 침윤 / 활성화를 평가하는 방법을 설명한다. 진단 만성 골반 통증 질환의 모든 중, CP / CPPS는 요통이나 류마티스의 두 번 아마도 약 14 % (26)의 평생 유병률과 4,400달러 (추정 연간 환자 비용에도 불구하고 가장 잘 인식과 특징 증후군이다 관절염 27). 회음부, 항문이, 전립선, 음경, 고환, 및 / 또는 복부 (28)는, 하이를 경험에 CP / CPPS 보고서 통증 환자gher 대조군 (29)보다 심리적 스트레스의 정도, 그리고 나의 증상이 일반적으로 현재는 동반 만성 골반 통증이나 기분 장애 5,29-31으로 진단된다. 재발 성 감염, 누설 상피, 신경성 염증 및자가 면역 모두 기저 전위 / CPPS 2,32,33 CP의 요인뿐만 아니라, 비만 세포 활성 및 탈과립 (34)로 추측되고있다. 또한 증가하고, 비만 세포 활성화 마커 CP / CPPS 남성로부터 발현 전립선 분비물 비만 세포 트립 타제 및 신경 성장 인자 (NGF) 레벨 (34)이 증가하였고, 이후 연구 트립 타 아제를 확인하고 (CPA3)를 카르복시 CP / CPPS 환자 (35)의 소변. 발병 및 CP / CPPS의 유지 보수에 비만 세포의 잠재적 인 역할은 지금까지이 증후군에 대한 동물 연구의 주요 초점이되고있다. 가장 일반적으로 사용되는 설치류 모델이 CP를 연구하는 데 사용 / CPPS는 실험자가 면역 전립선 염이다 (EAP) 모델 겐34,36-39 사용 종과 변형에 따라 전립선 염증의 변화도 초래 완전 프로 인트 보조제, 전립선 항원의 피하 주사에 의해 erated. 비만 세포의 침윤 및 활성화 / 탈과립은 EAP 34,35,40의 다음 유도를 증가하는 것으로 나타났다. 비만 세포 (34) 또는 트립 타제 수용체 PAR2 (35) 중 하나에 결함이 형질 전환 마우스는 야생형 EAP 마우스와 달리 EAP 다음 전립선 전술 감도를 개발하지 않습니다. 이 전임상 모델은 인간의 CP / CPPS의 많은 특징을 복제하는 동안, 유도 프로토콜 직접적인 염증, 감염, 또는 전립선의 손상을 포함하지 않는 종종 다양한 원인을 가지고 있으며, 인간의 상태를 나타내는 아니다. 인간의 CP / CPPS의 개발에 초기 생활 스트레스의 영향은 크게 uninvestigated 갔다; 그러나, 후진타오, 등. (41)에 의해 연구는 나를 시연N 어린 시절 신체적, 감정적 인의 역사를보고, 및 / 또는 성적 학대는 CP / CPPS을 암시하는 증상을 경험 훨씬 더 많은 것으로 나타났다 사람들. 또한, 그들은 고통과 소변 점수가 모두 신체적, 정서적 학대의 역사를 가진 환자에서 증가 된 것으로 나타났다. 우리는 이전에 암컷 C57BL / 6 마우스에서 NMS 같은 패러다임에 질 과민증 비정상적인 유전자 발현을 생산하고 있음을 증명하고있다 양쪽 성기 및 역기능 HPA 축 (16)의 출력 암시 방광. 보다 명확 어릴 응력 노출 12-14과 연계되는 것으로 도시되었다 IC / PBS 및 기분 장애를 포함하는 다른 동반 질환 (42), 제시하는 CP / CPPS 환자의 높은 유병률과 결합이 증거는, 사용에 대한 근거를 제공한다 NMS 모델 생쥐에서 CP / CPPS을 알아보고자 하였다.

<table><tbody><tr><td>Pregnant C57BL/6 female mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td></tr><tr><td>2 L glass beaker(s)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS10002L</td><td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td></tr><tr><td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td><td>VWR International</td><td>414005-124</td><td>The incubator should be held at 33&amp;deg;C and 50% humidity.</td></tr><tr><td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td><td>Stoelting</td><td>58011</td><td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td></tr><tr><td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td><td>IITC</td><td>435</td><td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&amp;deg;C overnight.</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td></tr><tr><td>Standard Cryomold&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>4557</td><td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>12 x 125 ml</td></tr><tr><td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td>75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td></tr><tr><td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td></tr><tr><td>GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>C-3394</td><td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td></tr><tr><td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-815</td><td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td></tr><tr><td>Xylenes (Histological)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P</td><td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td></tr><tr><td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td><td>VWR International</td><td>82003</td><td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-400</td><td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td></tr><tr><td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td><td>VWR International</td><td>4111</td><td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td><td>VWR International</td><td>48393-106</td><td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS)은 14 %의 평생 유병률이 50 세 미만의 사람에 대한 가장 일반적인 비뇨기과 진단이다, 그러나 그것은 적어도 이해하고 연구 만성 골반 통증 질환이다. 만성 골반 통증 보고서 환자의 중요한 부분 집합은 현저하게 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축의 기능 및 규제에 영향을 미칠 수있는 생애 초기 스트레스 또는 학대를 경험 한. 표시되었습니다 비만 세포의 활성화는, 부분적으로 HPA 축 다운 스트림 활성화에 의해 조절된다, 모두 소변으로 증가 CP / CPPS 환자의 전립선 분비물을 표현한다. 신생아 산모의 분리 (NMS)는 HPA 축과 내장 감도의 변화를 포함한 설치류 모델에서 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 20 년 이상 사용되어왔다. 여기에서 우리는 남성 C57BL / 6 마​​우스에서 CP / CPPS의 전임상 모델로 NMS를 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 방법을 설명perigenital 기계적 이질통 및 비만 세포 활성화의 증거를 조직 학적 평가, NMS를 행하는. 우리는 또한 초기의 심리적 스트레스가 마우스에서 남성 비뇨 생식기 시스템에 오래 지속되는 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공한다.

NMS받은 마우스는 CP / CPPS를 나타내는 행동의 증거를 보여 주었다. 프레이 모노 필라멘트 8 주령 NMS 마우스의 등급 일련의 시험 할 때 (N = 4) 순진 대응에 비해 perigenital 기계적 이질통을 표시 (N = 5, 그림 2). 모노 필라멘트 지향 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 기록, 긍정적 인 행동 반응을 이끌어 낸 기계 탈퇴 임계 값에?...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다.

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K 조회수.  University of Kansas Medical Center.  만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다. 

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors. Using animal models to accomplish this goal, many methodological strategies require invasive techniques to manipulate the intensity of the behavior of interest (e.g., lesion methods, pharmacological manipulations, microdialysis techniques, genetically-engineered animal models). The utilization of a comparative species approach allows researchers to take advantage of naturally occurring differences in response strategies existing in closely related species. In our lab, we use two species of the Peromyscus genus that differ in paternal responses. The male California deer mouse (Peromyscus californicus) exhibits the same parental responses as the female whereas its cousin, the common deer mouse (Peromyscus maniculatus) exhibits virtually no nurturing/parental responses in the presence of pups. Of specific interest in this article is an exploration of the neurobiological factors associated with the affiliative social responses exhibited by the paternal California deer mouse. Because the behavioral neuroscience approach is multifaceted, the following key components of the study will be briefly addressed: the identification of appropriate species for this type of research; data collection for behavioral analysis; preparation and sectioning of the brains; basic steps involved in immunocytochemistry for the quantification of vasopressin-immunoreactivity; the use of neuroimaging software to quantify the brain tissue; the use of a microsequencing video analysis to score behavior and, finally, the appropriate statistical analyses to provide the most informed interpretations of the research findings.

The comparative species approach allows behavioral neuroscientists to explore various neurobiological factors associated with specific behaviors viewed as characteristic of a specific animal model. Taking advantage of naturally occurring differences in behavior between closely related species, this technique doesn&#x2019;t require invasive techniques to manipulate the expression of the behavior.

아버지의 응답의 신경 생물학을 맡은 이후로 비교 종의 접근법을 사용

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

연구

신경과학

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

세균 Prostatitis의 손쥐 모델에 촉각 Allodynia 측정

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

면역학 및 감염병학

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Using a Murine Model of Psychosocial Stress in Pregnancy as a Translationally Relevant Paradigm for Psychiatric Disorders in Mothers and Infants

The peripartum period is considered a sensitive period where adverse maternal exposures can result in long-term negative consequences for both mother and offspring, including the development of neuropsychiatric disorders. Risk factors linked to the emergence of affective dysregulation in the maternal-infant dyad have been extensively studied. Exposure to psychosocial stress during pregnancy has consistently emerged as one of the strongest predictors. Several rodent models have been created to explore this association; however, these models rely on the use of physical stressors or a limited number of psychosocial stressors presented in a repetitive fashion, which do not accurately capture the type, intensity, and frequency of stressors experienced by women. To overcome these limitations, a chronic psychosocial stress (CGS) paradigm was generated that employs various psychosocial insults of different intensity presented in an unpredictable fashion. The manuscript describes this novel CGS paradigm where pregnant female mice, from gestational day 6.5 to 17.5, are exposed to various stressors during the day and overnight. Day stressors, two per day separated by a 2 h break, range from exposure to foreign objects or predator odor to frequent changes in bedding, removal of bedding, and cage tilting. Overnight stressors include continuous light exposure, changing cage mates, or wetting bedding. We have previously shown that exposure to CGS results in the development of maternal neuroendocrine and behavioral abnormalities, including increased stress reactivity, the emergence of fragmented maternal care patterns, anhedonia, and anxiety-related behaviors, core features of women suffering from perinatal mood and anxiety disorders. This CGS model, therefore, becomes a unique tool that can be used to elucidate molecular defects underlying maternal affective dysregulation, as well as trans-placental mechanisms that impact fetal neurodevelopment and result in negative long-term behavioral consequences in the offspring.

The chronic psychosocial stress (CGS) paradigm employs clinically relevant stressors during pregnancy in mice to model psychiatric disorders of mothers and infants. Here, we provide a step-by-step procedure of applying the CGS paradigm and downstream assessments to validate this model.

어머니와 유아에 있는 정신 장애에 대한 번역 관련 패러다임으로 임신에 있는 심리사회적 긴장의 Murine 모형을 이용하

The peripartum period is considered a sensitive period where adverse maternal exposures can result in long-term negative consequences for both mother and ...

행동분석학

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

의학

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

신생아 Polymicrobial 패 혈 증에 대 한 제어 마우스 모델

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in offspring. Animal models of MIA are used to test causality, investigate mechanisms, and develop diagnostics and treatments for these disorders. Despite their widespread use, many MIA models suffer from a lack of reproducibility and almost all ignore two important aspects of this risk factor: (i) many offspring are resilient to MIA, and (ii) susceptible offspring can exhibit distinct combinations of phenotypes. To increase reproducibility and model both susceptibility and resilience to MIA, the baseline immunoreactivity (BIR) of female mice before pregnancy is used to predict which pregnancies will result in either resilient offspring or offspring with defined behavioral and molecular abnormalities after exposure to MIA. Here, a detailed method of inducing MIA via intraperitoneal (i.p.) injection of the double stranded RNA (dsRNA) viral mimic poly(I:C) at 12.5 days of gestation is provided. This method induces an acute inflammatory response in the dam, which results in perturbations in brain development in mice that map onto similarly impacted domains in human psychiatric and neurodevelopmental disorders (NDDs).

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using PolyI:C to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

Maternal infection is a risk factor for neurodevelopmental disorders. Mouse models of maternal immune activation (MIA) may elucidate infection's impact on brain development and function. Here, general guidelines and a procedure are provided to produce reliably resilient and susceptible offspring exposed to MIA.

자손의 감수성과 회복력을 연구하기 위해 Poly(I:C)를 사용하여 임신 중기 모체 면역 활성화의 재현 가능한 모델 생성

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in ...

<meta charset="utf8"></head><body>조기 산후 통증 연구를 위한 조산쥐 모델 만들기

A Preterm Rat Model for Pain Studies

This research delves into the consequences of consistent pinprick stimulation on preterm offspring to ascertain its long-term implications for pain sensitivity. The primary objective of this protocol was to investigate the impact of neonatal pinprick stimuli on the pain threshold in the later stages of life using a preterm rat model. By establishing this model, we aim to advance the research on understanding and managing early postnatal pain associated with prematurity. The findings of this study indicate that while the baseline thresholds to mechanical stimuli remained unaffected, there was a notable increase in mechanical hypersensitivity following complete Freund's adjuvant (CFA) injection in adult rats. Interestingly, compared with male rats, female rats demonstrated heightened inflammatory hypersensitivity. Notably, maternal behavior, the weight of the litters, and the growth trajectory of the offspring remained unchanged by the stimulation. The manifestation of altered nociceptive responses in adulthood after neonatal painful stimuli could be indicative of changes in sensory processing and the functioning of glucocorticoid receptors. However, further research is needed to understand the underlying mechanisms involved and to develop interventions for the consequences of prematurity and neonatal pain in adults.

<meta charset="utf8"></head><body>통증 연구를 위한 조산쥐 모델

Here, we present a concise protocol for creating a preterm rat model, facilitating research on early postnatal pain management. The method involves performing a cesarean section three days before the expected birth, extracting preterm rat pups via hysterectomy, and integrating them with the biological offspring of a surrogate dam.

통증 연구를 위한 조산쥐 모델

This research delves into the consequences of consistent pinprick stimulation on preterm offspring to ascertain its long-term implications for pain ...