Biz kullanılan fare omurilik doku örnekleri sağlamak için Minnesota Üniversitesi Lee laboratuvarını teşekkür etmek istiyorum. Bu eser MB Randy Tıraş Makinesi Kanser Araştırma ve Toplum Fonu tarafından ve Minnesota Yumurtalık Kanseri Birliği (MOCA) MB&#39;ye göre, Savunma Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) MB OC093424 Bölümü tarafından desteklenmiştir. fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

1. Lizis Tampon hazırlanması <ol><li> Bir 2 M stok çözelti yapmak için deiyonize (Di) su içinde sükroz eritin. 0.22 um poliviniliden florit (PVDF), filtre çalıştırılan bir vakum kullanılarak sükroz 2M çözelti süzülür. </li><li> Anaerobik koşullar altında, bir 500 mM stok çözeltisi ve depolayın DI su içinde ditiyotreitol (DTT) içinde çözülür. 100 mM&#39;lik bir stok çözelti yapmak için DI su içinde magnezyum klorür (MgCI2) içinde çözülür. 50 mM stok çözelti yapmak için DI su içinde adenosin trifosfat (ATP), disodyum hidrat içinde çözülür. </li><li> DI su içinde Trizma hidroklorür eritilmesi ve sodyum hidroksit (NaOH) ile pH ayarlanarak pH 7.4&#39;te bir Tris çözelti hazırlayın. </li><li> 250 mM, 1 mM, 5 mM MgCl2 konsantrasyonu, 1 mM ATP konsantrasyonu ve 50 mM Tris konsantrasyonunun bir DTT konsantrasyonu bir sükroz konsantrasyonuna sahip bir parçalama tamponu yapmak DI su içinde stok çözeltileri bölümlerini birleştirmek . Örneğin, Tris, 50 535.3 ul karıştırınMgCl2 0 ul, 1.25 ml sükroz, DTT 20 ul ATP 200 ul ve Dİ su içinde 7,4947 mi liziz tamponu içinde 10 ml yapmak için. Bu, yaklaşık 20 deneyleri için de kullanılabilir. </li></ol> Deney 2. Kültürleme Hücreler <ol><li> DMEM +% 10, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), konik bir tüp içinde 30 ml aliko haline getirilmesi Ortamın. </li><li> Ilık su ile küçük bir behere sıvı azot depolama dondurulmuş M17 veya HeLa hücreleri aktarın. </li><li> 50 ml konik tüp hücreleri aktarın. İlk olarak, hücre flakon bazı medya ekleyebilirsiniz. Daha sonra eritme 5 saniye içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın. </li><li> Hücre topağı elde etmek için 5 dakika boyunca 450 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. T75 balona medya 20 ml ekleyin. </li><li> Emme kullanarak hücrelerden ortamı çıkarın. Hücre topağı ve tekrar süspansiyon taze ortam 5 ml. </li><li> T75 şişesi içinde ortam, 20 ml 5 ml hücre süspansiyonu aktarın ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. ChHer 3 günde bir ortam ange. </li></ol> 3. Hücre Hasat <ol><li> Hücreleri dokunmamaya dikkat ederek, emme yoluyla ortamı çıkarın. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) hücreleri yıkayın. Emme kullanarak PBS çıkarın. </li><li> T75 şişeye tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 3 ml ilave edilir ve 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Balona taze medya 6 ml ekleyin ve hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 5 dakika 290 × g 15 ml konik tüp ve santrifüj süspansiyon aktarın. </li><li> Süpernatantı ve PBS 5 ml ekleyin. Yavaşça pelet kırmaya tüpün alt dokunun. 5 dakika boyunca 290 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Adımı yineleyin 3.6 üç kez. </li><li> PBS çıkarın ve taze PBS 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Eppendorf tüp (1.5 mi) aktarın. 5 dakika boyunca 290 xg&#39;de Spin. </li></ol> 4. Hücre Liziz <ol><li> Bir pipet An kullanarak pelet yaklaşık hacmini ölçmek1 hacim oranı: Bir kütle cam boncuk tarttın d 1. Liziz tamponu içerisinde pelet iki hacim. Not: cam boncuk eklemeden önce tampon ekleyin. </li><li> Lyse soğuk bir odada vorteks ile 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca en fazla çalkalama ile Eppendorf tüpü içinde hücreleri. </li><li> 200 xg 30 saniye Santrifüj kısaca boncuk yerleşmek için. Süpernatant toplayın. </li><li> Süpernatana daha önce olduğu gibi cam boncuklar aynı hacimde ekleyin. </li><li> Bir kez daha fazla çalkalama ile 4 ° C&#39;de 30 dakika vorteksleyin. </li><li> 200 xg 30 saniye Santrifüj kısaca cam boncuk yerleşmek için. Süpernatant toplayın. </li><li> 5 dakika boyunca 5030 x g&#39;de santrifüj çekirdekleri, membranlar ve kesintisiz hücreleri çıkarmak için. Hücre lizatı olan süpernatant, toplayın. </li></ol> 5. Doku Homojenizasyon <ol><li> Lizis tamponu fare omurilik dokusu 9 çözeltisi: 1 hacmini: Bir kütle olun. Not: Bu yöntem, farklı bir dizi uygulanabilirent doku örnekleri. </li><li> Kalan hiçbir topakları olmadığından emin olmak için 30 saniye boyunca homojenleştirici üzerindeki seviye 2 bir ayarı kullanarak doku homojenize. </li><li> Çekirdekleri, membranlar ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için 3 dakika 5,030 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> Lizat olan süpernatant, toplayın. </li></ol> 6. Numune Türevlendirme <ol><li> Pierce BCA Protein Assay Kit protokolü tarafından belirtildiği gibi kolorimetrik 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak doku lizat proteini konsantrasyonunu belirlemek için bir 96 oyuklu plaka analizinde bisinkoninik asit (BCA) uygulayın. </li><li> Deiyonize (Di) su kullanılarak 50 ul toplam proteinin 20 ug tekabül eden bir kısım getirin. </li><li> Çözeltiye HA-UB-vinil sülfon (VS) 1.35 uM 2 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir. Bu, son reaksiyon karışımı içinde prob 50 nM lizat 20 ug ile sonuçlanır. Bu fonksiyonel DUBS etiketleme sağlamak için büyük molar fazladır. </li><li> Ben95 ° C&#39;de 5 dakika için Laemmli numune tamponu içinde örnek ncubate. 52 ul reaksiyon hacmi kullanımı 2x numune tamponu 26 ul, 4x numune tamponu 13 ul veya 6x numune tamponu 8.87 ul için. </li><li> Jel yüklemeden önce buz üzerinde soğutun. </li></ol> 7. Western Blot <ol><li> Hazırlanan numune 40 ul ile 12 oyuklu% 4-20 tris-glisin jel yük </li><li> Iyon ön dibe ulaşana kadar 95 V jel çalıştırın. </li><li> Bir polivinilidendiflorid (PVDF) membran üzerine jel bir gecede transferi gerçekleştirin. </li><li> Amido siyah leke membran inkübe ve her kulvarda protein miktarını gösteren bir görüntü elde etmek için membane tarayın. </li><li> Membran destain ve bloke etmek için 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 süt ile inkübe edilir. </li><li> 1 bir konsantrasyonda birincil bir anti-HA antikoru membran inkübe: ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında 4 saat süre ile, PBS içinde 10.000,% 5 süt. </li><li> F 3 yıkar gerçekleştirinya da% 0.1 Tween-20 deterjanı ile PBS içinde her biri 5 dakika. </li><li> 1 bir konsantrasyonda, bir fare yaban turbu peroksidazı membran inkübe: PBS içinde 10.000,% 5 süt en az 2 saat karıştırıldı. </li><li> % 0.1 Tween-20 deterjan ile, PBS içinde 5 dakika için her 3 yıkama yapın. </li><li> PBS içinde 5 dakika için 1 yıkama yapın. </li><li> 10 dakika boyunca, bir kemilüminesan tespit reajanı membran inkübe ve kemilüminesan bir detektörü kullanarak bulunması. Dedektör ayarı otomatik pozlama kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rol&#233;n, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-+based+ubiquitin-specific+(USP)+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells.">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li><li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination:+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome.">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li><li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes.">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li><li>Rol&#233;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines.">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li><li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family.">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li><li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Parkinson&#8217;s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1.">The effect of Parkinson&#8217;s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li><li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Amyloid+(A&#946;)+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1.">&#946;-Amyloid (A&#946;) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li><li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway.">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li><li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2.">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li><li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses.">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li><li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+&#945;-Synucleinopathy+In.">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of &#945;-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Ubikuitinasyon temel hücresel aktivite olduğundan, düzenleyici mekanizmaların anlaşılması hastalık ve patoloji süreçlerini ortaya çıkarılması için anahtar olabilir. HA kullanımı Burada rapor Ub türetilmiş aktif bölgeye yönelik sondalar Ub-aracılı protein parçalanmasını eğitimi için kolay, ama çok geçerli bir yöntem sağlar etiketledi. Bu yöntem daha hızlı ve daha az pahalı ayrı DUBS her biri eğitim fazladır. Cam boncuklar kullanılarak - Bu yöntemde, h?...

ubikitin-proteazom sistemi (UPS) memeli hücresinde ana degradasyon yollarının biri olarak hizmet eder. Proteazomdan bozulmaya gitmekte Dayanaklar kovalent ubikuitin (Ub) 1 polimerleri ile etiketlenmiş. Hedef alt-tabaka bozulması için proteazomu girer önce, poli-ubikitin etiketi çıkarılmalıdır. Enzimler (DUBS) deubiquitinating olarak bilinen bir enzimler sınıfı ubikitin moleküllerinin 2 çıkarılması ve geri dönüşüm için sorumludur. Bu hücrede 3 çalışan yaklaşık yüz seslendirmeler olduğu İnsan genomunun tahmin edilmiştir. Ub-aracılı hücresel süreçleri kontrol DUBS bu kadar büyük bir sayı ile, bu enzimleri okuyan, yalnızca ifade seviyeleri hakkında bilgi verir mRNA teknikleri aktivite ve batı blot hakkında bilgi vermeyin çünkü bir meydan okuma sunuyor. grip hemaglutinin (HA) kullanımı kovalent mod sağlayan aktif bölge yönlendirilmiş sondalar Ub türetilmiş, etiketliFonksiyonel takar ve bu yüzden de US-PS bir Batı lekesi 4, bu enzimlerin aktivitesinin doğrudan görselleştirme verir. Problar, aktif alan sistein kalıntısı 5 için bir intihar alt-tabaka olarak hizmet eden bir C-terminali tiol reaktif grup var. Bu problar ile, hücrenin her iki patolojik ve fizyolojik halleri altında birçok DUBS aktivitesini ve potansiyel ifade incelemek mümkündür. DUB aktivitesindeki değişiklikler, Parkinson, Alzheimer, anemi ve çeşitli kanserler gibi patolojik koşullar 6-10 aralığında implike edilmiştir. Bu teknik, hastalığın çalışma için güçlü bir araç sunar. Bu yazıda, biz cam boncuklar kullanılarak lize edilmiş HeLa ve M17 hücrelerinde bu tekniğin uygulanmasını gösterir. Ayrıca, fare omurilik doku örneklerinde bu yöntemi kullanmak nasıl özetlemektedir. Bu tekniği ile elde edilen bilgiler, tanımlanması için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilirterapötik hedefler ve farklı hastalık durumlarının çalışma için oluşturulması modelleri. Bu tekniğin gerçek yardımcı tek bir deneyde çok dubs bilgi sağlama yeteneğinde yatmaktadır.

<table><tbody><tr><td>PowerGen 125 (homogenizer)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-261-02P</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum-driven filters 0.22 &amp;micro;m</td><td></td><td>BPV2210</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads, acid washed &amp;le;106 &amp;micro;m (~140 U.S. sieve)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4649-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fischer Scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; w/ filter cup 250 ml 120/cs</td><td>Cellstar</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-UW0155-0025</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli&#039;s SDS-Sample Buffer (4x, reducing)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-110R</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples

ubikitin-proteazom sistemi son nörodejeneratif hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli patolojilerde rol oynar. Bunun ışığında, bu sistemin düzenleyici mekanizmasını incelemek için teknikler yukarıda belirtilen hastalıkların hücresel ve moleküler süreçleri açıklık için gereklidir. Bu yazıda belirtilen hemagglutinin türetilmiş ubikitin sondasının kullanımı bu sistemin çalışması için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yazıda enzim aktivitesini deubiquitinating doğrudan görselleştirme vermek tahlilleri yapmasını sağlayan bir yöntem ayrıntıları. Deubiquitinating enzimler proteozomal bozulmasını kontrol ve kullanıcı bir deneyde birden enzimlerin aktivitesini araştırmak için izin verir aktif siteler, fonksiyonel benzerlik paylaşıyoruz. Lizatlar yumuşak mekanik hücre bozulması yoluyla elde edilen ve aktif site yönelimli probları ile inkübe edilir. Inaktif enzimler ilişkisiz kalırken Fonksiyonel enzimler probları ile etiketlenmiş. Run byNing bu deney, kullanım etkinliği ve hızlı ve kolay bir şekilde birden fazla deubiquitinating enzimlerin potansiyel ekspresyon hem de ilgili bilgileri alır. Mevcut yöntem, insan hücresinde tahmin yüz deubiquitinating enzimler için tek tek antikorlar kullanılarak önemli ölçüde daha etkilidir.

Kültürlenmiş M17 ve HeLa hücreleri protokolü (3. Hücre Hasat) &#39;de ayrıntılı bir yöntem ve fare omurilik dokusu elde edildi kullanılarak hasat edilmiştir. Hücre peleti / omurilik dokusu reaktifi Hazırlama bölümünde açıklanan lizis tamponu ile bir tüp içine yerleştirilmiştir. Hücre topakları, bir homojenleştirici (Şekil 1B) kullanılarak homojenize edildi cam boncuk (Şekil 1A) ve fare omurilik dokusu numuneleri kullanılarak parçalanmıştır. Liziz veya h...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples at JoVE.com

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

method-for-measuring-activity-deubiquitinating-enzymes-cell-lines

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Görüntüleme.  University of Minnesota.  Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir. 

Video: Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Biyokimya

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biyoloji

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Her Yerde Bulunan, SUMOile Edilmiş ve ADP-Ribosile Edilmiş DNA-Protein Çapraz Bağlarının Ölçülmesi

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Yazar Spotlight: DNA Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nörogelişimsel Bozukluklarda DUB Varyantlarının Bölünme Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi