Bu yöntemin amacı, uzak beyin bölgelerinden gelen uzun menzilli girdilerin fonksiyonel bağlantısını beyin dilimlerinde fotostimülasyon kullanarak belirlemektir. Işığa duyarlı iyon kanallarının çeşitli aracılı ekspresyonu için belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik hedeflemesi, o bölgeden gelen aksonun ışıkla seçici uyarılmasını sağlar. Prosedürü gösteren Louis Richevaux, benim grup bir doktora öğrencisi olacaktır.
Ameliyattan önce, hayvanın ayak parmak çimdikiyle iyi anons edilebiyi doğrulayın. Yavaşça nefes kolaylaştırmak için dilini çekin. Sonra, kafatası nın saçlarını tıraş edin.
Yerel anestezi için baş deri altına 20 mikrolitre lidokain hidroklorür enjekte edin ve beş dakika bekleyin. Kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisini kes. Sonra, stereotaksik bir çerçeve içinde hayvan yerleştirin.
Kulak çubukları yerleştirin ve kemiklerin üzerinde hafifçe kulaklara rostral onları dinlenme ve kafatası iyi erişim oluşturmak için deri aşağı çekin. Kulak çubuklarını sıkın ve burun parçasını töşeyin. Boy ayarlı bir destek kullanarak hayvanın vücudunu yatay olarak ve baş seviyesinde koruyun.
Fizyolojik sıcaklıkta tutmak için hayvanın altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Daha sonra yumuşak doku kaldırmak için bir pamuk lu bez ile% 0.9 sodyum klorür uygulayarak kafatası temizleyin. Kafatasını, bregma lambda erişiminin tesviye edilebilmiş olması için ayarlayın.
Daha sonra, posterior ve medial koordinatlarına göre kafatasındaki enjeksiyon bölgesini bulun ve enjeksiyon iğnesini üzerine yerleştirin. Kafatasını tek kullanımlık bir iğneyle işaretle. Daha sonra, dört santimetre yukarı enjeksiyon iğnesi taşıyın.
0,5 milimetrelik çapak kullanarak, maksimum hızın yarısı işareti üzerinde bir milimetre çapında kraniyotomi oluşturun. Herhangi bir kanama oluşursa bir doku ile swab. Sonra, tamamen bir pompa ile çıkararak depolama için Hamilton şırınga bulunan su boşaltın.
Sadece iğne suyla dolu. Buza enjekte edilecek viral çözeltiyi eritin, sonra, kısa bir süre buzdan çıkarın ve mikropipetle çözeltinin 700 nanolitresini elde edin. Sonra, parafin filminin bir parçasına bir damla yatır.
Parafin filmini kraniyotominin üstüne yerleştirin. Anteroposterior ve lateral pozisyon değiştirmeden viral çözelti damla iğne Dalma. Daha sonra, parafin film viral çözelti yaklaşık 500 nanolitre ile şırınga doldurmak için pompanın geri çekme işlevini kullanın.
Bu işlemi stereoskop altında gerçekleştirin, düşüşün kayboluşünü izleyin ve hava yıkmayın. Şırınganın doğru doldurulduğundan emin olun. Küçük bir sıvı damlasını çıkarmak için pistonun aşağısına inerek fırlatma sistemini test edin.
Daha sonra, seçilen derinliğe beyne iğne ekleyin. Enjeksiyon için çalıştır düğmesine basın. Sonra, yavaş yavaş 3-5 dakika içinde iğne çekin.
Tıkanmasını önlemek için iğneyi hemen temiz distile suda birkaç kez doldurarak yıkayın. Daha sonra, stereotaksik çerçeve hayvan çıkarın. Sütür deri ve 2-1-1 standart cerrahi düğüm ile bağlı üç veya dört dikiş olun.
Beyin ayıklamak için, boyundan buruna deri üzerinde bir kesim yapmak, sonra makas ile kafatasından son omur bölüm. Deri geri çekin ve kaudal yönden orta hat boyunca kafatası kesti. Parietal kemiği ve frontal kemiğin kaudal kısmını dikkatlice çıkarın.
Beyin ve kranial zemin arasına yerleştirerek küçük bir yuvarlak spatula ile beyin ayıklayın, koku ampul bölümleme, optik sinir, ve diğer kranial sinirler ve beyincik. Beyni yavaşça buz gibi kesme solüsyonuna batırın. Daha sonra, bir filtre kağıdına beyin transferi ve yavaşça kortikal yüzeykuru.
Yatay beyin dilimlerini kesmek için beyin korteksini, kaudal tarafı bıçakla bakacak şekilde bir vibratomun numune tutucusuna yapıştırın. Daha sonra, kesme odasını buz gibi oksijenli kesme çözeltisi ile doldurun, böylece beyin tamamen batırılmış olur. Bölüm 300 mikrometre kalınlığında, bir milimetre genliğinde saniyede 07 milimetre hızda vibratom ile dilimler.
Bu aşamada, floresan el feneri ve ilgili filtre gözlükleri kullanarak talamusta chronos-GFP ifadesini kısaca kontrol etmek önerilir. Tüm hücreli yama-kıskaç kaydı nı gerçekleştirmek için, hipokampal kompleksi içeren bir beyin dilimini yavaşça kayıt odasına aktarın. Kayıt odasını dakikada 2-3 mililitre karbogen ile kabardırılmış 34 santigrat derece ACSF ile sürekli olarak perfit.
4X büyütmede mavi LED aydınlatma ile ilgi bölgesindeki akson terminallerinde Chronos-GFP ifadesini kısaca inceleyin. 63X daldırma hedefine değiştirin ve odağı ayarlayın. Chronos-GFP ifade aksonları kontrol edin ve yama kaydı için bir piramidal nöron seçin.
Daha sonra, potasyum glukonat bazlı iç çözelti ile bir pipet doldurun. Baş sahnede pipet tutucuya monte edin. Hücreyi voltaj kıskacı konfigürasyonunda yama.
Tanımlanan nörona yaklaşın ve pipet ucunu soma üzerine hassas bir şekilde bastırın. Pozitif basınç membran yüzeyinde bir gamze üretmelidir. Sonra, bir gigoom mühür oluşturmak için basınç bırakın.
Mühürlendikten sonra, tutma gerilimini eksi 65 milivolta ayarlayın. Negatif basınç keskin bir darbe ile membran break. Tüm hücreli akım kelepçe modunda nöronun hiperpolarize ve depolarize akım basamaklarına tepkilerini kaydedin.
Chronos ifade afferent liflerin 475 nanometre LED tüm alan stimülasyonu akım veya voltaj kıskaç postsinaptik yanıtları kayıt. 20 hertz iki milisaniye lik süre on uyarım trenler ile uyarın. Hiperpolarizasyon ve depolarize akım basamaklarına yanıt olarak üçüncü tabakadaki presubiküler nöronların aktivitesi tüm hücre yama-kıskaç konfigürasyonunda kaydedildi.
Chronos-GFP'yi ifade eden ADN akson terminallerinin uyarılması, mevcut klemp modunda presubiküler tabakadaki üç ana hücrede uyarıcı post-sinaptik potansiyeller ortaya çıkar. Işık yoğunluğuna bağlı olarak, EPS eylem potansiyel eşiğine ulaşabilir. Gerilim kıskacı modunda sinaptik sonrası yanıtlar da gözlendi, uyarıcı post-sinaptik akımlar ortaya çıkarıldı.
Burada gösterilen bir tabaka üç piramidal nöron bir epifloresan mikroskop ile görüntülenmiş DAPI boyama ile presubiküler yüzeysel tabakalarda Chronos-GFP ifade talamik aksonlarla çevrilidir. Ve bu görüntü konfokal mikroskopla daha yüksek bir büyütmede çekildi. Bir floresan izleyici ile pilot deneyler yaparken eksen boyunca bregma dikkatli tesviye stereotaksik enjeksiyon hassasiyetini artırmak için çok önemlidir.
Bu yordam aynı zamanda iki farklı dalga boylarına duyarlı iki generatif sahne enjekte ederek farklı alanlardan yakınsama projeksiyonları araştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, hücre tipine özgü bir şekilde uzak beyin bölgeleri arasında kesin anatomik ve fonksiyonel devre analizine olanak sağlamıştır.
