Bu eser CIHR (MOP394808) ve CMCEWO bir Kanada Araştırma Başkanı bir hibe ile desteklenen NSERC bir Post-Yüksek Lisans Bursu layık görüldü.

Not: Bu protokol, çeşitli tek tabaka kaplama hücre / doku kültürü modelleri, ilaç tedavisi rejimleri ve etiketleme hedefleri ile geniş uyumludur. Böylece gerçek kullanımda, birçok özel parametreler deneysel tasarım göre değişir. Burada, bu kullanıcı tanımlı parametrelere başvurular genel bulunmaktadır. Örnek sonuçlar elde etmek için kullanıldığı haliyle örnek koşullar, italik olarak dahil edilmiştir. 1. Çözümler <ol><li> 0.1 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM), tuzlu su ve% 0.05 Polisorbat 20 karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın; oda sıcaklığında, pH 7.4 ile yıkanır. </li><li> Bloklama tamponu hazırlayın. 0.05 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM) Salin% 0.05 polisorbat 20,% 3 bovin serum albumin (BSA) ve% 0.1 soğuk balık derisi jelatini ekleyin ve oda sıcaklığında pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. </li><li> 0.05 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM) Saline% 0.05 Polisorbat 20,% 1 BSA,% 0.1, soğuk balık derisi jelatini ekleyerek antikor seyreltici hazırlamak ve o 4 ° C&#39;de 7.4 pH ayarlamak Not: Tris tampon pH sıcaklığa bağlıdır. Bu sıcaklıkta bir değişiklik, solüsyonun pH değerinin, değişecektir. Tutarlılık için, bu tamponlar her zaman kullanılacak ısıda, pH ayarlı olmalıdır. </li></ol> 2. Hücre Kültürü Not: Uygun hücre kültürü protokolleri olarak kullanılan hücre tipi (lerine) dayalı olarak değişiklik gösterecektir. Bu prosedürler ayrı olarak optimize edilmelidir. Detaylı hücre kültürü yöntemleri 16 de dahil olmak üzere, kolaylıkla temin edilebilir. Benzer bir prosedür, önemli farklılıklar ile temsili sonuçlar elde etmek için kullanıldı: <ol><li> Yetişkin hayvanların Kültür arka kök gangliyon nöronları 12 tarif edildiği gibi. Kültür hücreleri yetişkin sinir büyüme ortamı kullanın. Yerine glutamat daha preplating ile glial hücre yoğunluğunu azaltın. Bu approximat büyüdü en az 30-60 plaka başına nöronların ve beraberindeki glial hücreler 12-yuvarlak cam lamelleri üzerinde yetiştirilen karışık nöron glial kültürü sonuçlarıely% 40 konflüansa. Bu glia aşırı büyümesi izin verilmesi halinde, birincil kültür nöronları çoğaltma olmayacak ve ko-kültive glia yardımıyla baskı plakasının itildiği olacağı unutulmamalıdır. Nöronlarını etkileyenler önlemek için, gliyal sayı fiziksel indirgeme kimyasal / farmakolojik yöntemler tercih edilir. Not: Bu protokolün amaçları için, ilgi hücreleri yetiştirilmektedir varsayalım onların deneysel-istenen devlet ve tek tabaka kaplama. Biz 24 yuvalı plakalar içinde 12 yuvarlak cam lameller üzerine kaplama en uygun olduğu fark. Tarif edilen tüm miktarlar ve prosedürleri, bir 24 yuvalı plakanın bir oyuk bir lamel için uygundur. </li></ol> Kültür Hücrelerinin 3. İlaç Tedavisi Not: Birden çok sıralı veya üst üste, ilaç tedavileri mümkündür. Belirli deney bağlıdır kullanılan maruziyet ilaçlar, dozları / konsantrasyonları ve süreleri. <ol><li> Orijinal büyüme ortamı çıkarın 16 </sup&gt; ve seçilen konsantrasyona (ler) de ilgi ilaç (lar) içeren ortamı ile değiştirin. Bu durumda, morfin, 10 uM tuzlu su içinde çözünür ya da kontrol olarak salin kullanmaz. Not: her bir bağımsız tekrarlanan (genellikle tek bir 24-çukurlu plaka kültür) aynı ortak kontrol koşulu içermesi önemlidir. Bu arası deneme değişkenlik düzeltir çoğaltır arasında veri normalleşmesini, izin verecektir. </li><li> 48 saat süre ile 16 orijinal büyüme koşulları hücreleri inkübe edin. </li><li> Daha sonra ilaç tedavileri için, tekrar 3.1 adımları ve Deltorphin 1 uM ile 3.2 SNC80 1 uM ya da araç ve 60 dakika 12 boyunca inkübe edin. Su içinde Deltorphin II çözünmezler ve su içinde 1 mM&#39;ye seyreltilmiş 40 uM HCI ve sonikasyon, 10 mM&#39;de SNC80 çözünür. Not: Bu protokol, seçtikleri büyüme ortamı içinde arzu edilen konsantrasyona (ler) eritilebilir olduğu ilaç (lar) gibi çözünebilir edilmiştir varsayar. Için uygun prosedürlerbu çözündürme, söz konusu ilacın bağlı olarak değişecektir ve ayrı olarak optimize edilmelidir. </li><li> Yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça üç defa hücreleri yıkayın. (Yıkama tamponu ile bu durumda) arzu edildiği gibi hafifçe taze çözelti ile iyi bir doldurma, kuyudan sıvının aspire, daha sonra derhal, yavaşça her yıkama yapın. </li></ol> 4. Tespit ve İmmünositokimya Not: Belirli etiketleme hedefleri deney ile değişecektir. Tartışıldığı gibi bizim kullanmak, biz, delta opioid reseptörleri (DOR) ve Rab5, Rab 11 ve LAMP1 etiketli. spesifik antikorlar, belirli bir deney bağlıdır kullanılır. Optimum etiketleme koşulları spesifik antikor kullanılır (ler) bağlıdır. Bu konunun bir çok dolgun bir tartışma altındadır. <ol><li> 37 ° C &#39;de 10 dakika boyunca ~ 0.1 M fosfat tamponlu salin içinde 300 ul% 4 paraformaldehid daldırma hücreleri saptamak. Not: Önemli olan bu% 4 paraformaldehit taze nedeniyle önceden dondurulmuş paraformaldehit kullanımından kaynaklanan otofloresansı için hazırlıklı olun. </li><li> 3.3&#39;de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat süre ile blokaj tamponu ul 300 hücreleri inkübe edin. </li><li> 4 ° C &#39;de 48 saat süre ile, antikor seyreltici 300 ul primer antikorlar ile inkübe hücreleri. Bizim Kullanım sırasında, birincil DOR karşı antikorların (tavşan anti Dor) ve on: Rab5 (fare anti-Rab5), Rab 11 (fare anti-Rab11) ve LAMP1 (keçi anti-LAMP1). </li><li> 3.3&#39;de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça üç defa hücreleri yıkayın. </li><li> Farklı fluorophores konjüge edilmiş sekonder antikor ile inkübe hücreleri oda sıcaklığında 1 saat için antikor seyreltici 300 ul (aşağıdaki tartışmaya bakınız). Bu ve takip eden tüm adımlarda ışık hücreleri korur. Temsili sonuçlar elde etmek için, yeşil yayan fluorofor-konjuge anti-tavşan ve eith kullanmaker kırmızı yayan fluorofor konjuge edilmiş anti-fare ya da kırmızı yayan fluorofor-konjuge anti-keçi. </li><li> 3.3&#39;de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> ~ Plakayı tutan, iyi her 45o yıkama tamponu ~ 1 ml bırakarak 24 kuyucuğu 12-yuvarlak lamelleri çıkarın ve ince forseps kullanılarak kuyu zemin kapalı lamel kolu. lamel kolayca forseps kullanılarak kaldırılabilir yerden, iyi duvara dinlenmek için gelecek. </li><li> Mikroskop üzerinde, lamelleri, hücre tarafı aşağı monte montaj orta, anti-solma slaytlar. </li></ol> 5. Mikroskop Ayarları <ol><li> Yüksek büyütmeli objektif (100X) kullanarak, ilk Epifloresans kullanarak görüntülü edilecek bir temsilci hücreyi bulun. </li><li> Örneğin kullanılan her floroforun algılama, 488 nm ve 59 için (her etiketli kanalın 8-bit sıkıştırılmamış TIFF görüntüleri kaydetmek için görüntü yakalama ayarlarını yapılandırın4 nm), (ya hat ya da çerçeve), ve son görüntü için ortalama 4 ila 6 taramalara görüntüye her kanal sıralı. Optimal görüntü çözünürlüğü mikroskop özgü olacak ama x 1024 1024 genellikle iyi sonuç verir. </li><li> Konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen z-düzlemine odaklanmak. </li><li> Iğne deliği (tipik olarak 1 Airy birimi), lazer gücü ve photomultiplier tüp gerilimi (kazanç) Optimize ve her bir kanal için ofset. Bu ayarları kaydetmek / kaydedin. Aynı çoğaltmak herhangi belirli bir hedef çifti için etiketlenmiş tüm hücreleri görüntüleme için aynı mikroskop ayarları kullanın. Not: Bu işlem, genellikle, bu hücre analizi için görüntülenmiştir gerektiğini yeterli ışıkla ağartma neden olur. </li></ol> 6. Görüntüleme <ol><li> Yüksek bir büyütme objektif (ör 100X) kullanarak, birinci Epifloresans kullanarak görüntülü bir hücre bulun. </li><li> Konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen z-düzlemine odaklanmak. Benf mevcuttur, kullanım yazılım yakınlaştırma / kırpma ilgi hücreye tarama alanını kısıtlamak için. </li><li> Ayarları kullanarak her işaretli kanal için Yakalama görüntüleri, daha önce kurulmuş. Tekrarlayın yeterli örnek sağlamak için görüntüye çoğaltmak başına koşulu başına 15 veya daha fazla hücre 6,1-6,3 adımları. </li></ol> 7. ko Analizi <ol><li> Görüntülerin çifti açın (örneğin, &#39;yeşil&#39; ve &#39;kırmızı&#39;), ImageJ bir hücrenin. &gt; Renk&gt; RGB görüntü oluşturmak için komut ... Kanallar Birleştirme Görüntü kullanın. </li><li> Ilgi hücrenin etrafında bir seçim çizin. Seçilen hücredeki hedeflerin ko ölçmek için (https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/ edinilebilir 11) &quot;PSC ko&quot; eklentisi ImageJ kullanın. </li><li> İstenilen ko önlem (genellikle Pearson r 17) kaydedin. Tekrarlayın, her görüntülü hücre için 7,1-7,3 adımları. </li></ol&gt; 8. Veri Normalleştirme <ol><li> Her ortak denetim koşullarının kayıtlı ko değerlerinin ortalamasını hesaplayın her etiketleme durumunun çoğaltırlar. Not: Örneğin, nöronların ko değerlerinin ortalama &quot;48 saatlik bir araç, 60 dakikalık bir araç&quot; 3 etiketleme koşullarında (reseptör ve 3 bölmelerin her biri) her 3 bağımsız Her bir replika ilaç durumu. </li><li> (-1) Her biri, her etiketleme durumda çoğaltmak için mahsup verim ile araçları çarpın. Her o çoğaltmak her ko değeri her etiketleme durumda çoğaltmak için ofset ekleyin. Not: Bu ortak kontrol durumu için ortalama ko ölçüsü her etiketleme durumunun her tekrarında 0 olacak şekilde veriyi normalleştirmek edecektir. </li><li> Her etiketleme durumunun her çoğaltır verileri Havuz. Not: ko değişiklikler artık çoğaltır genelinde analiz edilebilir. İstatistiksel analYsis deney tasarımı bağlı olacaktır ancak tipik bir analiz arasında varyans içerecektir (ANOVA) (örneğin, Tukey) uygun post-hoc testler takip etmektedir. İstatistiksel kaynakları için, 18, ​​örneğin bkz. </li></ol>

<ol>
	<li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors.">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li><li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications.">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li><li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors.">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li><li>Nagi, K., Pi&#241;eyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptor+signalling:+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance.">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).</li><li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors.">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li><li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic:+mechanisms+and+translational+implications.">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li><li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromerization+of+the+&#181;-+and+&#948;-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+&#181;-receptor+trafficking.">Heteromerization of the &#181;- and &#948;-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters &#181;-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li><li>Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells.">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li><li>Scherrer, G., Tryoen-T&#243;th, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo.">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li><li>He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+&#181;-opioid+receptor+activity+by+preventing+&#948;-opioid+receptor-mediated+codegradation.">Facilitation of &#181;-opioid receptor activity by preventing &#948;-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li><li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells.">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li><li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+morphine+treatment+alters+&#948;+opioid+receptor+post-internalization+trafficking.">Prolonged morphine treatment alters &#948; opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li><li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration.">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2012).</li><li>Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats.">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22 (2010).</li><li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates.">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook. , (2010).</li><li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies.">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners&#8217;+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners&#8217; guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Erişkin dorsal kök ganglion nöronlarının (birincil duyu nöronları) birincil kültürleri analizi için bu protokolü optimize ettik. Aynı zamanda, genel olarak tek tabaka kaplama kültürlenmiş hücreler için, az ya da hiç bir değişiklik, kullanılabilir. colocalizational analiz ancak ilaç tedavisi ve doku tespit / hazırlık bileşenleri uygun olmaz, aynı zamanda doku dilimleri ve benzeri hazırlıkları 11 mümkündür. Ilgi çekici olan, burada sunulan ICC yönte...

Reseptörler, özellikle de G protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler), rutin ve hücre yüzeyi 1, hücre içi kaçırılan. Bunlar karmaşık bir orkestra ve sıkı kontrol süreçleri hücrelerin mevcut reseptör tamamlar dikte ve reseptör zamansal aktivite, duyarsızlaştırma ve resensitization 2 düzenleyen - 4. Önemli olarak, bu işlemler, ilaca bağlı reseptör aktivitesi veya işlem de dahil olmak üzere, hücresel ortama duyarlı. Diğer bir deyişle, reseptörlerindeki ligandlannın etkimeleri ve böylece hücre yanıt değiştirmeden, bu reseptörlerin hücre içi değiştirebilir. Bu şekilde, bu dış ligandlar da klasik haberciye-to-efektör kaskadları 5,6 ötesinde, daha fazla etkiler, hücre fonksiyonu üzerinde yapılmamış gösterirler. Uyarılmış reseptör kaçakçılığı gibi değişiklikler incelenmesi zordur. Mevcut tüm teknikler sınırlamaları içerir. Biyotin koruma deneyleri moni için kullanılmıştırtor yüzeyi reseptörleri popülasyonları. Bu reseptörler, biyotinile edilmiş ve İmmüno bir timecourse zamanla biyotinile reseptörleri azalmayı ölçmek için gerçekleştirilir. Bu teknik, esas olarak reseptör 7 arasında bir başlangıç, etiketlenmiş, popülasyonda bozunmasını takip eder ve bu işlem zaman içerisinde inşa çok yararlıdır. Ne yazık ki, bu deney gibi içselleştirilmesi, geri dönüşüm, ya da yeni reseptörler olarak reseptörlerin, orijinal havuzun bozulması dışında herhangi bir işlem izlemek için değiştiremiyor. Ayrıca, 50kDa aralığında bir reseptöre 150kDa aralığında bir antikorunun ilavesi reseptörün kaçakçılığı 8,9 değiştirebilir ve bu teknik, düşük ekspresyon düzeyi reseptörleri ile kullanmak için zor olabilir. Diğer işlemler hücre içi ticareti bölmeleri (örneğin, endozomlar, vs.) belirlemek ve ilgi reseptörleri ile ko değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanırlar. Bu bizi içeririfade heterolog sistemlerde e reseptörleri ve bölme belirteçleri (örneğin, Rab-aile GTPases) kimerik yapıları floresan proteini etiketli. Bu potansiyel fiksasyon ve permeabilization ile ilgili konuları kaldırarak, canlı hücre görüntüleme kullanımını sağlar. Daha fizyolojik temsilci hücre tipleri ile davranış ve uyumsuzluk ticareti üzerindeki etiketi ve ifade seviyesi etkileri: Güçlü iken, böyle bir strateji heterolog genel sistemlerin aynı sınırlamalara muzdarip. Daha halk, boyalar kolaylıkla hücre içi bölmeleri etiketlemek için kullanılır (örneğin, lizozomlar, görünürde) 10. Boyalar, ancak özgüllüğü (lizozomlar için boyalar durumunda bütün asidik organeller) eksikliği ve diğer bölmeleri sayesinde ticaretini değerlendirmek yok. Yine de, bu teknikler, sistem ve deneysel koşullar üzerinde önemli bir kontrole olanak aşağıdaki burada sunulan ko analiz yöntemleri yararlanabilir. Metot WBurada mevcut e ko reseptör ticareti izleme geliştirir. Uygun belirteçleri etiket immünsitokimya (ICC) kullanarak, birden fazla farklı hücre içi bölmeleri tespit etmek mümkündür. Bu, aynı zamanda, heterolog sistemlerde yerine fizyolojik olarak-ilgili primer hücre kültürlerinde kullanımına izin verir. Bu ICC protokol etiketleme öncesi ilgi hücreleri tespit kapsar; Bu ilaç tedavisi (ler) itibaren belirli bir timepoint etiketleme izin verir. Bu, o zaman noktasında küresel reseptör bölmesi dernekleri bir &#39;anlık&#39; üretiyor. Birden timepoints ile kaçakçılık değişikliklerin bir timecourse da inşa edilebilir. Kısaca, hücreler, ilaç ile muamele edilmiş, reseptör ve ilgi duyulan hücre içi bölüm için etiketli, odaksal olarak görüntülü ve fotomikrografları matematiksel reseptör ve bölme 11 arasında ko ölçmek için analiz edilir. Bizim kullanımı, biz Ra ile bir reseptörün ko incelendiğindeb5, Rab11 ve membran protein 1 (LAMP1) Lizozomal ilişkili. Bu belirteçler, sırasıyla erken endozomlar, geri dönüşüm endozomlar ve lizozomları belirlemek. Bu ko önlemler içselleştirilmesi, geri dönüşüm ve yıkımı 12 kapsayıcı süreçler için vekiller olarak hareket ederler. Tüm teknikler ile olduğu gibi, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Nedeniyle her bireyin nöron analiz görüntüye ihtiyacı, bu tekniğin ilgili koşullar ve timepoints sayısına bağlı olarak oldukça emek-yoğun hale gelebilir. Tüm immün da fiksasyon ve permeabilization 13 neden hücresel ultrastrüktürün, protein lokalizasyonu ve epitop erişilebilirlik üzerindeki etkileri ile uğraşmak gerekir. Başlangıçta birincil duyu nöronlarının birincil kültürlerinde kullanılmak için optimize edilmiş olsa da, bu yöntem diğer tek tabaka kaplama kültürü modelleri genel olarak uyumludur. Bir matematiksel sayısal MEASUR kullanımıko e özellikle, çok daha metodolojik, genellikle bu tür görsel-kontrol çok kanallı bindirmeleri 14 olarak belirsiz, öznel ölçütlere yararlanmıştır reseptör kaçakçılığı değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan önceki tekniklere göre daha titiz olduğunu. Bu teknik, in vivo girişimler (önce primer kültür üretimi) ile geniş uyumluluk için özellikle yararlıdır, in vitro müdahaleler (kültür büyüme sırasında) ve çeşitli etiketleme 15 hedefler. Bu nedenle, çok sayıda farklı araştırma sorulara uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041-100G</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>720084</td><td></td></tr><tr><td>12 circle Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>1254580</td><td></td></tr><tr><td>Aqua/Poly-Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Polysciences</td><td>00380-1</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-DOR antibody</td><td>MyBioSource</td><td>MBS316175</td><td>Used at 1:1,500</td></tr><tr><td>Mouse anti-Rab5 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7904</td><td>Used at 1:750</td></tr><tr><td>Mouse anti-Rab11 antibody</td><td>Millipore</td><td>05-853</td><td>Used at 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-LAMP1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8098</td><td>Used at 1:750</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Used at 1:200 to 1:2,000</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11005</td><td>Used at 1:200 to 1:2,000</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11058</td><td>Used at 1:200 to 1:2,000</td></tr></tbody></table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Bu tekniği kullanarak, bu uzun süreli / kronik ve akut ilaç tedavileri hem Aşağıdaki reseptör sonrası içselleştirme kaçakçılığı değişiklikleri ölçmek mümkündür. İlaç tedavileri, fiksasyon ve etiketleme sonrasında, yüksek çözünürlüklü iki kanallı fotomikrografları ilgi her hücrenin yakalanır. Örnek görüntüler şekillere (Şekil 1) üretilmesi için, yanlış renk ko ile kombine edilebilir. Daha sonra colocalizational analizi, tarif edildiği gibi, hedef, hedef ko ...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis at JoVE.com

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Görüntüleme.  University of California Irvine.  Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar. 

Video: Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biyomühendislik

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. Currently, the characterization of novel drugs towards their interactions with &#946;-arrestins and other cytosolic proteins is extremely valuable in the field of GPCR drug discovery particularly during the study of GPCR biased agonism. Here, we show the application of a novel structural complementation assay to accurately monitor receptor-&#946;-arrestin interactions in real time living systems. This method is simple, accurate and can be easily extended to any GPCR of interest and also it has the advantage that it overcomes unspecific interactions due to the presence of a low expression promoter present in each vector system. This structural complementation assay provides key features that allow an accurate and precise monitoring of receptor-&#946;-arrestin interactions, making it suitable in the study of biased agonism of any GPCR system as well as GPCR c-terminus &#8216;phosphorylation codes&#8217; written by different GPCR-kinases (GRKs) and post-translational modifications of arrestins that stabilize or destabilize the receptor-&#946;-arrestin complex.

GPCR-&#946;-arrestin interactions are an emerging field in GPCR drug discovery. Accurate, precise and easy to set up methods are necessary to monitor such interactions in living systems. We show a structural complementation assay to monitor GPCR-&#946;-arrestin interactions in real time living cells, and it can be extended to any GPCR.

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Biyokimya

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biyoloji

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Nörobilim

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...