Bu çalışma RM Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırmalar Merkezi (NHMRC) projesi hibe ile desteklenmiştir

Burada açıklanan tüm deneysel prosedürleri UNSW Avustralya Hayvan Bakım ve Etik Kurulu uyulması ve Ulusal Sağlık ve hayvan deney için Tıbbi Araştırma Konseyi Avustralya yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Bu protokolde tüm işlemler, ilgili Hayvan Bakım ve Etik Kurulu gereklerine uygun olarak yapılmalıdır. 1. Asetilkolinesteraz Histokimyasal Boyama <ol><li> Asetilkolinesteraz Reaksiyon karışımı hazırlayın <ol><li> 0.1 M fosfat tamponu (PB) 200 ml asetiltiyoklolin iyodür 290 mg ekleyin. 900 rpm&#39;de bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. </li><li> Sürekli karıştırma altında, glisin, 600 mg ekleyin. </li><li> Ürün tamamen çözünene kadar yavaş yavaş sürekli karıştırma altında, reaksiyon karışımına bakır sülfat ve 420 mg ekleyin. </li></ol></li><li> Hayvan karkas deriyi kaldır kesiler yaparak (doku paylaşımı yoluyla elde edilen)Bir perfüze sıçan veya fare derisi, boyun bölgesinde cildi tutup ayağa geçmiş çekerek içine. Her kas kapsayan fasya kaldırıldı veya önemli ölçüde reaksiyon çözeltisine kas liflerinin bol pozlama sağlamak için delikli ya olduğundan emin olun. </li><li> Reaksiyon karışımına tüm vücudu veya ilgi bacak daldırın ve 4 ° C de O / N inkübe edin. </li><li> Damıtılmış su içinde 2 dakika boyunca karkas yıkayın. Not: Bu aşamada, kaslar mavi bir renk ve motor uç plakaları (MEP) beyaz noktalar olarak görülebilir sergiler. </li><li> 3-5 saniye için% 10 amonyum sülfit çözeltisine karkas Açığa. Not: kas lifleri hızla kahverengi dönecek ve Parlamento üyeleri siyah benekli noktalar olarak gözlemlenebilir olacak. Reaksiyon çok hızlı oluşur ve kas lifleri amonyum sülfit çözeltisi (örneğin,% 5) daha düşük konsantrasyonlarını kullanmayı deneyin milletvekilleri ve kas lifleri ayırt etmek çok koyu lekeli ise. Tepkime süresi almak içinAP üyeleri ve kas lifleri arasında iyi kontrast bir örnekten diğerine değişir. Bu nedenle ayıracı kesin pozlama süresini tanımlamak zordur. Reaksiyon yakından izlenmeli ve kontrast yeterli görüldüğünde durdurulmalıdır. </li><li> Distile su içinde çalkalanarak karkas iki kez yıkayın ve yavaşça kurulayın karkas. </li><li> Fotoğraf ilgi tüm kaslar için milletvekilleri yakalanır sağlamak ekstremitenin lateral ve medial yönleri, hem de. </li></ol> 2. İntramüsküler Enjeksiyonlar Motor Sonu Plakalar de <ol><li> Mikropipet çektirmesi ile cam mikropipetler çekin (pistonları ile kademeli mikropipetlerin kullanılması tavsiye edilir). Inceleyici bir mikroskobun yardımıyla, mikropipet lümenin iç çapı yaklaşık olarak 0.5 mm, öyle ki bir çift forseps ile mikropipetler ipuçlarını bölünürler. </li><li> Kullanılan tüm cerrahi aletler taze otoklava ve inci emin olunCerrahi alanda sterildir. </li><li> Floro-Gold (distile su içinde% 5) ile mikropipetler doldurun. </li><li> Izofloran (O 2% 4) ile bir indüksiyon odasında hayvan anastetize neden olur. Refleksi kontrol edin ve indüksiyon odasından çıkarmadan önce onun yokluğunda sağlamak. Sıçan burun üzerinde bir burun konisi Güvenli ve anestezi bakımı için isofluorane (O 2% 2) teslim. Hayvanın ayak parmakları Pinch ve yavaşça pedal çekilmesi ve kornea refleksleri hem bulunmadığına emin olmak için hayvanın gözü dokunun. Not: ketamin ve xylazil bir karışımı da kullanılabilir (80 ve 10 mg / kg, intraperitonal olarak verilen). Ketamin bir zamanlama 8 (&quot;Kontrollü&quot;) ilaç ve uyulması gerekecektir ilacın satın alınması, kullanılması, depolanması ve bertaraf ile ilgili gerekli protokoller olduğunu. </li><li> Prosedürü sırasında gözlerin kurumasını önlemek için göz yağlayıcı. </li><li> T Tıraşargeted bacak ve kullanım gazlı bez, üç klorheksidin alternatif scrubs ve% 70 alkol ile traş bölgeyi silin. Cerrahi alana hayvan aktarın. </li><li> Temiz bir underpad hayvan koyun ve hedeflenen kas (lar) iyi erişim sağlamak için uygun bir şekilde yerleştirin. </li><li> Uzakta yatan kas hedeflenen kas üzerindeki deriyi kaldırın ve cerrahi makas ile deride bir kesi yapmak için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Kesi tamamen ilgi kas (lar) maruz yeterince büyük olduğundan emin olun. Fasya minimal bozulma olduğundan emin olun. </li><li> Zihinsel kas (lar) üzerine MEP bölgenin konumunu ve şeklini devrik MEP fotoğrafları kullanın. Not: Bir ince keçe işaretleyici ilgi kas (lar) üzerine fotoğraftan MEP bölgesini çoğaltmak yardımcı olabilir. </li><li> Her bir s 1-2 ul 3-4 enjeksiyonlar, Flor-Gold için (MEP bölgenin tüm uzunluğu boyunca çok sayıda enjeksiyon gerçekleştirmehould) yeterli olabilir. Yavaşça herhangi sızıntıyı gidermek için kas (lar) silin. </li><li> Birbirine yakın künt forseps ile kazıma cilt iki ucunu getirin ve cerrahi klipler ile yarayı kapatmak. Yaranın tüm açıklık boyunca 0.1 mi bupivakainin (su içinde% 0.5) (ya da başka lokal anestezikler) sızın. </li><li> Kapalı anestezi Makineyi açın ve tamamen anestezi kurtarılır kadar hayvan izleyin. </li><li> Kas içi enjeksiyonların uygulanmasından ve hayvanların perfüzyon arasında 14 gün boyunca bekleyin. </li></ol> 3. Perfüzyonları <ol><li> Periton içine enjeksiyon yoluyla bir hayvana (150 mg / kg, örneğin Lethabarb) pentobarbiton sodyum çözeltisi öldürücü doz uygulayın. <ol><li> Pedal çekilmesi yokluğunda ve kornea refleksleri tarafından onaylandıktan anestezi derin bir düzeyde, ulaşılana kadar yakından hayvan izlemek. </li></ol></li><li> Bir perfusio üzerine yerleştirilen bir diseksiyon gemide sırtında hayvan yerleştirinn lavabo. </li><li> Sternum tabanını kaplayan derinin kaldırılması için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Hemen sternum altında güçlü cerrahi bir makasla küçük bir cilt kesisi yapın ve daha sonra kavrama sternum kılıç şeklinde kıkırdak forseps kullanabilir. Kılıç şeklinde kıkırdak tutarken, koltukaltı için sternum, göğüs boşluğunun her iki tarafında kesi büyütmek. </li><li> Kalp maruz diyaframı kesin. <ol><li> Kan pıhtılaşmasını önlemek için doğrudan kalp apeksine heparin 0.ml enjekte edilir. </li><li> Sol ventrikül içine bir kanül yerleştirilmesine imkan vermek için tepe kesin ve daha sonra hızlı bir şekilde Hemostatik yardımı ile yerine kanül kelepçe. </li><li> İnce bir makas ile sağ atrium bir kesi yapmak ve hemen peristaltik pompa başlar. Atrium dışarı akan sıvının kan neredeyse ücretsiz ve karaciğer rengi açık kahverengi oluncaya kadar 0.1 M PB ile serpmek. Daha sonra, Solu serpmekhayvanın tüm vücut kadar paraformaldehid (0.1 M PB% 4) tion sertleşmektedir. </li></ol></li></ol> 4. Servikal Spinal Kord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık <ol><li> Kendi karın hayvan karkas yatırın. </li><li> Bir neşter ile vücudun orta hatta cilt kesin ve iliak kemik seviyesine kafatası tabanından yansıtmak. </li><li> Kesmek ve omurganın dorsal yönünü ortaya çıkarmak için paravertebral kaslar yansıtmaktadır. </li><li> Atlas, ikinci servikal segmentte (yani, C2) kemik spinoz sürecini tanımlayın ve ilgili temel dorsal kök bulmak için cerrahi rongeurs veya forseps bir çift ile çıkarın. <ol><li> Kalıcı keçe işaretleyici ile boyama sağ C2 kök tanımlayın. </li><li> Bir sonraki vertebra tek çıkarın ve alternatif renkler (yani, C2, C4, C6 ve C8 yeşil ve C3 renkli olabilir sağ dorsal kökleri işaretlemek, C5, C7, T1 col olabilirORed mavi). </li></ol></li><li> Küçük bir cerrahi iğne kullanın (örneğin, 30 G iğne) hafifçe delmek omuriliğin alt ucunu kaplayan dura aracılığıyla. Uzunlamasına yarık yapmak için rostrally iğne taşırken yukarı bakacak şekilde iğne eğim sayesinde, kordon uzak dura kaldırın. <ol><li> Dura Reflect. </li></ol></li><li> Yeni bir neşter bıçağı ile bir veya iki kademeli bloklar halinde omurilik enine doğru kesin. <ol><li> Dikkatlice iki komşu kökleri arasındaki neşter bıçağı yarım her bloğun sol tarafında küçük bir referans işareti yapmak, her blok için, in situ omurilik segmentleri bırakın ve. Blokların ventral görünür olması için referans işareti dokusu sayesinde yeterince derin olduğundan emin olun. Diseksiyon sonra doku parçasının oryantasyon yardımcı olmak için, hayvan anatomisi ile ilgili olarak, ya öne ya da arkaya doğru işaret eden, yaklaşık 45 ° &#39;lik bir açı ile referans işareti sağlayın. </li></ol></li><li> Paraformaldehitten (0.1 M PB% 4) çözeltisi içeren küçük, açıkça etiketlenmiş şişeler içine bireysel blokları toplayın ve RT O / N bırakın. </li><li> Sukroz (0.1 M PB% 30) ihtiva eden bir çözelti ihtiva eden, temiz, açık bir şekilde etiketlenmiş şişelerde blokları aktarın ve en az iki gün boyunca 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Cryo-kalıplar kesimleri yerleştirin ve doku dondurma ortamı ile onları kaplı. Boyuna histolojik hazırlanması için, yukarı bakacak şekilde dorsal bloklar yönlendirmek ve cryo-kalıplarda blok yönlendirmek için referans işareti kullanın. </li><li> -20 ° C&#39;de krio-kalıpları dondurun ve 50 um kalınlığında kesitler bir kriyostat ile kesilmiş. Not: bölümler doğrudan yapışma mikroskop slaytlar üzerine monte ve / N O kurumaya bırakılabilir. Seçenek olarak ise, bölümler 0.1 M PB ile doldurulmuş 48 oyuklu plakalar içinde yüzen edilebilir ve daha sonra, slaytlar üzerinde doku bölümleri yönlendirmek için referans işareti kullanılarak monte edilebilir. </li></ol> 5. Lomber Spinal Cord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık <ol><li> Geri geldi hayvan karkas yatırın. </li><li> Hayvanın karın boyunca bir orta hat kesi gerçekleştirin ve iç organları çıkarın. Vertebral kolonun ventral maruz arka karın duvarı kasları parçalara ayır. </li><li> T13 ventral kök kemiği çıkar kısa kuyruk-en kaburga ve onun bitişiğindeki T13 omur bulun. <ol><li> Ardışık T13 teker, iki veya üç omur rostral birini çıkarın (örneğin, T12, T11 ve gerekirse, T10) ince cerrahi rongeurs ile ventral kord ventral yönünde giriş noktası kadar T13 ventral kök takip etmek ve Kalıcı keçe işaretleyici ile işaretleyin. </li><li> Bu noktadan itibaren, alternatif renkler ile boyama, L1, L2, L3, L4, L5, L6 ve S1 için ventral kök giriş noktaları yerini belirlemek için aynı işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Lum için Bölüm 4,5-4,10 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayınOmurilik diseksiyonu bar. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model.">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li><li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease.">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li><li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li><li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li><li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression.">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li><li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).</li><li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles.">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li><li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1/2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy).">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li><li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice).">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li><li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy.">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li><li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model.">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS.">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li><li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice.">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li><li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., B&#252;eler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2.">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li><li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS.">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li><li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles.">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport.">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+Alternative+energy+for+neuronal+motors.">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li><li>Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study.">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li><li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb:+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin.">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li><li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb.">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li><li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons.">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58 (2013).</li><li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li><li>Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection.">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

İntramüsküler hedefleme ve nöromüsküler durumun deneysel tedavi için gelen α motor nöronlar terapötik transgenlerin sonraki retrograd transferi, yeni bir strateji değildir. Örneğin, bu dağıtım yöntemi SOD1 fareler ve sıçanlar 1,9-12 ALS ilerlemesi farklı aşamalarında olarak SMA 13 olan farelerde kas dejenerasyonu geciktirmek için kullanılmaktadır. Umut verici iken, bu gen terapisi senaryoları etkinliği sınırlı kalmıştır. Bu bağlamda, belkemiği ipliği motor nöron...

Böyle motor nöron hastalığı gibi nörolojik koşullar kaynaklanan ve spinal- istemli hareket yanı sıra Duchenne müsküler atrofi kontrolünün kaybı, etkilenen bireylerin günlük yaşamda yüksek ve uzun ömürlü bir etkiye sahip bir zayıflatıcı bir durumdur. Son on yılda, durdurmak ya da en azından bu nöromusküler hastalıkların zararlı etkilerini geciktirmek amacıyla araştırma çabalarının dünyadaki birçok klinisyen ve bilim adamı için bir öncelik olmuştur. Bu bağlamda, bu nöromüsküler hastalığı taklit hayvan modellerinin son nesil bu koşullar 1-13 gelişimi ve ilerlemesini altında yatan fizyolojik mekanizmaları temel anlayışlar elde vesile olmuştur. Bu nöromüsküler hastalığın tedavisi omurilik doğrudan erişim gerektirir ve omurilik enjeksiyonlar 14,15 ile elde edilebilir. Gen terapisinde son gelişmeler de üst ve çizgili kaslar hedef aldılar veomurilik 1,9-13 ventral boynuz içinde yer almaktadır karşılık gelen α motor nöronlar servis terapötik genlere alt ekstremite. Ancak, bu kez umut verici bir strateji bu nörolojik durumların sonuçlarını iyileştirmek için başarısız oldu. Bu kötü sonuçların olabileceği sonucuna adil olsa da, en azından kısmen, bu koruyucu genlerin düşük etkinliğine bağlı olduğu, kimse bu gen aktarım yöntemleri, düşük etkinliğini gözardı edilemez. Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α kaynaklanan büyük periferik motorlu liflerin akson terminalleri girintilendirildiği iskelet myofibres uzman bölgeleridir. Birlikte, periferik sinir lifi uçları ve Parlamento üyeleri, yani nöromüsküler kavşak, sinaptik darbeleri nörotransmiterin ileriye salınımı, asetilkolin tarafından tetiklenen bölgesini oluşturur. Önemlisi, periferik sinir lifleri ve milletvekillerinin arasındaki ilişki iki Direc olduğunuarası, farklı motorlar yanı sıra uzak nörondan doğru moleküllerin ve organellerin taşınmasından sorumlu olmasına rağmen 16-18 somata. Bu anatomik düşüncelerin ışığında, AP üyeleri ilgili motor nöronlara teslimat ve genetik malzeme daha sonra geriye doğru taşınması için tercih edilen hedefler olarak görünmektedir. Bu bağlamda, bu motor nöron iletimi başarısı büyük ölçüde viral vektörler ve kasın AP üyeleri 19-20 intramüsküler enjeksiyon arasındaki mesafeye bağlı olması şaşırtıcı değildir. Ancak şaşırtıcı bir şekilde, laboratuar sıçan ve fare myofibres ilgili MEP bölgelerinin kesin konumu, seçim iki tür kas hastalıkları modellemek için, yakın zamana kadar mevcut değildi. Biz sıçan ve fare 21-22 çeşitli ön ayakları kaslar için MEP bölgenin kapsamlı haritalar üretmişlerdir. Daha yakın zamanlarda, biz MEP r organizasyonu detaylarını göstermiştirFare hindlimb 23 çeşitli kaslar için egion ve şu anda sıçan hindlimb milletvekilleri özelliklerini analiz ediyoruz. Bizim ellerde, bu kasların bütün MEP bölgelerine yönelik retrograd izleyiciler kas içine enjeksiyonlar önceden bildirilen daha omurilik segmentleri kapsayan vardır daha etiketli motor nöronlar doğurdu. Burada dış yüzeyinde yanı sıra hindlimb derinliği boyunca Avrupa Parlamentosu üyelerinin yerini ortaya koymak ve fare ve sıçan hem de kasları ön ayakları son birkaç yıldır geliştirilmiştir protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>Nil</td><td>Diluted to 5%</td></tr><tr><td>Drummond PCR Micropipets 1-10 &amp;micro;l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>accompanied with plungers</td></tr><tr><td>Acetylthiocholine Iodide</td><td>Sigma Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Diliuted in distilled water</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour</td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td>LETHA450</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus glass slides</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulphide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>Diluted to 10%</td></tr><tr><td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>Diluted to 0.25%</td></tr></tbody></table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

Omurilik motor nöron bütünlüğünü etkileyen hastalıklar en zayıflatıcı nörolojik durumlar arasında yer almaktadır. Son on yıl içinde, bu nöromüsküler bozuklukların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi geciktirmek veya bu şartların ilerlemesini tersine çevirmeyi amaçlayan farklı tedavi senaryolar bilimsel topluluk sağlamıştır. Nöronların retrograd makine yararlanarak, bu yaklaşımlardan birisi omurilik motor nöronlarını karşılık gelen mekik terapötik genlerin amacıyla iskelet kasları hedef olmuştur. Bir kez umut verici olmasına rağmen, bu tür gen verici bir yaklaşım başarılı bugüne kadar elde etmek göstermiştir kalıt motor nöronların alt optimal sayısı engel olmuştur. Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α omuriliğe doğrudan sinaptik temas halindedir iskelet kas üzerinde son derece uzman bölgelerdir. Bu bağlamda, dikkat etmek önemlidir, şimdiye kadar, çabalar retrograd içinMotor nöron içine transfer genlerinin hedeflenen kaslarında MEP bölgenin konumu referans olmadan yapılmıştır. Burada basit bir protokol 1) iskelet kaslarında yüzeyinde milletvekillerinin tam yerini ortaya çıkarmak için ve 2), motor nöronların içine intramüsküler teslimat ve retrograd izleyiciler sonraki optimum retrograd taşıma yönlendirmek için bu bilgileri kullanarak açıklar. Biz Avrupa Parlamentosu üyelerinin hedefleme üzerinden omurilik motor nöronlar terapötik genlerin retrograd taşıma araştıran içine ileri çalışmalar bu izleme deneylerin sonuçlarını yararlanmak istiyoruz.

Asetilkolinesteraz histokimyasal boyama kaslarının genişliği boyunca motor uç plakaları yerini ortaya koymaktadır. 1 bütün sıçan ön ayakları üzerinde gerçekleştirilen bu tür boyama sonuçlarını gösterir Şekil. Bu, amonyum sülfit çözeltisinin konsantrasyonu optimize etmek için önerilmektedir (örn.,% 5-7 yerine% 10) da bir örnek çözelti içine daldırılmaktadır zaman olarak kas lifleri üzerinde spesifik olmayan arka plan boyaması çok ise, Aşır...

Watch this Scientific Journal Video about Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons at JoVE.com

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Motor End Plates boyunca İntramüsküler Enjeksiyonlar: Doğrudan Motor Nöronlar içine Servis Tarayıcıları Bir Minimal İnvaziv Yaklaşım

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Görüntüleme.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Video: Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo pharmacological studies of the signals essential for the formation and maintenance of mammalian NMJs. However, drug penetration into these muscles after subcutaneous or intramuscular administration is often incomplete or uneven and many NMJs can remain unaffected. Although systemic administration with devices such as mini-pumps can improve the spatiotemporal effects, the invasive nature of this approach can cause confounding inflammatory responses and/or direct muscle damage. Moreover, complete analysis of the NMJs in a hind limb muscle is challenging because it requires time-consuming serial sectioning and extensive immunostaining. 
The mouse LAL is a thin, flat sheet of muscle located superficially on the dorsum of the neck. It is a fast-twitch muscle that functions to move the pinna. It contains rostral and caudal portions that originate from the midline of the cranium and extend laterally to the cartilaginous portion of each pinna. The muscle is supplied by a branch of the facial nerve that projects caudally as it exits the stylomastoid foramen. We and others have found LAL to be a convenient preparation that offers advantages for the investigation of both short and long-term in vivo effects of drugs on NMJs and muscles. First, its superficial location facilitates multiple local applications of drugs under light anesthesia. Second, its thinness (2-3 layers of muscle fibers) permits visualization and analysis of almost all the NMJs within the muscle. Third, the ease of dissecting it with its nerve intact together with the pattern of its innervation permits supplementary electrophysiological analysis in vitro9,5. Last, and perhaps most importantly, a small applied volume (&tilde;50&mu;l) easily covers the entire muscle surface, provides a uniform and prolonged exposure of all its NMJs to the drug and eliminates the need for a systemic approach1,8.

We describe procedures for repeated administration of inhibitors of muscarinic signaling to the levator auris longus (LAL) muscle of young adult mice and for subsequent immunostaining of its neuromuscular junctions (NMJs) in wholemounts. The LAL muscle has unique advantages for revealing in vivo pharmacological effects on NMJs.

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus&#39;un Triple-immün

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Nörobilim

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Çok Renkli Sinir Devre Topografya Revealing

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

Erişkin Fare yılında Motor Ünite tarafından üretilen bir Lomber Motonöron ve Kuvvet Eşzamanlı intrasellüler Kaydı<em&gt; In vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This approach has been most extensively used in the brain by utilizing the swine pathogen pseudorabies virus (PRV)1. PRV does not infect great apes, including humans, so it is most commonly used in studies on small mammals, especially rodents. The pseudorabies strain PRV152 expresses the enhanced green fluorescent protein (eGFP) reporter gene and only crosses functional synapses retrogradely through the hierarchical sequence of synaptic connections away from the infection site2,3. Other PRV strains have distinct microbiological properties and may be transported in both directions (PRV-Becker and PRV-Kaplan)4,5&#160;.&#160;This protocol will deal exclusively with PRV152. By delivering the virus at a peripheral site, such as muscle, it is possible to limit the entry of the virus into the brain through a specific set of neurons. The resulting pattern of eGFP signal throughout the brain then resolves the neurons that are connected to the initially infected cells. As the distributed nature of transsynaptic tracing with pseudorabies virus makes interpreting specific connections within an identified network difficult, we present a sensitive and reliable method employing biotinylated dextran amines (BDA) and cholera toxin subunit b (CTb) for confirming the connections between cells identified using PRV152. Immunochemical detection of BDA and CTb with peroxidase and DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) was chosen because they are effective at revealing cellular processes including distal dendrites6-11.

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies&#39;e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Ozmotik implantasyonu Pompalar ve Sistem izleyicilerin teslim fizyopatolojik Koşullarında Beyin Reorganizasyon Çalışması için

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

Birden fazla Motor yolları sıçan Spinal Kord Lentiviral bir vektör direkt enjeksiyon vurgulamaktadır

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Motor End Plates boyunca İntramüsküler Enjeksiyonlar: Doğrudan Motor Nöronlar içine Servis Tarayıcıları Bir Minimal İnvaziv Yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus'un Triple-immün

Çok Renkli Sinir Devre Topografya Revealing

Erişkin Fare yılında Motor Ünite tarafından üretilen bir Lomber Motonöron ve Kuvvet Eşzamanlı intrasellüler Kaydı

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi

Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies'e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

Ozmotik implantasyonu Pompalar ve Sistem izleyicilerin teslim fizyopatolojik Koşullarında Beyin Reorganizasyon Çalışması için

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Birden fazla Motor yolları sıçan Spinal Kord Lentiviral bir vektör direkt enjeksiyon vurgulamaktadır

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi