Name: applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors at JoVE.com

This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

NOT: hayvanlarla ilgili tüm protokoller Pennsylvania State Üniversitesi&#39;nden hayvan bakım yönergelerine uygun olarak takip edildi, IACUC # 44057 1. lentivirüs Üretimi Not: Transfeksiyondan bir önceki gün, LentiX-293 hücreleri,% 80 birleşme olmalıdır. <ol><li> Sadece transfeksiyondan önce DMEM ile hücrelerin durulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca penisilin (100 lU / ml) ve streptomisin (100 ug / ml) içeren DMEM /% 10 FBS, 10 ml inkübe edilir. </li><li> 1 dakika boyunca 1 DMEM ilave edildi ve girdap: 3 oranında (PEI 3 ul DNA 1 ug:) DNA ve polietilenimin (PEI), 1 (1 mg / ml) ile seyreltilir. DNA hacmi DNA konsantrasyonuna bağlıdır ilave edildi. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. <ol><li> Örneğin, çanak başına PEI 60 ul vektör plasmidinin 10 ug, psPax2 14 plazmidinin 5 ug, veziküler stomatit virüsü (VSV), 5 ug oluşan bir DNA plazmidi 20 ug kullanın. </li></ol></li><li&gt; 1 dakika boyunca karıştırın tekrar DNA ve PEI çözüm karıştırın. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> DMEM (100 mm tabak içinde 10 ml kültür ortamı için, yani, 1 ml) &#39;nin toplam kültür ortamının 1/10 hacim. Çanak içine damla DNA PEI karışımı damla 1 ml ekleyin ve kültür ortamı DNA ile iyi karıştırılmış olduğu için kadar etrafında çanak girdap. </li><li> Oda sıcaklığında 6 saat süreyle inkübe ve süpernatant kaldırmak. Kültür ortamının 5 ml. </li><li> Transfeksiyondan 48 saat sonra, 50 ml bir tüp içinde, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 627 x g&#39;de viral süpernatan ve spin toplar. Ultrasantrifüj işlemi tüp içine 0.45 um&#39;lik bir şırınga filtreden geçirilerek viral süpernatanın 30 ml filtre. </li><li> Tüpler dengelemek ve parafilm küçük bir parça ile tüpler kapsayacak şekilde steril su ekleyin. Spin tüpler 4 ° C&#39;de 120 dakika boyunca 11.249 x g&#39;de. Bir vakum ucu kullanarak sıvı çıkarın. </li><li> Soğuk PBS 100 ul tüp ekleyin. Yavaşça 4 ° CO / N tüp sallayın. </li><li> Virüs, pipet t yeniden askıyaO PBS ucu ile pelet dokunmamaya dikkat ederek, pelet 10 defadan fazla adım 1.8 ekledi. Bu tamamlanana kadar pelet yeniden süspansiyon haline edilmeyecektir. </li><li> -80 ° C sıvı nitrojen ve mağaza tüp, flaş-freeze başına 10-20 ul virüs kısım. </li></ol> 2. Stereotaktik Enjeksiyon Araçların 2.1) hazırlanması <ol><li> Ameliyat öncesi makas, künt uç forseps, bir iğne tutucu, neşter, pamuklu bir çift ve bir sterilizasyon göstergeli kapalı bir paket içinde bir bez ve otoklav yerleştirin. Ayrıca,% 10 povidon iyot,% 70 etil alkol, emilebilir sütürler, bir ısıtma yastığı, suni gözyaşı edinin cam boncuk sterilizatör, matkap, bir matkap ucu, 2 atılabilir şırınga, enjeksiyon şırınga, elektrikli tıraş makinesi, analjezik (ketoprofen), anestetik (avertin), eldiven ve enjeksiyon pompası ile stereotaktik aparatı. </li><li> 0.2-kullanılarak steril kaputu% 1.25 avertin taze çözüm o gün, filtre Yap# 181; steril şırınga filtresi m ve steril serum şişenin içine yerleştirin. Tert-amil alkol 5 ml 2,2,2-tribromoetil alkol 2.5 g karıştırın, daha sonra, 200 ml su içinde çözülür. 5. 15 altında pH&#39;ı tutun </li></ol> Fare 2.2) Hazırlanması <ol><li> Fare (375 mg / kg) &#39;nin ağırlığına göre avertin uygulayın. 15, bir karın içinden (İP) enjeksiyon yoluyla Avertin fare ile enjekte edilir, ve daha sonra tamamen anestezi kadar geri kafes içine yerleştirin. </li><li> IP enjeksiyonu (ketaprofen, 5 mg / kg), yer ve kurumasını önlemek için fare gözleri yapay gözyaşı yoluyla bir analjezik verin. </li><li> Fare onların ayak kısma tamamen uykuda olduğundan emin olun. Fare ayak tutam yanıt verirse, o zaman (50 ul dozlarda) daha anestetik verir. Elektrikli tıraş makinesi kullanarak fare kafasını tıraş. (Burnu üstüne, tipik kulakların hemen arkasından) ameliyat edilecek alanı ve çevredeki tıraş. </li><li> Fare i yerleştirinStereotaktik aparat nto. Anterior kelepçe üzerine ön dişler Mandal ve kelepçe düşürmek ve çene tamamen güvenli olduğunu böylece sıkın. </li><li> Tam kafa stabilize etmek kulak kanalına kulak çubukları yerleştirin. Iç kulak zarar verebilecek olan, çok kulak çubukları eklemek için dikkatli olun. Bitmiş kez fare vücut başının pozisyonunu bozmadan hafifçe taşınacak gerekir. </li><li> Prosedür boyunca farenin vücut ısısını düzenlemek için farenin altında bir ısıtma yastığı yerleştirin. </li><li> İyice cerrahi bölgeyi temizleyin. Bir pamuklu çubuk kullanarak, cerrahi sitenin ortasından başlayarak ve dışa doğru hareket, dairesel hareketlerle% 10 povidon iyot ovalayın. Ardından, aynı şekilde cerrahi sitede% 70 etil alkol ovmak bir pamuklu bir bez kullanın. İki kez tekrarlayın. </li></ol> 2.3) İlk Kesi <ol><li> Fare prepped sonra, steril ekipman çantayı açın. Değişim eldiven touchi öncealetleri ng. Steril bir bez çıkarıp bez üzerine aletleri yerleştirin. Herhangi bir enstrüman bir un-steril bir yüzey dokunursa, sterilize 15 saniye için cam boncuk sterilizatör kullanın. </li><li> Baskın olmayan el dominant el ve künt uçlu forseps neşter atın. Künt uç forseps yavaşça kavrama fare cilt kullanmak ve neşter kullanılarak bir kesi yapmak. Yaklaşık 1,5 cm (burun doğru) kulakların üstünde kesi başlayın ve kulakları altında yaklaşık 0.5 cm uzatmak. (Şekil 1) bregma maruz farenin kafasının ortasında aşağı dikey kesi uzatın. </li><li> Bregma görüntülenmiştir sonra, yavaşça kafatasının yüzeyini örten herhangi bir kan çıkarmak için steril pamuk ucu almak. Başın tarafa doğru cilt itmek için iki pamuk ipuçlarını kullanın. </li></ol> 2.4) Ekipman Kurulumu <ol><li> Herhangi bir Kan kafatasının yüzeyine kaldırılır ve açık bir şekilde görünür hale bregma sonra (con şırınga hazırlanması10 8 TU 1 ul / ml hacim) santrasyonu. Davlumbaz, virüs ile şırınga enjekte edilecek doldurun. Hiçbir kabarcıklar içinde olduğundan emin olun. Tam güvenli olduğundan emin olun, stereotaktik aparatı içinde şırınga yerleştirin. </li><li> Steril şırınga iğne ucu bregma kesiştiği ve interaural hattına ayarlanır böylece, doğru kafatasının yüzeyi üzerinde olduğu kadar yavaşça şırınga indirin. Sıfır olarak bu noktayı ayarlayın ve bu noktadan itibaren koordinatları belirler. </li><li> Ilgi beyin alanına bağlı olarak, stereotaktik koordinatlar değişir. Bir beyin atlası 4 kullanılarak bu koordinatları belirler. Koordinatlar belirlendikten sonra, bu koordinatları maç için şırınganın iğne taşımak. Koordinatları kullanarak dentat girus Hedef: = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm M / L. Delik delinmiş gereken yere görselleştirmek için kafatası üzerinde sağa iğne indirin. </li><li> Biraz şırıngayı kaldırın matkap almak ve matkap bi yerkafatasına yaklaşık 45 ° açıyla hedef matkap sitenin üstünde t hakkı. Sondaj başlayın ve kafatası yol verir kadar sondaj tutmak. Kafatası yol verdiğinde, direniş bir düşüş tespit edilebilir. Kortikal hasar görmesini önlemek amacıyla, beyne delmek için dikkatli olun. </li><li> Steril pamuk ucu alın ve delikten herhangi bir kan silin. </li><li> Ucu sağ beyin (değil kafatası) yüzeyinde oturur, böylece şırınga indiriniz. D / V beyin atlas koordinatlara göre, istenilen derinliğe Alt 0&#39;a şırınga (derinlik) koordinat ayarlayın. -1,79 Mm dentat girus, set D / V ulaşmak için. </li><li> 0.2 ul / dk&#39;lık bir hızda enjekte başlatın. Şırınga istenilen derinliğe daha düşük kayma olmadığından emin olmak için izleyin. Bu durum ortaya çıkarsa, yavaşça tekrar istenilen derinliğe şırınga yükseltmek. </li><li> Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, herhangi bir kalıntı virüs absorbe edildiğinden emin olmak için yaklaşık 2 dakika bekleyin. Yavaş yavaş şırınga yükseltmek ve herhangi li kaldırmak için bir pamuk ucu kullanınenjeksiyon yerinde sterlin. </li><li> Diğer yarımkürede için tekrarlayın. </li></ol> 2.5) Sütür <ol><li> Ambalajından ve kavrama iğne tutucular kullanılarak iğne steril dikiş ve iğne çıkarın. Uzak iğne tutucu iğne sivri kenarını Yüz. Baskın olmayan el künt uç forseps tutun ve fare üzerindeki kavrama cilt kullanabilirsiniz. Dominant elin ile başlayın. </li><li> Yavaşça deri yoluyla sütür itmek ve kesi diğer tarafında cilt kapmak için künt uçlu forseps kullanabilir. Yaklaşık 0.75 inç kalana kadar yoluyla sütür materyali çekin. </li><li> Iğne gidelim ve iğne tutucu bir anda etrafında dikiş sarmak için künt uçlu forseps kullanabilir, daha sonra, iğne tutucu ile 0.75 inç kalan dikiş kapmak ve aracılığıyla dikiş çekme iğne ve iğne tutucu, böylece Onlar aslında vardı ki o kafa karşısındaki tarafında sonunda. Bu bir düğüm oluşturmalıdır. </li><li> Bu adımı yineleyinÜç kez daha, başın yan alternatif iğne tutucu, her zaman biter. </li><li> Sütür kesin ve adımları tekrarlayın 2.5.1-2.5.3 kesi kapanana kadar. </li></ol> 2.6) Post-operatif Bakım <ol><li> Yavaşça fare kulak çubukları kaldırmak ve ön kelepçe onun çenesini kaldırın. </li><li> O uyanır ve kendi etrafında hareket edinceye kadar ısıtma yastığı fare tutun. Günlük fare izleyin ve tutmak ve bu, damat yeme ya da içme olarak değil ağrı belirtileri, göz dışarı. Gerekli görüldüğünde ek analjezik verin. </li></ol> 3. Açık Saha Testi 3.1) Kurma <ol><li> 50 cm yüksekliğinde duvarlarla, boyutları 50 cm x 50 cm boş bir kare, plastik arenada edinin (ama biraz daha büyük olabilir). Deney başlamadan önce,% 70 etil alkol ile arena temizleyin. Etil alkol tamamen arenaya fare yerleştirmeden önce kuru olduğundan emin olun. </li><li> Üzerinde arena yerleştirinZemin ve aydınlatma gölgeler ve parlamayı en aza indirmek için ayarlandığından emin olmak için deneyin. </li><li> Izleme yazılımı kullanıyorsanız, (fare net bir görünümü var yeterince uzakta tam kapsayacak şekilde bütün arenada, ama yeterince yakın), açık alan doğrudan havai açık alanda üzerinde yaklaşık 1,5 ft kamerayı yerleştirin. </li><li> Kutu (30 cm x 30 cm yaklaşık bir alan) merkezinde bir bölge oluşturun. 16, bir dilimini ayarlamak yan paneldeki bölge 1 sekmesine tıklayın. <ol><li> Üst panelinde bir şekil anahat seçin ve merkez bölgenin çevresini özetlemektedir. Bölge eklemek seçin ve merkez bölgesi iç tıklayınız. Program istemleri kullanarak (bu prosedür için &#39;merkezi&#39; olarak anılacaktır) bölge adlandırın. Davranışsal deney elle atılır ise, alanın alt bandı kullanılarak işaretlenmiş, 10 cm x 10 cm kareler ayrılmıştır emin olun. </li></ol></li><li> Yazılımı kurmak, böylece ayarlarının doğru ve fare kolayca visi olduğunuEkranda ble. Test arena (aydınlatma) ve fare rengi ile uyumlu olacak şekilde makine üzerinde algılama ayarları yaparak bu başarmak. NOT: ayarları doğru olduğunda, sistem herhangi bir gölge veya idrar / dışkı sadece fare izlemek ve olmamalıdır. Belirli yazılım ayarları arena aydınlatma ve fare rengine bağlıdır. </li></ol> 3.2) Acclimation ve Test <ol><li> Çevrelerine onları gelmesini amacıyla test öncesi davranışsal oda 1 saat içine deneysel fareler taşıyın. Iklimlendirme için kendi kafesine fareler bırakın. </li><li> Teybe kameraya davranışsal görev açın ve fare duvara bakacak şekilde arena orta önüne doğru fareyi yerleştirin. </li><li> 5 dakika boyunca zamanlayıcıyı ayarlayın ve uzak arenada adım. Mümkünse yanlışlıkla fare etkilemediği şekilde, odadan. </li><li> 5 dk kadar olduğunda, fare kaldırmak ve onların kafese koyun. </li><li> İyice bir sonraki fare geçmeden önce alanı temizlemek için% 70 etil alkol kullanın. Etil alkol tamamen kuruduktan emin olun. </li></ol> 3.3) Puanlama <ol><li> Dört pençeleri orta 30 cm x 30 cm içeride olduğunda alanın ortasında varlık olarak fareyi düşünün. </li><li> Fare merkezinde geçirdiği süreyi ölçmek. Alternatif olarak, bu kez (örneğin Noldus ethovison gibi) izleme yazılımı kullanarak belirler. <ol><li> Bunu yapmak için, analiz sekmesine gidin ve analiz profilleri altındaki &quot;hareketi&quot; üzerine tıklayın. Şu anda belirlenen kategoriler silin ve sonra konum sekmesi altında &quot;bölgesinde&quot; seçeneğini seçin. Merkez dilimini seçin. Sonra, sonuçlarını görüntülemek için (sonuç sekmesi altında) &quot;analiz çıkışını&quot; seçeneğini seçin. Her deneme görünmelidir zaman listeleyen bir tablo hareketsiz geçirdi. </li></ol></li><li> Aksi takdirde, elle OFT puan. açık alan ope altındaki ana hatları 25, 10 cm x 10 cm&#39;lik kareler olmalıdırn alan (as adım 3.1.3 belirtilen). Fare arena merkezi haline girişlerin sayısına ek olarak, merkezde geçirdiği süreyi ölçmek. 16 NOT: Merkez 30 cm x 30 cm alan açık alanda merkezi olarak kabul edilir. Bir fare dört pençeleri 30 x 30 cm alanı içinde ise merkez bölgesini yaşayan olarak kabul edilir. </li></ol> 4. Zorla Swim Testi NOT: davranışsal görevleri arasında beş gün en az bekleyin. 4.1) Kurma <ol><li> 2 L açık kova edinin ve 22 ° C su ile doldurun. Bir masanın üzerine kova yerleştirin ve aydınlatma gölgeler ve parlamayı en aza indirmek için ayarlandığından emin olmak için deneyin. </li><li> Izleme yazılımı kullanıyorsanız, doğrudan havai kepçenin kamerayı yerleştirin. </li><li> Yazılımı kurmak fare ekranda kolayca görülebilir şekilde. </li></ol> 4.2) Acclimation ve Test <ol><li> Davranışsal ro içine deneysel fareler TaşıTestten önce om 1 saat çevresi ile uyum sağlamaya. Iklimlendirme için kendi kafesine fareler bırakın. </li><li> Teybe kamera davranışsal görev açın. Yavaşça su kepçenin ortasında fare. Fareyi düşürmemeye dikkat edin. Yavaş yavaş fare düşürmek, ön ayakları ilk suya değecek şekilde. Daldırarak kendi kafasını önlemek için özen gösterin. </li><li> 6 dakika zamanlayıcı ayarlayın ve davranışsal alandan uzaklaşın. </li><li> 6 dakika kadar olduğunda, kova fareyi kaldırmak ve onların kafesine geri fare yerleştirmeden önce aşırı su silin. </li></ol> 4.3) Puanlama <ol><li> Yüzme vs yüzen zaman ölçmek için, (bu varsayılan ayar olmalı) Noldus tarafından önerilen izleme yazılımı kullanıyorsanız,% 11 oranında hareketsizliği ayarlayın. </li><li> Izleme sistemi kullanarak ölçmek için, analiz sekmesine gidin ve analiz profilleri altında hareket tıklayınız. Üzerine, şu anda ayarlanmış kategoriler silin ve sonra hareketlilik durumunu seçin(bireysel davranış altında) sol yan panel. % 11 hareketsizlik ayarlayın. </li><li> Sonuçlar sekmesinin altında, parça görselleştirme seçin. Sonuçları görmek için (sonuç sekmesi altında) analiz çıkışını seçin. Her deneme görünmelidir zaman listeleyen bir tablo hareketsiz geçirdi. </li><li> El puanlama, fare, fare hareketsiz geçirdiği zamanın yüzme veya tırmanma ve miktarı harcıyor zamanı ölçmek. Buna ek olarak, ilk kez hareketsiz ila gecikme ölçmek. Sonuçlar Bölüm Şekil 2&#39;ye bakınız. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-transgenic+mouse+strain+for+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells.">A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).</li><li>Hirrlinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-cre+complementation+indicates+coincident+activity+of+different+genes+in+vivo.">Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo.</a> PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).</li><li>Fenno, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+with+single+vectors+using+multiple-feature+Boolean+logic.">Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic.</a> Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mood+and+anxiety+related+phenotypes+in+mice:+the+open+field+test.">Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test.</a> Humana Press. 42, 1-20 (2009).</li><li>Denenberg, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-field+behavior+in+the+rat:+W.0hat+does+it+mean.">Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).</li><li>Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D&#8217;Anci, K. E., Renshaw, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+behavior+in+the+forced+swim+test.">Factors influencing behavior in the forced swim test.</a> Physiology &amp; Behavior. 118, 227-239 (2013).</li><li>Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+despair+in+rats:+A+new+model+sensitive+to+antidepressant+treatments.">Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments.</a> European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).</li><li>Hunsberger, J., Dunman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+depression-like+and+anxiety-like+behavior.">Animal models for depression-like and anxiety-like behavior.</a> Nature Protocol Exchange. , (2007).</li><li>Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+knockdown+in+the+brain+using+viral-mediated+RNA+interference.">Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta/beta-catenin+signaling.">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).</li><li>Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+5-HT1B+receptor+in+dorsal+raphe+nucleus+using+herpes+simplex+virus+gene+transfer,+increases+anxiety+behavior+after+inescapable+stress.">Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress.</a> Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).</li><li>Tasan, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+and+basolateral+amygdala+are+critical+sites+of+neuropeptide+Y/Y2+receptor-mediated+regulation+of+anxiety+and+depression.">The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).</li><li>Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetizing+mice.">Anesthetizing mice.</a> Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).</li><li>Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EJC+factor+RBM8a+regulates+anxiety+behaviors.">An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors.</a> Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).</li><li>Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+rodent+survival+surgery.">Guidelines for rodent survival surgery.</a> Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).</li><li>Wahlsten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+ready+for+testing.+Mouse+Behavioral+Testing:+How+to+use+mice+in+behavioral+neuroscience.">Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience.</a> Academic Press. , 133-141 (2011).</li><li>Kheirbek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+control+of+learning+and+anxiety+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+dentate+gyrus.">Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus.</a> Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).</li><li>Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+hippocampal+neurogenesis+buffers+stress+responses+and+depressive+behaviors.">Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors.</a> Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).</li><li>Sik-Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuronal+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+cAMP+in+the+dentate+gyrus+of+the+hippocampus+is+required+for+antidepressant-like+behaviors.">Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).</li><li>Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+by+retrovirus+vectors+occurs+only+in+cells+that+are+actively+replicating+at+the+time+of+infection.">Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).</li><li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Başarılı stereotaktik enjeksiyonları üç faktöre dayanır: iğne (uç, canlı fare tutmak (bregma kesiştiği ve interaural hat üzerinde iğne ucu) koordinatları için doğru sıfır noktası ayarlama ve sıfır noktasına doğru derinlik ayarı Sadece) beyin dokusu dış dokunmadan. farelerin canlılığı önemlidir. Cerrahi hayatta kalma fare düzgün anestezi ve yeterli analjezik aldığı olduğundan emin yaparak destekli edilebilir. Ağrı ameliyat sonrası zayıf kazanımı önemli bir nedeni olduğu bili...

Bu genetik olarak manipüle edilmesi kolaydır, çünkü fare yaygın nörobiyolojisinde kullanılmıştır. Gen nakavt teknikleri her genetik faktör fare davranışlarını nasıl şekillendirdiğini araştırmacılar araştırmak için izin verir. Ayrıca, CRE-loxP sistemi doku için değerli bir araç sağlar ve farklı dokular içindeki gen fonksiyonu çalışma için araştırmacılar sağlar farelerde tip spesifik gen nakavt, Celi. 1 Bununla birlikte, uygulamada, CRE promoterlerin ekspresyon modelleri kontrol edilmesi zor olan ve bugüne kadar birçok kurulan CRE sürücüleri bölgeye özgü ifadesini elde değil. 2,3 Seçenek olarak ise, stereotaktik enjeksiyon yetişkin fare spesifik beyin bölgeleri hedef alan bir yöntemdir. CDNA veya shRNA eksprese genetik mühendisliği virüsleri enjekte ederek, gen ekspresyonunun bölgeye özgü modülasyonu elde edilebilir. Her bir farenin beyni boyutu değişir, ancak spesifik beyin bölgelerinde yer stereotaktik Coordi kullanılarak belirlenebilirkalça fare beyin kafatası üzerinde simgesel ayarlayın. En sık kullanılan görülecek Bregma, lambda ve interaural çizgi vardır. Beyin atlas elde edilen koordinatları kullanarak, her bir beyin bölgesinden 4 tam konumu antero-posterior (A / P), medyal lateral (M / L) ile tespit edilebilir, ve dorsal-ventral (D / V) &#39;den eksenleri Bregma / interaural hat kavşak. Enjeksiyonlar floresan mikroskobu ile teyit edilebilir ve böylece Tipik farelerin beyinlerinde enjekte virüsler ya kırmızı ya da yeşil floresan protein (RFP veya GFP) ile etiketlenmiş. Farelerin Davranış değerlendirmeler psikiyatrik bozuklukların temel araştırma için özellikle gereklidir. Hastalarda psikiyatrik bozuklukların belirtileri genellikle anormal davranışları içerir. Bu insan davranışlarının bazıları evrimsel olarak korunmuş olan ve doğrudan taklit ve farede gözlenebilir. Örneğin, depresyon, davranışsal umutsuzluk ölçerek fare örnek alınabilir. Sık sık depresyon olan kişilerHiç yardımcı olacaktır yapmak bir şey sanki tr, sonunda intihara yol açabilir belirti hissediyorum. Kemirgenler, bu suyun bir havuzda yüzen karşı yüzme fare (vazgeçerek olarak görülüyor) süreyi ölçen Zorla Swim Testi (FST) kullanılarak modellenebilir. Bu paradigma, anti-depresanlar ile fenotip tahlisiye tarafından onaylanmıştır. Tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız hareketsiz anti-depresanlar almış 7,8,9 Fare. Başka bir davranış testi, Açık Alan Testi (OFT) farelerde lokomosyon değerlendirmek için tasarlanmıştır ve ayrıca farelerde endişeli fenotip analiz etmek için de kullanılabilir. 5,6 Bu test de yakın zaman fareler daha güvenli hissediyorum önermesine dayanır Bir roman açık alanda duvara. Onlar meraklı hayvanlar vahşi tip fareler sonunda, yeni bir ortam araştıracaktır. Ancak, alanın merkezinde daha az zaman harcama fare geçirme girişimlerini aşmak mümkün olmayacaktır olarak, fare anksiyete gösterirl korku yeni bir ortama getirdiği. Açık alanın merkezinde kaldığı zaman miktarı ile belirlenir olarak fare anksiyete, birçok psikiyatrik bozukluklarda mevcut olduğu, insanlarda klinik anksiyete, karşılaştırılabilir. Davranış paradigmaları stereotaktik enjeksiyon kombinasyonu hedef beyin alanında, belirli bir genin ekspresyonunu değiştirmek için yeni bir yöntemdir. Fare davranışlar üzerinde modüle edilmiş gen ekspresyonu etkisi daha sonra tespit edilebilir. Tüm beyin nakavt aksine, bu yöntem, yalnızca spesifik beyin alanları hedef olarak özellikle yararlıdır. Buna ek olarak, stereotaktik enjeksiyon, tipik olarak, yetişkin vahşi tip fare gerçekleştirilir, bu nedenle, endojen gen ekspresyonu gelişim aşamalarında içinde muhafaza edilmiştir. Gen gelişim embriyonik veya postnatal aşamasında hayatta kalmak için gerekli ise bu yöntem şaşırtmak etkisini önlemek olacaktır. Bir büyük sınırlama deneysel fareler Throug gitmek gerekir olduğunuH farelerin kafatası sahip olduğu bir invaziv cerrahi, açılacak. Ayrıca, gen modülasyon derecesi virüsün titresi ve verimlilik ile belirlenir. Virüs özel aletler gerektirir stereotaktik koordinatları kullanarak doğru bölgeye enjekte edilmesi gerekmektedir. Doğru enjeksiyon yerinde doğrulanması sadece otopsi tamamlanabilir. Bu yöntem, daha önce çeşitli nörolojik hastalıklarda spesifik bir genin katılımını test etmek için kullanılmıştır. Örneğin, virüslerin aracılık ettiği bir RNAi (dopamin sentezlenebilir sağlar) Th genini hedef substantia nigra compacta&#39;da enjekte edildi ve lokomotor davranışını analizi yapılmıştır. Bir başka çalışmada 10 ile ilgili olarak, fare davranışını değerlendirmek için bir lentivirüs susturulması DISC1 stereotaktik enjeksiyon kullanılan şizofreniye. DISC1 demonte yenilik tepki olarak artan hareketin neden (paralellikler şizofrenide pozitif belirtiler) ve daha fazla hareketsizlikFST. 11 Benzer bir şekilde, ek bir çalışma, 5-HT1B aşın dışa vurum, OFT artmış büzülmesi için bu yöntemi kullanan bir anti-anksiyete fenotipi ile tutarlı neden olduğunu buldu. 12 Stereotaksik enjeksiyonlar CRE-loxP farelerde rekombinasyonu azaltmak için cre virüsü sağlayabilir . Bu yöntem, selektif amigdala Y2 reseptörü ve stria terminalisin yatak çekirdeği silmek için kullanılmıştır. Davranış analizi üzerine, bu fareler gen merkezi amigdala silindi bir anti-depresif fenotip bulundu, ancak bulundu gen bazolateral amigdala veya stria terminalisin yatak çekirdeğinde silinmiş hiçbir fenotip. 13 Böylece, bu tekniği Hayvan davranışları üzerinde genetik etkisini araştırmak için benzersiz bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>Stereotactic Apparatus item 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential stereotaxic pump&amp;nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Injection Styringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Blunt end forceps</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td><td>with pedal</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Inotech&amp;nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable sutures&amp;nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Absorbable, reverse cutting</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Disposable syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves&amp;nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin or other anesthetic</td><td>see recipe citation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen or other analgesic</td><td>see veternarian&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Tracking Camera</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors

Stereotaktik enjeksiyon farelerde hedeflenen beyin bölgelerine yüksek titre lentiviruses sunmak için yararlı bir tekniktir. Lentivirüsler aşırı ifade eden ya da beyin dokusuna önemli bir zarar vermeden, nispeten odaklanmış bölgede demonte gen ekspresyonu ya. İyileştikten sonra, enjekte edilen fare gibi Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi çeşitli davranışsal görevler üzerinde test edilebilir. OFT fare bir roman açık alanda merkezinde geçirdiği süreyi ölçerek farelerde hareketlilik ve endişeli fenotip değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bir daha endişeli fare kontrollere göre yeni alanın ortasında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız. FST bir kova su içine yerleştirildiğinde fareler hareketsiz harcamak süreyi miktarının anti-depresif fenotip değerlendiriyor. Bir anti-depresif bir fenotipe sahip bir fare kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman hareketsiz geçirecek. Bu protokolün amacı, ster kullanmaktırdavranış testleri ile birlikte bir lentivirüs eotactic enjeksiyon hayvan davranışlarını modüle nasıl genetik faktörler değerlendirmek için.

<html> Doğru stereotaktik enjeksiyon doğru koordinatları ayarı dayanır. virüs enjekte etmek için kullanılan iğnenin ucu bregma kesiştiği ve interaural hat (Şekil 1) doğrudan ayarlanması gerekir. Bu iğne doğru yerleştirilmiş olup olmadığını belirlemek için bir stereomikroskopta kullanmak yararlı olur. Mikroskop ile bakıldığında virüsü enjekte edildi, bu bregma kesiştiği interaural hat üzerinde doğrudan toprak olacaktır, böylece iğne konumlandırılmalıdır. Bu şırı...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors at JoVE.com

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Lentivirüsler cDNA&#39;larını ifade eden ya da shRNAs farelerde spesifik beyin bölgelerinde gen ifadesini modüle edebilen stereotaktik enjeksiyon. Burada, biz Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi davranışsal görevleri ile stereotaktik enjeksiyon birleştirmek için bir protokol mevcut.

Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

14.1K Görüntüleme.  The Pennsylvania State University.  Lentivirüsler cDNA'larını ifade eden ya da shRNAs farelerde spesifik beyin bölgelerinde gen ifadesini modüle edebilen stereotaktik enjeksiyon. Burada, biz Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi davranışsal görevleri ile stereotaktik enjeksiyon birleştirmek için bir protokol mevcut. 

Video: Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Davranış

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

Cre Recombinase Kokain Klima yeri tercihi Hedef Genlerin Rolü Eğitim için ifade Viral Vektörler stereotaksik Mikroenjeksiyon

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Kemirgen Beyin Mikroenjeksiyon Moleküler Alt Tabakalar Motive Davranış Eğitim için

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

İntrakraniyal Enjeksiyon ve Manyetik Rezonans Görüntüleme Ile Beyin Metastazlarının Modellenmesi

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Kanser Araştırmaları

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Nörobilim

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain regions still presents a challenge, particularly when targeting brain structures along the midline. These challenges include avoiding of the superior sagittal sinus and third ventricle and the ability to consistently target selective and discrete brain nuclei. In addition, more advanced neuroscience techniques (e.g., optogenetics, fiber photometry, and two-photon imaging) rely on targeted implantation of significant hardware to the brain, and spatial limitations are a common hindrance. Presented here is a modifiable protocol for stereotactic targeting of rodent brain structures using an angled coronal approach. It can be adapted to 1) mouse or rat models, 2) various neuroscience techniques, and 3) multiple brain regions. As a representative example, it includes the calculation of stereotactic coordinates for targeting of the mouse hypothalamic ventromedial nucleus (VMN) for an optogenetic inhibition experiment. This procedure begins with the bilateral microinjection of an adeno-associated virus (AAV) encoding a light-sensitive chloride channel (SwiChR++) to a Cre-dependent mouse model, followed by the angled bilateral implantation of fiberoptic cannulae. Using this approach, findings show that activation of a subset of VMN neurons is required for intact glucose counterregulatory responses to insulin-induced hypoglycemia.

Described here is a stereotactic procedure that can target challenging and difficult-to-reach brain regions (due to spatial limitations) using an angled coronal approach. This protocol is adaptable to both mouse and rat models and can be applied to diverse neuroscientific applications, including cannula implantation and microinjections of viral constructs.

Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Affected brain areas display intraneuronal fibrillar inclusions consisting mainly of alpha-synuclein (asyn) proteins. No animal model thus far has recapitulated all characteristics of this disease. Here, we describe the use of stereotaxic injection to deliver chemicals, proteins, or viral vectors intracranially in order to mimic various aspects of PD. These methods are well-established and widely used throughout the PD field. Stereotaxic injections are incredibly flexible; they can be adjusted in concentration, age of animal used for injection, brain area targeted and in animal species used. Combinations of substances allow for rapid variations to assess treatments or alter severity of the pathology or behavioral deficits. By injecting toxins into the brain, we can mimic inflammation and/or a severe loss of dopaminergic neurons resulting in substantial motor phenotypes. Viral vectors can be used to transduce cells to mimic genetic or mechanistic aspects. Preformed fibrillar asyn injections best recapitulate the progressive phenotype over an extended period of time. Once these methods are established, it can be economical to generate a new model compared to creating a new transgenic line. However, this method is labor intensive as it requires 30 minutes to four hours per animal depending on the model used. Each animal will have a slightly different targeting and therefore create a diverse cohort which on one hand can be challenging to interpret results from; on the other hand, help mimic a more realistic diversity found in patients. Mistargeted animals can be identified using behavioral or imaging readouts, or only after being sacrificed leading to smallercohort size after the study has already been concluded. Overall, this method is a rudimentary but effective way to assess a diverse set of PD aspects.

We describe how to successfully inject solutions into specific brain areas of rodents using a stereotaxic frame. This survival surgery is a well-established method used to mimic various aspects of Parkinson's disease.

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in ...

Farelerde Stereotaksik Mikroenjeksiyon Doğruluğunu Optimize Etme

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

Yazar Spotlight: Stereotaksik Enjeksiyon ve Uygun Maliyetli Boyalar Yoluyla Farelerde Bilişsel Bozukluk Araştırmalarının Hızlandırılması

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.

Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...