This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

Tüm hayvan prosedürleri Alman Federal Hükümet tarafından belirlenen ve Tübingen Üniversitesi kurumsal hayvan refahı komitesi tarafından onaylanmış hayvan koruma kuralları ve yasalara bağlı kalarak yürütülmüştür. 1. Hayvan Modelleri <ol><li> HR2.1: TN-XL Ca 2+ biyosensör fare <ol><li> Transgenik HR2.1 kullanın: TN-XL fare hat koni fotoreseptörlerin 10 seçici Ca 2 + biyosensör TN-XL ifade. Standart 12 saat gündüz / gece ritmi ile kaldırdı iki cinsiyetten 6 haftalık fareler - 3 kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Retina Diseksiyon <ol><li> Fizyolojik çözelti, <ol><li> 125 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 0.5 mM L-glutamin, ve 20 mM (+) glikoz içeren hücre-dışı çözelti taze 2 L, hazırlayın. Tüm malzemeyi eritmek kadar karıştırın. </li><li> &quot;Kabarcık&quot; hücre dışı çözelti,10 dakika - 5 için carboxygen (% 95 O2,% 5 CO2) ile. 2 mM&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için CaCl2 ekleyin. </li><li> Dışı çözüm köpüren sonra, onun pH ölçümü. pH, aksi takdirde bu hatalar çözeltinin hazırlanması sırasında yapılmış olması muhtemeldir, 7.4 olmalıdır. Sabit pH sağlamak için deney boyunca köpüren hızı ve çözüm sıcaklığı sabit tutun. </li><li> 2 matara, retina diseksiyon için bir ve kayıt kurulumu (perfüzyon) için birine stok ayırın. </li></ol></li><li> Göz enükleasyon ve retinanın izolasyonu (5-10 dk) <ol><li> Enükleasyon için çalışma alanı içinde loş kırmızı aydınlatma koruyun. Diseksiyon sırasında koni beyazlatma önlemek için 650 nm (veya daha uzun) bir zirve dalga boyu LED kullanın. </li><li> Koniler tamamen kayıtları sırasında duyarlı olmasını sağlamak için iyi havalandırılan, lightproof kutu içine kendi kafesi koyarak 2 saat için fare koyu adapte. </li><li> Bir Laborato altında fare uyuşturanbir buharlaştırıcı ve standart bir fare kafesi taşıyan bir gaz-sızdırmaz bir kap kullanılarak izofluran (% 5) ile Ry kapağı. Buharlaştırıcı&#39;yı işlerken dikkatle imalatçının talimatları izleyin. Alerjenlere maruziyeti azaltmak için eldiven ve yüz maskesi kullanın. </li><li> Diseksiyon için 40X büyütme - 10 ile binoküler mikroskop kullanın. </li><li> Dekapitasyon yoluyla anestezi fare kurban. </li><li> Yönlendirme için, su geçirmez bir kalemle her göz (= dorsal) üst işaretleyin. Sol veya sağ gözünü kullanarak konusunda takip edin. </li><li> Göz küresi arkasında optik sinir keserek dikkatlice kavisli makas kullanılarak göz çıkarın. Diseksiyon için taze carboxygenated hücre dışı çözelti ihtiva eden bir Petri kabı gözün aktarın. Gözü aktarmak için, optik sinir güdük tutunuz. </li><li> Keskin bir enjeksiyon iğnesi ile kornea ve (ora serrata de yani) sklera arasındaki sınır boyunca herhangi bir noktada göz delmek. </li><li> E tuthafifçe forseps çifti ile sklera de siz tek makas önceki adımda yapılan deliğe bıçak yerleştirin. Arka kısmında (göz kapağı) için göz (kornea, lens, vitreus) ön kısmını ayırmak için ora serrata boyunca kesin. Retina üzerinde dorsal konumunu belirtmek için kalem işareti pozisyonunda (optik disk doğru) radyal Göz yuvası kesin. Not: Bu şekilde hazırlanan eyecups daha sonra kullanmak için sürekli carboxygenated çözelti içinde muhafaza edilebilir. </li><li> Dorsal uzakta kendini noktaları kesilmiş şekilde Petri kabındaki Göz yuvası çevirin. Retina ve sklera arasında forseps ipuçları sokulmasıyla sol ve forseps, her bir çift Göz yuvası sağ tarafındaki sklera al. </li><li> Yavaşça Göz yuvası skleral kısmını ters çevirerek retina ayırın. Son olarak, sklera retina boşaltmak için makas diseksiyon mikro kullanarak optik sinir kesti. Not: Bu kritik bir adımdır. Retina (örneğin, tarafından zarar görmemesidokunaklı ve) forseps ile sıkarak. </li><li> Forseps ikinci bir çifti kullanılarak retina yüzeyinden birikintileri ve vitreus cismin çıkarılması hafifçe forseps bir çift ile retinanın kenarlarında birini basılı tutun. Retina yüzeyi temiz olduğunda, üç ek kısa, radyal kesimler (yaklaşık olarak her 90 °) yapmak için makas diseksiyon mikro kullanın. Bu kesimler, bir dikkatle fotoreseptör tarafı Petri kabı (Şekil 1A) aşağı bakacak şekilde retina düzleştirmek için izin verir. </li></ol></li><li> Dilim hazırlık (10-15 dakika) <ol><li> Dilimleri montaj ve kayıt odasına aktarılması için retina dilimleme ve cam kapak fişleri için önceden nitroselüloz filtre membranlar hazırlayın. Makas kullanılarak yaklaşık 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde nitroselüloz filtre membranı kesin. Bir glasscutter kullanılarak yaklaşık olarak 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde lamelleri kesilir. </li><li> Yavaş yavaş yakın hücre dışı çözelti bir cam slayt batırmakdokusu. Yavaşça, forseps bir çift kullanarak çok kenarında onu kapma ganglion hücre tarafı yukarı cam slayt üzerine retina çekin. Bu süreç, mekanik hasar ve doku katlanmasını azaltır. </li><li> İlgili araştırma sorusu ile ilgilidir retinanın bölge seçin (ayrıca Tartışma bakınız). Adım 2.2.9 yapılan uzun kesilmiş dorsal retina yarısını (Şekil 1A) işaretler, unutmayın. Kavisli neşter bıçak kullanarak seçilen retina bölgesi dışında bir dikdörtgen, yaklaşık 1 x 2 mm büyüklüğünde parça kesin. Doku çevresindeki aşırı çözüm siliniz. </li><li> Ganglion hücre tarafı zarına yapışan şekilde retina parçasının üzerine filtre zarı yerleştirin. Hemen sonra, sıkı bir şekilde zara doku takmak için zar üzerine, hücre dışı ortamın bir damla ekleyin. </li><li> Taze dışı solüsyon içeren dilimleme odasına zar monte retina doku aktarın. </li><li> 200 mikron dikey dilimler halinde kesin retinaBir doku kesici 23 takılan bir taze traş makinesi bıçak kullanılarak kalınlığı (Şekil 1B). Her retina parça için bıçağı değiştirin. Not: jilet ile belirtildiği gibi, tüm membran, aynı anda bölünmeler şekilde mükemmel dilimleme odasının alt yüzeyi ile uyumlu hale getirilmesi gereken bir keserken sesi &quot;linkine tıklayarak&quot; - aksi takdirde bıçak bükülebilir ve dilim zarar. </li><li> Zara yüksek vakum gres uygulayarak cam kapak-slip tek bir zar monte dilim Tutkal sadece (Şekil 1C) sona erer. Gres ücretsiz retina altındaki cam yüzeyini tutun. </li><li> Tutma odası içinde hücre dışı bir çözelti damla kapsadığı lamel monte dilimleri tutun - örneğin, kapalı ışık geçirmeyen kap, alüminyum folyo ile kaplanmış kapaklı bir Petri kabı - oda sıcaklığında bir carboxygen atmosferi altında. Holding atmosfer tutmak için küçük bir su deposu köpüren tarafından carboxygen tanıtılmasıbölme nemlendirilmelidir; Bu kurumasını dilimleri önler. </li><li> Kayıt odasına onları (tek tek) geçmeden önce 15 dakika - dilimler 10 tutma odasında dinlenmek için izin verin. Dilimler, oda sıcaklığında bölme tutarak 4-5 saat kadar muhafaza edilebilir (~ 21 ° C). </li></ol></li></ol> 3. İki foton Ca 2+ Görüntüleme <ol><li> İki foton mikroskopi <ol><li> Bir Hareketli Hedef Mikroskop (MOM) tipi iki foton mikroskop kullanın. Ayrıntılar ayrıca bkz hem MOM tasarım ve görüntüleme işlemleri, daha önce 24 tarif edildi 10,21,25 (kaynaklar ve şirketler için, bakınız Tablo 1). Not: kullanılan aşağıdaki minimum gereksinimleri karşılayan herhangi bir dik iki foton mikroskopu: Bu ~ 860 nm&#39;ye ayarlanabilir bir (a) darbeli bir lazer, (b), iki eş zamanlı olarak elde edilen floresans kanallarının en az, (Cı ile donatılmış olması gerekir )) eCFP ve sitrin floresan, (d için filtrelerhafif bir uyarıcısı (mümkünse tasarımlar için, 24,26 bakınız), ve yeterli bir kare hızında zaman lapsed görüntü dizileri kayıt sağlar (e) yazılım ca ilgi 2+ sinyallerini çözmek için. </li><li> İmalatçının işaret ettiği gibi, iki-fotonlu görüntüleme sistemi başlatın. Strictly tesisin lazer güvenlik kurallarına uyun. ~ 860 nm için lazer ve nağme o başlayın. </li><li> Kayıt odasına tutarak odasından bir dilim aktarın ve hemen carboxygenated ekstrasellüler çözümü ile perfüze başlar. 2 ml / dk&#39;lık bir perfüzyon akış oranı ve kayıt bölümü içinde, 37 ° C&#39;lik bir sıcaklıkta muhafaza. </li><li> 20X 0.95 NA suya daldırma hedefi kullanın. Varsa, retina dilim (Şekil 2) bulmak için kayıt odasına altında bir LED kızıl-ötesi ile birlikte bir CCD kamera kullanmak. Aksi takdirde iki foton görüntüleme (3.1.5 bakınız) kullanarak dilim bulun. </li><li> Biyosensör ifadesini görüntülemek için iki foton görüntüleme geçin. AçeCFP ve sitrin floresan görüntüleme için iki algılama kanalları. </li><li> Tarama ve (Şekil 3A) kayıt için koni terminalleri bir satır seçmek için iki foton mikroskop kontrol görüntü elde etme yazılımı kullanın. 128 x 16 piksel görüntüleri (31.25 Hz) veya benzer yapılandırmaya Set görüntü elde etme. Dış segmentlerinde photopigments beyazlatma önlemek için koni terminallerine taranan alan kısıtlayın. Not: (Ca 2+ unbinding için bağlayıcı Ca τ = ~ 0.6 sn 2+, τ = ~ 0.2 saniye; 16 bakınız) TN-XL kalsiyum sensörü için ~ 8 Hz minimum kare hızı önerilir. </li></ol></li><li> Hafif stimülasyon ve kayıt <ol><li> Başka yerde 10,21,26 açıklandığı gibi aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için alt kademe tam saha ışık uyarıcı kullanın. Not: Tam saha ışık uyarıcısı için basit bir çözüm, iki bant-geçiren filtreden geçen LED&#39;ler (: 360 BP 12, &quot;yeşil&quot;: 578 BP 10 örneğin, &quot;mavi&quot;) kullanmaktırBu fare koni dalga boyu hassasiyetlerini maç ama aynı zamanda floresan tespiti için kullanılan filtreler ile örtüşmeyen (cf. 3.2.4). LED&#39;lerden gelen ışık kayıt odasına (Şekil 2) altına doğru Kondenser tarafından odaklanmıştır. Bu stimülatörü tasarımı, kendi kalibrasyon ile ilgili ayrıntılı bilgi için, ışık yoğunlukları kullanılan ve uyarılmış koni fotoğraf izomerleştirme oranları, 10,21,26 bakın. </li><li> Işık uyaranlara (3.2.3 bakınız) sunulması ya da farmakolojik ajanlar uygulamadan önce - (ayrıca Potansiyel Tuzaklar bakın, 30 saniye 20) lazer açın ve koni tarama lazer ve uyarıcı arka plan ışığı uyum sağlar. </li><li> (Şekil 3B, C de gösterildiği gibi hafif örneğin, yanıp söner) keyfi uyaranların sunumu başlatın. Aşama 3.2.1 tarif stimülatörü durumunda, özel bir yazılım tarafından kontrol edilen bir mikro-işlemci kartına (kullanılarak, zaman içinde iki LED yoğunluğunu modüle harekete geçirici bir güçdetayları) 10,21,26 bkz. </li><li> İki floresan kanalları kaydetmeye başlayın (. Örneğin, &quot;mavi&quot; FRET verici eCFP için 483 nm ve &quot;sarı&quot; FRET-alıcısı için 535 nm, gözlük bakınız Tablo 1 için) aynı anda ilgili görüntü elde etme yazılımı kullanarak (ayrıca bkz 3.1 .6). Örneğin, hafif bir yanıp söner (Şekil 3B, C), kayıt en az 8 durumunda - 10 uyarım sunumları (çalışma). </li></ol></li><li> &quot;In-dilim&quot; Ca 2+ kalibrasyonu <ol><li> Telaffuz Ca (3,4 de tarif edildiği gibi), (3.1.6 ve 3.2.4 tarif edildiği gibi) ve koni bir dizi taban Ca 2 + seviyesini elde konik terminalleri 2 + işaretleri. </li><li> 5 uM (DMSO içinde çözülmüş) ionomisin ve 10 mM EGTA ile &quot;Ca 2 + serbest&quot; hücre dışı ortama geçiş (veya alternatif olarak, BAPTA) ilave edildi. Tutanak koni terminalleri yine her 5 dk minimal floresan oranını (R dk) belirlemek, &lt;etmekem&gt; yani hücre içi Ca (yakın) yokluğunda oranı 2+. 30 dakika - Bu her yerde 15 arasında sürebilir. Not: Bir perfüzyon sistemi, farklı hazneler arasında geçiş sağlar olması gereklidir. </li><li> (DMSO içinde çözülmüş) ile 5 uM ionomisin ve 2.5 mM Ca2 + ile birlikte hücre dışı ortama geçin. 5 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra, kayıt koniler yine her 5 dakika, yani maksimum flüoresans oranı (Rmax), 2 + hücre içi Ca doyurucu konsantrasyonlarının mevcudiyetinde oranını ölçmek için kullanılır. Kararlı olmak Ca 2 + oranı 15 dk - ionomycin uygulamayı takiben, bu 3 arasında sürebilir. Not: 2+ yüksek Ca dilimleri merceğin ve sonunda hücrelere zarar verecek uzun süre iyonomisin. Normal morfolojisini muhafaza analizinde tek hücreler yer alır. Konsantrasyonları (örneğin, EGTA, iyonomisin) adapte edilmesi gerekebilir. Ca 2 + kalibrasyon hakkında daha fazla bilgi içinprotokol, 13,17 bkz. </li></ol></li><li> Veri analizi Not: İlgili mikroskop yazılımı ile uyumlu ve özel analiz komut çalıştırabilen bir görüntü işleme ve veri analiz yazılımı paketi kullanın. <ol><li> Bir görüntüleme veri dosyası yükleyin ve her koni terminali (Şekil 3A) çevresinde ilgi (ROI) bölgeleri çizin. ROI içindeki her bir çerçevede, ortalama floresans şiddeti ve FRET alıcı (sitrin) ve verici (eCFP) floresans (R = F A / F; Şekil 3B, C) ​​arasındaki oranı (R) hesaplamadan önce, arka plan floresanı çıkarılır. Bu oran genellikle göreceli hücre içi Ca2 + konsantrasyonu için bir vekil olarak kullanılır, ancak kalibrasyon (3.3) sonra, aynı zamanda mutlak konsantrasyonları (3.4.3 bakınız) tahmin edilebilir. Not: pediküller dış pleksiform tabakasında konumlarına tarafından kabul edilebilir ve bunların morfolojisi (biraz daha küçük koni daha &quot;lekeler&quot; düzleştirilmişsomata) koni akson sonunda yer. </li><li> Ortalama uyaran denemeleri (Şekil 4A). Cevap boyutu için önlemler olarak eğrisi (R A) altında ışık uyarımı, tepe genliği (R amp) ve bölgeye önce böyle Ca 2 + bazal seviyesi (R üssü) olarak ortalama izleri (Şekil 4B), yanıtı parametreleri ayıklayın. Ayrıca, bu tür tepki yükselişi (t artış) ve çürüme süresi (t çürüme) olarak ortalama izleri, yanıtı kinetiği ayıklamak (% 20 ve R amp% 80 arasında = ilgili zaman aralıkları Şekil 4B resme bakınız). Bu parametreleri belirlemek için nasıl hakkında daha fazla bilgi için, 10. görüyorum. </li><li> Adımlar 3.3.1-3.3.3 itibaren ölçümlere dayalı mutlak koni Ca2 + konsantrasyonu tahmini hesaplayın. Minimum ve maksimum Ca2 + konsantrasyonu, R ve R min max Ca, sırasıyla donör floresan için oranları kullanın 2+ </s&gt; TT-bağlı (F D, Ca-bound) ve -unbound kadar (F D, Ca-ücretsiz) devlet yanı sıra, in vivo ayrışma sabiti aşağıdaki TN-XL için (Kd = 0.77, 16 bakınız) denklem (27&#39;ye analog): </li></ol></li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse.">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li><li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+(CNG)+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa.">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li><li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse.">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li><li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat.">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li><li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse.">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2++concentration+in+salamander+cone+photoreceptors.">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse.">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li><li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors.">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors.">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li><li>Johnson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2++dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses.">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells.">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li><li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo.">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes.">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li><li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li><li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+two+retinal+domains:+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution.">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li><li>Kemmler, R., Schultz, k., Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina.">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li><li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive.">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina.">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li><li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina.">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+interactions+in+the+outer+retina.">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e488 (2013).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function.">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Elektrofizyolojik tek hücreli kayıtları veya sentetik floresan göstergeler Ca 2 + görüntüleme kullanarak Önceden var olan protokoller teknik nedenlerle (bkz) bir dizi için fare koni fotoreseptör Ca 2+ dinamiklerini kaydetmek için mücadele ediyoruz. Burada açıklanan protokol Ca 2 + sinyalleri ve verimli ve nispeten basit bir şekilde bireysel, belirlenen fare koni terminalleri bile mutlak Ca 2 + düzeyleri ölçülebilir. Bu protokol zaten başarıyla sağlıklı fare retinadaki koni fonksiyonunun farklı yönlerini ele üç çalışmalarında kullanılmıştır. İlk çalışmada 10 yılında HR2.1: TN-XL fare Ca 2 + biyosensör koni özgü ifadesi engel olmadığını gösteren immünohistokimya, ERG kayıtları, iki foton Ca 2 + görüntüleme ve farmakoloji kullanılarak karakterize edildi koni anatomisi ve işlevi. İkinci çalışmada 21, kromatikve fare koni akromatik tepki özellikleri &quot;yeşil&quot; opsin hakim olduğu dorsal ve &quot;mavi&quot; opsin hakim olduğu ventral fare retina arasındaki koni fonksiyonu çarpıcı farklılıklar gösteren, retina üzerinde haritalanmıştır. Koni özelliklerinde Bu bölgesel farklılıklar fare kozalakları farklı spektral tipi dolayısıyla akromatik zıtlıkların (yakın) en uygun örnekleme sağlamak ve düşündüren, doğal ortamda diferansiyel kontrast dağılımı (yani, toprağa karşı gökyüzü) uyumlu bir sunabilir evrimsel bir avantaj. Koni akson terminalleri yatay hücrelerden aldığınız üçüncü çalışmada 22 karşılıklı geribildirim araştırıldı. Tüm önerilen yatay hücre geribildirim mekanizmaları koni akson terminallerinde 28 voltaj kapılı Ca 2+ kanalları üzerinde hareket gibi, koni terminali Ca 2 + yatay hücre-koni etkileşimleri için bir proxy olarak hizmet verebilir. Kemmler tarafından çalışma 22 destekler coworkersgörünüm yatay hücreler fotoreseptör glutamat salınımını kontrol etmek için çeşitli mekanizmalar içeren karmaşık bir geribildirim sistemi kullanmak olduğunu. Bu çalışmalar, tarif edilen protokol çok yönlülüğünü göstermekte ve bu koni fonksiyonu ve sinaptik devreleri ilgili sorular geniş bir şekilde adapte edilebilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, protokol koni fizyolojisinin daha iyi anlama yolunda, farklı koni bölümlerinde yerel Ca 2 + sinyalizasyon okuyan mümkün kılar. Böyle bir bilginin sonunda koniler etkileyen dejeneratif hastalıklar için özellikle potansiyel terapötik yaklaşımların rasyonel gelişimi için izin, dejenere koniler patofizyolojik süreçleri anlamak önemlidir. HR2.1 olarak: TN-XL, fare hattı, Ca 2 + biyosensör dış segmenti hariç olmak üzere, koni boyunca ifade edilir. Bu Ca 2 + dinamik doğrudan ve rasyometrik değerlendirilmesi için bir fırsat sağlarFarklı konik bölümlerinde s. Ca değişim yana dış segmente 2 + akımları membran potansiyeli ve voltaj kapılı Ca + 2 kanal elde edilen aktivasyonu yoluyla terminalleri yansıtılır, dış segmente işlemler dolaylı gözlenebilir. Potansiyel tuzaklar: retina diseksiyonu kritik bir adımdır: Fare, retina genellikle fotoreseptör dış segmentleri ve pigment epiteli arasındaki Göz yuvası ayrılır. Bu nedenle, izole retinanın ışığa duyarlı fotoreseptör dış segmentleri maruz kalır ve mekanik hasarlara karşı son derece duyarlı. Büyük bakım araçları ile fotoreseptör tarafı dokunarak veya yapışkan yüzeyinde yan (örneğin, bir filtre membran) doku taşıyarak zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Kaliteli retina dilim onların temiz kesim yüzeyi tarafından mikroskop altında kabul edilebilir veaçıkça tanımlanmış dış kesimleri ile iyi organize fotoreseptör tabakası ile. Dilim kalitesinin Fonksiyonel değerlendirme hızla (- 20 kozalakları 10 ile bir görüş alanı, örneğin), parlak ışık uyaranları yanıp sönen ve duyarlı koni yüzdesi belirlenerek yapılabilir. Burada, tepki kalitesi sinyal-gürültü oranı (S / N) (ışık tepkisi genliği vs ışık uyaran önce bazal gürültü genliği) hesaplanarak değerlendirilmelidir; S / 2 N - 3 minimum eşik olarak kabul edilmelidir. Tipik olarak, biz% 50&#39;den az duyarlı konik dilimleri atın. Ayrıca aşırı spontan spike davranışı (10&#39;a bakınız Şekil 4) atılmalıdır görüntüler kozalakları ile dilimler. Söz konusu anatomik ve fonksiyonel kriterlere uygun kayıt odasında Dilimler 1 için tutarlı tepkiler göstermek - 2 saat (yanıt tutarlılık ile ilgili ayrıntılar için, 10 bakınız). Dilimler saat hayatta Çünkütutma odasına bizimki, başarılı bir deney 6 saat kadar sürebilir. Bu dilimleme kaçınılmaz retina ağlarda yanal bağlantıları koparır olarak koni ve yatay hücreler arasında uzun değişen mekânsal etkileşimleri inceleyerek açısından bazı sınırlamalar vardır dikkat çekicidir. Ancak, 300&#39;e um retina dilim kalınlığını artırarak bu sorunu 22 iyileştirmektedir. Dikey retina dilimlerinin kullanımı, büyük ölçüde (10,21 bkz detaylı bir tartışma için) opsin ağartma önler ve böylece, uyarım lazer ile ışık duyarlı konik dış bölümlerin tarama önler ve. Bununla birlikte, kaydedilen Ca 2 + sinyalleri sadece hafif uyaranlara bağlı değil, aynı zamanda tarama uyarma lazer tarafından oluşturulan bir arka plan aydınlatması bileşeni tarafından etkilenen olsun. Aslında, bu tür iki-fotonlu görüntüleme deneylerde etkili bir arka plan aydınlatması dağınık lazer ışığı, kaydedilen CE tarafından yayılan flüoresans ışınlarının bir kombinasyonu olup,lls ve herhangi bir LED arka plan uyaran bileşeni. Kayıttan önce (çalışır durumda, ışık uyarısının arka bileşenle) lazer taraması 30 s - Bu nedenle, koniler, en az 20 adapte izin verilmelidir. Avantajları ve uygulamalar: Koniler sinyal yolları 2 + Ca doğrulayabilir konik Ca 2 + görüntüleme ile kombinasyon halinde farmakolojik çalışmaları ve şunlar olabilir: Bu koni Ca 2 + -imaging protokolü için bazı uygulamalar 10,21,22, yukarıda tarif edilmiş olsa da, diğer uygulamaları tasavvur edilebilir etkinlik ve Ca farklı oyuncular hedefleme ilaçların gücünü test etmek için kullanılır 2+ 10&#39;a -signaling. Ancak, anahtar uygulama koni işlevini etkileyen hastalıklar incelemek için olabilir. Insan hastalıkları taklit eden pek çok retina dejenerasyonu fare modelleri mevcuttur. Örneğin, koni fotoreseptör kaybı 1 (cpfl 1) fare primer koni dejenerasyon modeli acı olduğunuBir Pde6c mutasyon 29 arasında. Tersine, çubuk dejenerasyon 1 (rd 1) Fare Pde6b mutasyon muzdarip. Bu birincil çubuk fotoreseptör dejenerasyonu, 30 1&#39;de rd 1 çubuk kaybı tamamlandığında, ikincil koni dejenerasyon setleri neden olurken. HR2.1 bu hayvanların melezleme: TN-XL hat okuyan ve hem birincil hem de ikincil koni dejenerasyon Ca 2+ dinamiklerini karşılaştırarak izin ve koni hücre ölümü sırasında Ca 2+ rolüne dair değerli içgörüler sağlamaya muhtemeldir olacaktır. Ayrıca, farmakolojik koni dejenerasyon kaynaklı - örneğin seçici PDE6 inhibitörleri kullanan - koni dejenerasyon 10,29,31 aşağı mekanizmaları tanımlamak için hizmet edebilir. Özetle, protokol burada fare koni fotoreseptör hücre içi bölümlerinde Ca 2 + ölçmek izin verir ve geniş bir yelpazede altında koni fizyolojisini ortaya çıkarmak için büyük fırsatlar sunuyor tariffizyolojik ve patofizyolojik durumların. Buna ek olarak, bu protokol koni Ca 2 + -signaling müdahale ve böylece konik hastalıklar için yeni tedaviler kurmak için tasarlanmış farmakolojik maddelerin taranması için kullanılabilmektedir.

Görüş retina fotoreseptör fototransdüksiyon kaskadının ışık kaynaklı aktive olması ile başlar. Koni fotoreseptör renk ve yüksek çözünürlüklü gündüz vizyon aracılık oysa Rod fotoreseptör, düşük ışık seviyelerinde vizyon sağlar. Birçok fotoreseptör özgü genler bu hücrelerin dejenerasyonuna yol mutasyonlara karşı hassastır. Fotoreseptör kaybı ile ilişkili moleküler belirteçlerin bir dizi 1 tanımlanmıştır, ama şimdiye kadar ayrıntılı moleküler mekanizmaları ve olaylar dizisi belirsizliğini koruyor. Altered Ca2 + homeostazı fotoreseptör hücre ölümü, bir tetik, dejenerasyon süreci 2,3 sırasında Ca aktivitesi 2 + -bağımlı kalpain tip proteazların yukarı regülasyonu ile desteklenen bir hipotez olarak öne sürülmüştür. Ancak, bugüne kadar, bu hipotez Ca 2 + fizyolojik ölçümleri ile desteklenmemektedir. Re Ca 2+ kanal blokerleri etkisi üzerinde çeşitli çalışmalarda tutarsızlıklarintestinal hastalıklar daha doğrudan memeli koni fotoreseptör Ca 2+ değerlendirmek için yöntemler çağrısında hücre ölümü 4-6 Ca 2+ katılımı meydan okudu. Daha önce, en elektrik kayıt ve Ca 2+ görüntüleme çalışmaları nedeniyle koni 7-9 daha kolay erişim kurbağa ve sürüngen modellerinde yapılmıştır. Ancak, memeli fotoreseptör fizyolojisi olmayan memelilerde 10, özellikle de bu farklı olabilir, insan kalıtsal retinal dejenerasyon bağlamında memeli fotoreseptör fizyolojisi hakkında daha iyi bir anlayış yenilikçi tedavilerin geliştirilmesi için bir anahtardır. İnsan retina hastalıkları taklit eden pek çok fare modelleri mevcuttur, ancak küçük fare konileri 11 Ca 2+ dinamikleri hakkında bilinmektedir. Elektrik teknikler, özellikle olmayan farelerde,, koni yüksek verimli kayıtlar için uygun değildir burada çubuklar (~% 97) önemli ölçüde koni (~% 3) sayıca 12 </s&gt; yedekleyin. Ayrıca, bu tür tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gibi hassas elektrofizyolojik teknikler, hücre içi ortamını rahatsız ve mutlak hücre içi Ca + 2 konsantrasyonları Ca 2+ akımlar veri değil sağlar. Koni Ca 2 + dinamikleri hakkında sorular ele alırken Dolayısıyla, alt temporal çözünürlük rağmen, görüntüleme tercih edilen bir yöntemdir. görüntüleme ile önemli bir konu seçici bir floresan Ca 2 + göstergesi boya ile kozalakları etiketlemek için nasıl. Uygun bölmelere ve hücre özgüllüğü dokuya &quot;toplu yükleme&quot; sentetik Ca 2 + göstergesi boyalarla elde etmek zordur. Sonuç olarak, etiketli kozalakları olarak 13,14 çubukları ve Müller glial hücreler güvenilir ayırt edilemez. Ayrıca, sentetik boyalar tutarlı şartlar altında uzun süreli kayıtları önlenmesi, hücre dışına sızıntı eğilimindedir. O de gerektirir Dahası, onların AM-ester formunda sentetik Ca 2 + göstergeleri yükleme, sorunluTERGENTR (örneğin, DMSO) ve formaldehit 15 oluşturur. Mutlak Ca 2 + ölçümler için, rasyometrik göstergeler zorunludur. Ancak, en iyi mevcut sentetik rasyometrik göstergesi Fura-2 şiddetine bağlı olarak, kendi içinde koniler uyarır ve bu şekilde çalışmaları engelleyebilir, 760 nm ile 700 aralığında uyarma ışık (iki foton uyarılması için) gerektirir koni Ca fizyolojik aydınlatma koşullarında 2+ dinamiği. Sentetik boyalar farklı olarak, genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri bir hücre tipine seçici biçimde ifade edilebilir. Onlar hücre dışına sızıntı yok ve ağartma kaçınılması, bu nedenle, uzun süreli ve güvenilir rasyometrik ölçümler mümkündür. İki foton mikroskopi ile kombine edildiğinde Hücre tipi seçici Ca 2 + biyosensörler ifadesi, büyük ölçüde fizyolojik şartlar altında 13,16,17 Ca 2 + değerlendirmek ve hücre içi çalışmak için güçlü bir araç temsil </&gt; sup. Burada, biz ışık uyaran-uyarılmış koni Ca incelemek için bir protokol açıklar transgenik Ca 2 + biyosensör fare hattında 2+ dinamiği: FRET tabanlı Ca 2 + biyosensör TN-XL 18 ifade (HR2.1 TN-XL), seçici koniler, insan kırmızı opsin promotör HR2.1 19 altında. Koni terminallerini erişmek için, ex-vivo dilim hazırlık 20 kullanılmıştır. protokol zaten başarıyla sağlıklı farelerde 10,21,22 koni fonksiyonu üç çalışmalarında kullanılmıştır. Ayrıca, protokol koni Ca okuyan sağlar 2+ örneğin spesifik genetik koşullarda sinyalizasyon, HR2.1 ile kalıtsal retina dejenerasyonu için fare modelleri melezleme yoluyla: TN-XL fareler.

<table><tbody><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/&quot;&gt;http://www.dowcorning.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>24 x 60 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com&quot;&gt;http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>76 x 26 mm; 
&lt;a href=&quot;http://www.langenbrinck.com&quot;&gt;http://www.langenbrinck.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Blades for tissue chopper</td><td>MARTOR KG</td><td>ARGENTAX No. 1044</td><td>0.25 mm; 

&lt;a href=&quot;http://www.martor.de&quot;&gt;http://www.martor.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tissue chopper</td><td>Custom-build</td><td></td><td>Based on a design by F. Werblin&lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;, adapted by T. Schubert</td></tr><tr><td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td><td>Merck Millipore</td><td>AABG01300</td><td>Filter type: 0.8 &amp;micro;m;

&lt;a href=&quot;http://www.emdmillipore.com&quot;&gt;http://www.emdmillipore.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isoflurane CP</td><td>CP pharma</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cp-pharma.de/&quot;&gt;http://www.cp-pharma.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>UV/green LED-based full-field stimulator</td><td>Custom-build</td><td></td><td>for details, see&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Open source microprocessor board</td><td>Arduino</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.arduino.cc/&quot;&gt;http://www.arduino.cc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Imaging software CfNT</td><td>Custom-written</td><td></td><td>developed by Michael M&amp;uuml;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td></tr><tr><td>IgorPro</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wavemetrics.com/&quot;&gt;http://www.wavemetrics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>VC3-4 System focal perfusion system</td><td>ALA Scientific Instrument</td><td></td><td>with 100 &amp;mu;m-diameter tip manifold; 

&lt;a href=&quot;http://www.alascience.com/&quot;&gt;http://www.alascience.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.spectra-physics.com/&quot;&gt;http://www.spectra-physics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Movable objective microscope (MOM),&lt;br/&gt; Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html&quot;&gt;http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>XLUMPlanFL 20X/0.95w objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.olympusamerica.com/&quot;&gt;http://www.olympusamerica.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Vaporizer 100 series</td><td>Surgivet</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.surgivet.com/&quot;&gt;http://www.surgivet.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ionomycin, Calcium salt</td><td>Life technologies</td><td>I24222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;https://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101191250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Leica MZ95</td><td>leica microsystems</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.leica-microsystems.com/&quot;&gt;http://www.leica-microsystems.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

Retina koni fotoreseptör (koni) günışığı vizyon hizmet ve renk ayrımcılığı temelini oluşturur. Bunlar genellikle çok sayıda retinal hastalıklarda körlüğe yol açan, dejenerasyon tabidir. Kalsiyum (Ca2 +), fotoreseptör sinyal ve metabolizmada önemli bir ikinci mesajcı dolaylı çeşitli hayvan modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu ile bağlantılı olduğu ileri sürülmüştür. Sistematik koni fizyolojisinin bu yönlerini incelemek ve patofizyolojisi elektriksel retina çubuk fotoreseptör hakimdir fare, özellikle bu küçük hücrelerden kayıt zorluklar tarafından engellenmiştir. Bu sorunu aşmak için, biz kozalakları münhasıran genetik olarak kodlanmış Ca 2 + biyosensör TN-XL ifade ve fotoreseptör dejenerasyonu için fare modelleri ile melez edilebilir transgenik fare hattı kullanarak bir iki foton Ca 2 + görüntüleme protokolü kurdu. Burada açıklanan protokol dikey kesitler hazırlamak üzere şunları içerir: (R,20, fareler ve koni Ca 2 + seviyesinde hafif uyarıcı uyarılmış değişikliklerin optik görüntüleme gelen retina dilim &quot;). protokol aynı zamanda mutlak Ca 2 + konsantrasyonları &quot;in dilim Ölçümü&quot; sağlar; kayıtları kalibrasyon takip edilebilir. Bu protokol, fonksiyonel koni özellikleri içine çalışmalar sağlar ve koni anlayışı Ca 2 + sinyalizasyon yanı sıra fotoreseptör ölümü ve retina dejenerasyonu Ca 2+ potansiyel tutulumuna katkıda bulunması beklenmektedir.

Dikey dilimleri HR2.1 hazırlanan (Şekil 1) birleştirerek: İki foton görüntüleme (Şekil 2) ile TN-XL fare retinanın, biz koni fotoreseptör akson terminallerinde ışık uyaran-uyarılmış Ca 2 + sinyalleri rasyometrik ölçümler yapmak başardık . Bu yaklaşım erişme ve sentetik Ca 2 + göstergeleri ile önceden varolan optik görüntüleme yöntemleri üzerinde fare konileri görselleştirme önemli bir gelişmeyi temsil eder. Örneğin, genetik olarak kodlanmış rasyometrik Ca koni özgü anlatım 2+ biyosensör TN-XL ölçüde koni akson terminallerinin kimlik (Şekil 3A ROI bakınız) kolaylaştırdı. Bu nedenle, bizim protokol hem koni ve çubuk akson terminalleri katkılarıyla örnek &quot;karma&quot; sinyalleri olarak, belirsiz kökenli kayıt sinyallerinin riskini ortadan kaldırır. Bizim yaklaşımımız Indivi düzeyinde tek deneme yanıtları çözme veriyorÇift koni akson terminali. Koni terminalden Ca 2 ışık uyarılmış ekstrüzyon artış ve verici ve alıcı floresan sırasıyla (Şekil 3B), bir azalma ile işaretlenir. Flüoresans oranı (R) azalma koni ve voltaj kapılı Ca + 2 kanal daha sonra kapağın ışık kaynaklı hiperpolarizasyon kaynaklanan konik ucu (Şekil 3C), Ca ekstrüzyonu 2 + karşılık gelir. Birkaç koni akson terminalleri (Şekil 3A) aynı anda izlenebilir Çünkü, veri toplama çok verimli ve koni Ca 2+ yanıtları yüzlerce tek bir deneyde toplanabilir. (Şekil 4) kantitatif bu yanıtları değerlendirerek, koni Ca 2 + sinyalleri karşılaştırılabilir ve koşullar (Tartışma) aralığında değerlendirilmiştir. Bu FRET-alıcısı (sitrin) ve -donor (eCFP) floresan arasındaki oranı kullanmak genellikle yeterli olurHücre içi Ca 2 + seviyesinin göreceli bir önlem olarak; (F A / F D detaylar için, 3.4 bakınız). Oysa, gerektiğinde, bu oran mutlak hücre içi Ca 2 + konsantrasyonları ([Ca 2 +]) (Şekil 5) elde etmek için kalibre edilebilir. Bu protokolde kullanılan arka plan aydınlatması At (detaylar için, bkz 10&#39;a ve Şekil 3 efsane), kalibrasyon [Ca 2 +] in &quot;vahşi tip&quot; HR2.1 dinlenme mutlak bir tahmin vermiştir: TN-XL fare koni terminalleri 243 ± 159 literatür 11 fareleri için aralığında nM (ortalama ± SD). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> Dikey retina dilim 1. Hazırlık Şekil. Retinanın (A) İzole ve retina dilimleme için hazırlanan basık. (B) Dikdörtgen parça (lerdilimleme sonra filtre kağıdı membran (koyu gri) üzerine monte edilmiş) A kırmızı kutu ee. (C) gres kullanarak bir cam lamel sabit zar monte retina dilim Üst görünümü. (D) retina dilim bir kısmının şematik çizimi (C kırmızı kutuya bakın). Koni fotoreseptör yeşil gösterilir. V, ventral; D dorsal; N, nazal; T, zamansal; OS dış segment; ONL, dış nuklear tabaka; OPL, dış pleksiform tabakasını içermektedir; INL, iç nuklear tabaka; IPL, iç pleksiform tabakası; GCL, ganglion hücre tabakası. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> Retina dilim Şekil 2. İki foton görüntüleme: Kayıt yapılandırma İllüstrasyon Üst:. Su daldırma objektif lens odaklama olacakTarama retina içine lazer (kırmızı aşağı ok) ve yayılan floresan (yukarı oklar) toplama am. objektif bir CCD kamerası kullanılarak bir dilim görüntülerken, belirli bir kondansatör altına monte edilmiş bir LED aydınlatma kızılötesi ışık iletilir toplar geçin.:., hücre dışı çözelti ile kayıt odasına monte edilir ve perfüze Retina dilim Alt: Kondenser mercek stimülasyon LED&#39;lerden gelen ışık odaklama (ve CCD kamera görüntüleme kızılötesi LED) retina dokusu içine kayıt odasının şeffaf altından geçerek. IR LED, kızılötesi ışık yayan diyot; CCD, şarj-kuplajlı aygıt; BP, bant geçiren. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> Şekil 3. Işık EvokeFare koni Fotoreseptörlerin akson terminallerinde d Ca 2+ cevapları. (A) Sol: Kayıtlar retina dilimleri koni fotoreseptörlerin (yeşil) sinaptik terminalleri (kırmızı kutu) üzerinde duruldu Sağ:. Örnek Kaydedilen bölge için 7 ayrı terminaller. Floresan iki kanal kullanılarak kaydedildi:. (; 535 BP 50 üst) ve FRET-verici eCFP için bir tane (alttan; 480 BP 32) FRET-alıcı sitrin için bir (B) sitrin Işık uyarılmış değişiklikler (F A) ve eCFP (F D) floresan tek ROI kaydedildi. (C) Ca 2+ yanıtları 5 sn aralıklarla 1 sn parlak ışık yanıp söner bir dizi için bir koni terminalinin (oran F A / F D gibi). ROI, ilgi bölgesi; BP, bant geçiren filtre; F, floresan yoğunluğu; keyfi birimler, au; FRET, Förster rezonans enerji transferi; eCFP, mavi floresan proteinin geliştirilmiş. Uyaran yoğunluğu (p. 13,0 ve bir arka plan düzeye ekleyerek sırasıyla M- ve S-opsins için 12.8, (içinde ~ 10 = LED&#39;ler kapalı, uyarma lazer tarama): 10 3 · P · s -1) koni başına içinde otoğraf-izomerizasyon oranı <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> Işık uyarılmış koni Ca 2+ yanıtların Şekil 4. örnek olarak kantitatif analiz (A) tek bir koni terminalden (Ír gibi) Işık uyarılmış Ca 2 + yanıtları (tek denemeler: gri izleri, n = 16; ortalama:. Siyah iz ) (B) Parametreler ortalama Ca 2 + yanıtı için belirlenen:. önce ışık uyarısına bazal temsil eden) Ca 2 + seviyesi (R tabanını İstirahat, yanıt boyutu ar olarakEA-altında-eğrisi% 80 (R, A) ve tepe genliği (R amp), yanıt başlangıç ​​kinetikleri (t yükselmesi R amp% 20 ila% 80 arasında bir zaman aralığı) ve çıkıntı (t çürüme, zaman aralığı R amp% 20) kadar. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> Şekil 5. mutlak Ca 2 + konsantrasyonu tahmin. Dinlenme Ca 2 + konsantrasyonu ([Ca 2 +] oran F A / F D gibi) TN-XL fare 8 koni akson terminallerinde kaydedilen (çevrelerin, SD ± ortalama) Farklı hücre dışı solüsyonlar için: iki kez standart bir hücre dışı ortamda (Ctrl 1 ve 2), daha sonra en az (&quot;sıfır&quot;), [Ca2 +] (10 mM EGTA) ANYüksek [Ca 2 +] (2.5 mM) ile d dışı ve hücre içi Ca 2 + dengelenmeye iyonomisin 5 mcM varlığında son iki koşul. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina at JoVE.com

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.6K Görüntüleme.  University of Tübingen.  Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir. 

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Nörobilim

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Superior Colliculus'ta İki Foton ve Geniş Alan Kalsiyum Görüntüleme

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Yazar Gündemi: Superior Colliculus'ta Nöral Kodlamanın ve Görsel İşleme Mekanizmalarının Ortaya Çıkarılması 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Görüntüleme Ca

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme