Yazarlar biyofilm büyüme protokolleri ve John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) Bioflux sistemine ilişkin teknolojik konularla ilgili tavsiye formüle yardım William Nance (Michigan Üniversitesi) teşekkür ederim. Start-up fonları AHR için: (AHR için R21DE018820 NIH) ve Michigan Üniversitesi Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen

Burada tarif edilen tükürük toplama protokolü İnsan Konu Araştırma Michigan Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi tarafından gözden geçirilmiştir. NOT: Bu tip insan konu iş için kurumsal değerlendirmeleri ile ilgili, önceki düzenlemeler ve izinler ev sahibi kurumdan topladı edilmelidir. Özellikle, kuruma bağlı, IRB veya etik onay insan gönüllülerden tükürük toplama devam etmeden önce aranan ve onaylanması gerekebilir. Bir uygulamayı hazırlamak için bir yardım olarak, yararlı bir NIH algoritması / grafik burada bulabilirsiniz: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> Çevresel Germane Büyüme Ortamı Olarak Kullanımı için Toplanmış Salyasından 1. Hazırlık <ol><li> Tükürük bağışı için&gt; 5 bireyleri. Hiçbir individu sağlamak, herhangi bir tanımlayıcı bilgileri almayınOnlar hasta, ya da son 3 ay içinde ağızdan antibiyotik almış, ya da yiyecek veya sıvı tüketilmesi varsa als bağış önce önceki 2 saat içinde, su dışında, tükürük bağışlayacak. </li><li> 50 ml&#39;lik plastik tüplere tükürük toplayın. Buz üzerinde tutarak, bir plastik bardağa toplanan tükürük havuzda toplayın. Tükürük polimerler iç cam yüzeylerine yapışır gibi cam kullanmayın. </li><li> Bir 100x stoktan 2.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar dithiothreitol (DTT) ekleyin. (Stok tek kullanımlık alikotları dondurulur -20 ° C). Buz üzerinde bir plastik kap içinde 10 dakika için karıştırın. </li><li> Partikül madde ortadan kaldırmak için, santrifüj, 17.500 x g&#39;de 30 dakika süre ile bir araya getirilmiş, tükürük. </li><li> Dörtte biri konsantre tükürük vermek için dH 2 O 3 hacmi ile tükürük seyreltin. </li><li> Filtre-sterilize 0.22 mikron polietersülfon (PES), düşük protein bağlayıcı filtre kullanarak tükürük. Geniş yüzey alanına sahip filtre kullanın, ya da birkaç küçük alan filtreleri kullanın. Bir de tükürük tutunbuz üzerinde plastik kap filtreleme süre. </li><li> Toplanmış tükürük donma -80 &#160; 50 ml&#39;lik plastik tüplerde ° C bakteri büyümesi için gerekli olana kadar. Her bir plastik tüp tek kullanım içindir ve her bir mikroakışkan de 1.2 ml &#39;lik bir maksimum (1.2 mi x 24 kuyu = 28.8 mi) tutan ve tükürük dondurma sırasında genişlerken alanının her bir tüp içinde gerektiği gibi en fazla 35 ml içermelidir. </li><li> Kullanım için, oda sıcaklığında bir araya toplanmış tükürük eritin. Bir kez çözülmüş, (herhangi bir çökeltilerin kaldırmak için 0.22 mikron polietersülfon, düşük protein bağlayıcı filtre) bir kez daha filtre sterilize. </li></ol> Bir İnokulum olarak kullanım için Toplanmış Salyasından 2. Hazırlık <ol><li> Tükürük bağışı için&gt; 5 bireyleri. Bağış önce önceki 2 saat içinde, su dışında, son 3 ay içinde ağızdan antibiyotik almış, ya da yiyecek veya sıvı tüketilen, herhangi bir tanımlayıcı bilgiler almak onlar hasta ise hiçbir bireyler tükürük bağışlayacak garanti etmeyin. Sa toplayın30 dakika içinde örnek olarak şunlar verilebilir. </li><li> Oda sıcaklığında 50 ml plastik tüpler içinde tükürük toplamak ve oda sıcaklığında plastik bir çanak içinde toplanan tükürük havuz. </li><li> % 25 gliserol, nihai oranı,% 75 hücre içeren tükürük [CCS] ile bir stok vermek üzere otoklava genel reaktif dereceli gliserol ile havuzlanmış tükürük seyreltin. </li><li> Gerekli olana kadar 3 mi tek kullanımlık parçalar halinde -80 ° C&#39;de tükürük dondurun. </li><li> Mikroakışkan sistemi aşılamak için gerekli olan zaman, tümbölenler aşağıdaki protokol aşama 3&#39;te tarif edildiği gibi mikro-akışkan sistemi pipetle edilmeden önce oda sıcaklığında çözülmüş ve 5 saniye boyunca bir vortexer hafifçe çalkalanır. </li></ol> Ağız Çok türler Biyofilmler 3. Büyüme <ol><li> CFS ön arıtma <ol><li> İlk kat CFS ile Bioflux mikroakışkan kanallar. Her bir prize CFS 100 ul ekleyin. Bioflux kontrol yazılımı kullanarak, kanallardan &quot;el&quot; ve set akışını seçin &quot;B1-B24&quot; thakullanılmaması gerekmektedir. </li><li> Daha sonra, 1.0 din / cm² kesme ayarlamak ve kanal boyunca CFS homojen dağılımını sağlamak için, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca akışını başlatmak. CFS eşit tüm kanallardan akan olduğunu doğrulamak için, her giriş kanalda sıvı olduğundan emin olun. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir plaka inkübe edin. </li><li> Çıkış kuyularda kalır CFS / ön işlem çözüm çıkarın ve giriş kuyuları transfer. 100 ul bu toplam hacim de çıkışından aşı uygulanan basınca karşı dengelemek için hizmet edecektir. </li></ol></li><li> Aşılama <ol><li> Her bir çıkışa, CCS inokulum 100 ul ekleyin. Tam 6 saniye boyunca 1.0 din / cm² giriş kuyuları (yani, ters) için mikroakışkan ısı plaka üzerinde plaka (sıcaklık 37 ° C olarak belirlenmiştir), kontrol yazılımı içinde seçme kılavuzu ve çıkış kuyulardan set akışını yerleştirin. </li><li> 40 dakika izin vermek için 37 ° C&#39;de mikro-akışkan plaka inkübeilk yapışkanlık ve aşı bakteri büyümesi için. </li></ol></li><li> Gece Büyüme <ol><li> Aşılanmış kanallar kullanılmak üzere, çıkış kuyuların her atık inokulum aspire. (Mevcut CFS üzerine yapılabilir) giriş deliklerinin her birine CFS 1 ml toplam hacme kadar ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de mikroakışkan plaka inkübe, manuel seçin ve 20 saat için 0.2 din / cm² çalıştırmak için programı ayarlayabilirsiniz. </li></ol></li><li> Leke ön yıkama <ol><li> Giriş ve çıkış kuyu sıvı aspire tüm ve giriş bölümlerinin her birine 100 ul PBS (pH 7.4) ilave edin. 0.2 din / cm² 20 dakika boyunca akış. </li></ol></li><li> Leke karışım ekleme <ol><li> Hücre canlılığı, boyama için boyanmış, her bir kanal için leke karışımı 100 ul yapmak. Özellikle, Syto 9 3 ul ve DEAD / CANLI gibi ticari hücre canlılığı boyama kiti kullanılarak PBS ml başına propidium iyodür 3 ul ekleyin. Bu üretir10 uM Syto 9 ve 60 uM propidyum iyodür içeren bir boyama karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> Giriş kuyulardan kalan PBS aspire ve sonra her bir girişine hücre canlılığı leke karışımı 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika için girişten çıkışa çözeltisi 0.2 din / cm2&#39;de akış ve çalıştırmak için ayarlayın. </li></ol></li><li> Post-boyama yıkama <ol><li> Giriş oyuğunun her birinde geri kalan leke aspire ve her bir giriş için PBS içinde 100 ul ilave edin. Herhangi bir Boya fazlasını uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca girişten çıkışa PBS çözeltisi 0.2 din / cm² akış ve çalıştırmak için ayarlar. </li></ol></li></ol> 4. Resim Koleksiyonu, 3D Rendering ve Görüntü Analizi <ol><li> Mikroakışkan sistemden biyofilm görüntü verilerini toplamak için bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanın. CLSM 150 gr ulaşabilirsiniz Bioflux plaka, ağırlığını dayanabilecek olduğundan emin olun. NOT: dime göz önüne alındığındamikroakışkan kanalları, biyofilm yapısını ayırt duyarlılık ihtiyacı ve gereksinimleri nsions, değişen yoğunluk floresan sinyali tespit 40X 1.25 NA objektif lens veya benzeri optik kalitesi, büyütme ve sayısal diyafram ile biri ile CLSM sığdırmak için. </li><li> Kazanç ile emisyon yakalama kapıları standardize ve ofset ölçümleri sabit tutulması. Bu fotoğraf beyazlatma neden olabilir lazer gücü% 25 geçmemesi emin olun. </li><li> Ben F Ile tipi EOM&#39;lu için (LIF) (Ey kalem M icroscopy E bütünlüklü) dosya türü mage L Eica gelen CLSM dosyalarını dönüştürün. Bu yazılım programları arasında erişim ve uyumluluk daha kolaylık sağlar. Bu tip dosyaları dönüştürmek için böyle Imaris, ticari olarak satılan yazılım kullanın. </li></ol> Görüntüler / Şekiller 3D Rendering <ol start="4"><li> Bir kez OME biçimine dönüştürülür, bu tür görüntüleri işlemek için Imaris ticari olarak satılan yazılım kullanın3D. &quot;Easy3D&quot; ve &quot;Aşmak&quot; seçenekleri bir arada kullanarak bu gerçekleştirin. NOT: Arka plan sinyali ve eşikleme dikkat yapılmalıdır. IMARIS histogram fonksiyonu toplama aralığı elde etmek için kullanılabilir ve resim analiz edilen arasındaki sabit tutulmalıdır. </li><li> &quot;Anlık&quot; fonksiyonunu kullanarak görüntüleri kaydetme ve dosya türlerini kaydetmeden önce görüntü çözünürlüğü dikkatli bir değerlendirme yapmak. </li><li> Böyle CorelDraw veya Adobe Illustrator gibi bir görüntü düzenleme yazılımını kullanarak rakamlara içine görüntüleri birleştirin. </li></ol> Grafikler ve Tablolar 3D Görüntü Analizi <ol start="7"><li> Görüntü analizi için ImageJ 23 ve COMSTAT / COMSTAT2 38 serbestçe kullanılabilir kullanın. Sırasıyla, http://rsb.info.nih.gov/ij/ ve http://comstat.dk/ paketleri indirin. En son Java güncellemesi yüklü var. NOT: Yazılım platformu JAVA Prio yüklü olması gerekmektedirGörüntü analiz yazılımı kullanımı r. <ol><li> &quot;Bölünmüş kanalları&quot; ile &quot;hyperstack&quot; modunda ve görünümünde her biyofilm görüntü için OME dosyaları almak için COMSTAT2 eklentisi ile ImageJ yazılımını kullanın. </li><li> Bireysel iki kanal ImageJ &quot;histogram&quot; fonksiyonunu kullanarak (kırmızı / propidyum-iyodür / ölü olmak kanalı 0, yeşil / Syto-9 / CANLI olmak kanalı 1) analiz. Bu fonksiyon, herhangi bir sinyal (arka plan) ile 0 olan piksel ve 255 varlığıyla, (&quot;değer&quot; olarak gösterilen) 0-255 her renk yoğunluğunda (&quot;sayısı&quot; olarak gösterilen) 8-bitlik OME dosyalarının toplam piksel sayısını listeler tam sinyal doygunluğu ile piksel. </li><li> Bir elektronik tablo programı içine veri ihracat ve ilgili sinyal yoğunluğu her pikseli ağırlıklandırılarak tüm sinyal değerleri standardize. Bu durum, sinyal yoğunluğu sayısal 8-bit değeri (0-255), belirli bir sinyal yoğunluğu toplam sayısı ile çarpılarak gerçekleştirilir. </li><li> Yakalanan her biyofilm görüntü için her iki kanal için, tüm ağırlıklı değerler, 0-255 toplamı. Her iki kanaldan yüzde toplam sinyalini belirlemek için her iki kanal için ağırlıklı değerlerin toplamını alın. Kırmızı ve yeşil yüzde sinyali (yüzde &quot;ÖLÜ&quot; ve yüzde her tedavi için &quot;CANLI&quot; yani) göreceli oranı veya yüzde belirlemek için bunu yapın. </li><li> Eşitsiz varyans için modifiye iki-kuyruklu Student T-testi kullanılarak, örneğin, istatistiksel analizler gerçekleştirin. P &lt;0.05 değerleri anlamlı kabul edilir ve p &lt;0.01, bu değerler son derece önemli olarak kabul edilir. </li></ol></li></ol> Kültür-bağımsız Analizi 5. Hasat Biyofilm Hücreler <ol start="1"><li> Giriş ve çıkış kuyulardan tüm geçirdi ve kullanılmayan tükürük çıkarın. 1 ml steril damıtılmış su ile üç kez kuyu yıkayın. </li><li> Yazılım kontrol arayüzünü kullanarak, giriş çukurlara steril damıtılmış su, 100 ul ilave edin ve pass&gt; 8.0 din / cm2&#39;de kanallardan ileri steril damıtılmış su (800 sn arasında, kesme hızı&gt; 745 ul / saat akış -1), en azından 5 dakika boyunca. En az 5 dakika ters yönde tekrarlayın ve sonra ileri tekrarlayın ve yıkama aşaması süreci tersine. </li><li> Kapsamlı biyofilm kaldırılması (Şekil 2) için (hücreler boyandı eğer / etiketli) ışıkla veya Epifloresans mikroskobu ile kontrol edin. Kültür bağımsız analiz için -80 ° C&#39;de, 100 ul hücre süspansiyonu ve mağaza toplayın. Yorumu bileşimin maliyetli bir analiz Nance et al yaklaşım kullanılarak bakteriyel etiket kodlanmış FLX amplikon, piro sıralamadır (bTEFAP) kullanarak yoluyla elde edilebilir. 20 </li></ol>

<ol>
	<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li><li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metropolis.">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li><li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+ruin:+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms.">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms:+how+could+antibacterial+therapy+be+effective.">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li><li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities.">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).</li><li>Smith, H., Smith, H., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. , 1-29 (1964).</li><li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities,+development+and+treatment.">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li><li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+In+vitro+biofilm+models:+an+overview.">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li><li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases.">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li><li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer.">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel.">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li><li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation.">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li><li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation.">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance.">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li><li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+validity+of+models.">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li><li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media.">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li><li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials.">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li><li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li><li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data.">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms.">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology.">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li><li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation.">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li><li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems.">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li><li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell.">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li><li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms.">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li><li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer+2:+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth).">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li><li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model.">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li><li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+sequence+typing+at+the+speed+of+light.">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li><li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+diagnostics:+molecular+analysis+of+oral+biofilms.">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li><li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+biofilms:+emerging+concepts+in+microbial+ecology.">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics:+concepts,+tools,+and+recent+advances.">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li><li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Bu yöntem, kağıt kurulumu için gerekli olan temel adımları vurgular ve toplanmış insan tükürük elde edilir ve filtre ile sterilize edilmiş% 25 toplanmış insan tükürük yetiştirilen ağızdan çok tür biyofilm geliştirilmesine olanak sağlayacak şekilde, bir mikro-akışkan sistemi çalıştırmak. Biyofilm karakterize Yaklaşımlar verilir ama bu tarif yaklaşımlar, örneğin, lekeler veya etiket sokulabilir, gibi değiştirilebilir ve ek teknolojiler olduğu unutulmamalıdır. Örneğin bir mesele ...

<html> Biyofilm mimari yüzeylerde 1 toplanır bakteri karmaşık topluluklar vardır. Bu topluluklar genellikle biyofilm 2 içinde birbirleriyle etkileşim sayısız türler içerirler. Sözlü biyofilm, görsel açıdan en göze çarpan olmak dental plak, bir insanlarda kalıcı bir sorun ve taksonomik çeşitli çoklu-tür toplulukların 3 nesil onların kontrolsüz gelişim sonuçları. Bu farklı toplulukların bileşeni bakteri serbest-yüzen (plankton) karşıtları 4-6 den antibiyotiklere daha dirençli 1.000 kata kadar olabilir. ABD&#39;de yılda dişçi ofisine 500 milyon ziyaretleri ve yaklaşık 108.000.000.000 $ tedavi veya periodontal önlemek için: Diş çürüğü ve periodontal hastalığa neden olabilir bu oral biyofilm topluluklar, tedavi edilmemesi, önemli bir halk sağlığı yükü sonuçlandı Hastalık ve diş çürükleri 7. zorlukları aşmak için kendi moral sürekli laboratuvar kültürleri ile çalışma çekici kolaylığı. &quot;8 -Smith yıktığı çünkü içeriği&quot;&gt; &quot;Birçok mikrobiyologlar, doğal koşullar altında mikrobiyal davranışı okuyan savunurken, bunların birkaç bunu. budur. Şu anda, sözlü biyofilm araştırma in vivo ve in vitro yaklaşımlar kullanarak çeşitli yapılır, kendi avantajları ve dezavantajları her 9,10. In vitro sık sık kurmak nispeten kolaydır ancak klinik olmayabilir modeli biyofilm sistemleri kullanmak yaklaşımlar / gerçek dünya alaka 10,11. in vivo yaklaşımlar genellikle insan ağız ortamında bazı yönlerini yeniden, ama yine sınırlamalar muzdarip nedeniyle hayvanlar arasındaki anatomi, fizyoloji, mikrobiyoloji ve immünoloji farklılıkları ve 12 insanlarda olabilir hayvan modeli sistemleri üzerine güveniyor, 13. Oral biyofilm unutulmamalıdırinsan gönüllülerin ağzından içinde stent düzenlenen emaye yüzeyler üzerinde geliştirilen, ancak bu yaklaşım halen nispeten pahalı ve emek-yoğun 14,15 olduğunu olabilir. Sonuçta, yeni ajanlar veya ağız sağlığı iyileştirmek için teknolojiler kontrollü klinik çalışma koşulları altında 11 insanlarda test edilir. Şu anda, yeni oral sağlık maddeleri tanımlamak ve değerlendirmek için sık sık kullanılan tarz operandi ilk laboratuvar çalışmaları, potansiyel etkinliği ayırt, ve sonra hayvan çalışmaları ve teknoloji 9 başarısını değerlendirmek için klinisyenlerin istihdam &quot;alan denemeleri&quot; gerçekleştirmek için gerçekleştirmek için, 16,17. Ne yazık ki, laboratuar çalışmaları büyük bir ayak izi işgal model sistemler güvenmek eğilimindedir, kullanmak için teknolojik zorlu ve genellikle 10,18 anlam potansiyeli gerçek dünyayı elde etmek için bir kaç türün biri ya da en toplulukları basitleştirilmiş içerir. Dental plak biyofilm bir compl birden türleri ve formu içerdiğini göz önüne alındığındaEski yapay ortam gerçek dünya senaryo 10,19 olanlara benzer bir şekilde davranan toplulukları oluşturmak için olası bir tane içeren biyofilm veya birkaç tür geliştirme, tükürük ortam dökülür. Zaman, maliyet, eğitim ihtiyaçlarını ve gerçek dünya ortamına göre laboratuar modeli biyofilm sistemlerinin zayıf temsilcisi doğasını ele almak için, biz son zamanlarda yüksek verim ve çevre germane biyofilm sistemi 20 (Şekil 1) geliştirdi. Bir aşı olarak orta ve muamele edilmemiş bir araya toplanmış insan bakteriyel hücre içeren tükürük (CCS) olarak hücre içermeyen havuzlanmış insan tükürük (CFS) kullanımı sistem yararlanır. Benzersiz, sistem aynı zamanda mikroakışkan teknoloji, bir konfokal lazer tarama mikroskobu ve kültür-bağımsız bakteriyel çeşitlilik analizi teknolojisini birleştiriyor. Böylece, model sistem bir inokulum 37 çoklu-tür biyofilm büyümeye olarak çevre germane (kullanarak tükürük olduğunu Filtre ve sterilize edilen akan C °tükürük) ve oral biyofilm erken supragingival plak 20 bulunanlara bolluğu temsilcisi Streptococcus, Neisseria, Veillonella ve Porphyromonas türler de dahil olmak üzere türler () içerirler. Bu çalışma, yeni geliştirilen model sisteminin kullanımını açıklayan dikkate alındığında, özellikle dikkat konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) Mikroakiskan birleşmesi ve kültür-bağımsız çeşitlilik analizi teknolojileri verilmelidir. Bizim araştırma grubu tarafından bu teknolojilerin sendika kasıtlı ve sadece yeni geliştirilen model sistem için yüksek verimli yeteneği ekler, ama aynı zamanda sorular kolayca diğer sistemlerle daha önce ele olamazdı sordu sağlar. Bu biyofilm üç boyutlu analiz için izin verir İlk olarak, CLSM geleneksel mikroskobu üzerinde belirgin avantajları vardır. Biyofilm heterojen zekâ gibi Genellikle hesaba katılmayan, bu son derece önemlidirh tür kompozisyonu ve mekansal konumuna saygı yanı sıra fizyolojik koşullar biyofilm 6,21 içinde farklı mekansal yerlerde empoze ediliyor. Üç-boyutlu render yazılım ve görüntü analiz yazılımı, biyofilm mimarisi, bileşen türler arasındaki mekansal ilişkiler ve antimikrobiyal öldürme ölçüde uyum içinde 22-24 analiz edilebilir. Bu tür özellikler standart iletilen ışık veya Epifloresans mikroskopi kullanılarak mümkün değildir. Dikkatle kontrollü koşullar (akış, sıcaklık, pH, vb) kapsamında biyofilm çalışma sağlar ve sadece sıvı 25-27 küçük hacimlerde gerektirir Sonraki, Mikroakiskan mikrobiyoloji alanında özellikle dikkat çekmiştir. Bu elde edildiği gibi bir karşılaştırma noktası olarak, benzer bir akış hızı ve kesme kuvveti ile, 20 saat için bir akış hücresi modeli sistemi (muhtemelen bir çok ağız biyofilm çalışmaları için dayanak modeli olarak kabul edilir bir sistem) içinde, insan tükürük bir oral biyofilm büyüyenmikroakışkan cihaz 28-31 800 ul karşı bir mikro-akışkan sisteminde, en az 200 ml gerektirir. Böylece, bir mikroakışkan bir model biyofilm sistemi tanımlanmış koşullar altında miktarı sınırlı malzemenin çalışma sağlar. Son olarak, Pyrosequencing teknoloji bir topluluk analizi gerçekleştirmek için malzeme sadece küçük miktarlarda ihtiyaç için son on yılda optimize ve hatta nadir biyofilm türlerinin kimliğini elde etmek için dizilim derinliğini kontrol etmek yeterince çok yönlü olmuştur. Bu tür bakteri etiket kodlanmış FLX amplikonu Pyrosequencing (bTEFAP) olarak bu teknolojinin kullanımı, biyofilm ekolojisi ile ilgili ilgili sorular için izin verdi 32,33 ele alınması. Bu tür sorular Pyrosequencing çünkü zaman ve plazmid kütüphaneleri ve veri 33,34 türetmek için gerekli olan karmaşık teknolojik ve analitik adımları oluşturmak için gerekli maliyetlerin mevcut değildi geçmişte zorluklar aşılanmış. Kültür bağımsız ap ile Tabii ki, büyük bir avantajörneğin, piro sıralamadır gibi yaklaşımlar çok, geleneksel laboratuar ortamı (örneğin, canlı fakat sınırlayıcı olmayan bir ekilebilir türler) içinde ayrı olarak büyüyemez bakteri türleri büyütüldü ve tanımlanan model sistem camia içinde göreli bolluk, 36 35 sayısal edilebilmesidir . Gibi erken 1963 olarak perspektif eklemek için, merhum Sigmund Socransky insan oral dişeti çatlak izole malzeme bakterilerin yaklaşık% 50 laboratuvar büyüme koşulları 37 kullanılarak kültür olamazdı tahmin. Bu yöntemler makalenin amacı altında piyasada mevcut mikroakışkan (Bioflux) sistemde oral çok tür biyofilm geliştirmek yaklaşımı tanımlamak için: (i) koşullar, insan oral kavite temsilcisi ve (ii) tür kompozisyonu ve bolluğu ile bu supragingival plak karşılaştırılabilir. Ayrıca, hem ücretsiz ve ticari yazılım kullanarak, biz nasıl temel biyofilm vurgulamakmimari önlemler biyofilm biyokütle, pürüzleri ve canlılığı ölçmek için yaklaşımlar odaklanarak, CLSM verilerinden elde edilebilir (Canlı / Ölü boyama dayalı). Son olarak, bTEFAP tarafından çeşitlilik analizi için biyofilm malzeme hasat için gerekli adımlar anlatılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ultracentrifuge&amp;nbsp; (SS-34 compatible)</td><td>Thermoscientific</td><td>Unit-dependent</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific SS-34 Rotor&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>28-020</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td><td>Thermo&amp;nbsp; Scientific Inc</td><td>23-290-065</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td><td>VWR</td><td>73520-986&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>NC0542269</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux microfluidic system</td><td>Fluxion</td><td>Bioflux 200 system</td><td></td></tr><tr><td>Bioflux 24-channel plate</td><td>Fluxion</td><td>910-0004</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Lecia</td><td>SPE or eqivalent system</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence Microscope</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Pyrosequencing facilities</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Temperature Freezer -80&amp;nbsp;&amp;deg;C</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Tips (20, 200, and 1,000&amp;nbsp;&amp;#956;l)</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 &amp;#956;l)</td><td>Multiple choices</td><td>Multiple choices</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bioflux dedicated software</td><td>Bioflux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SPE</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSTAT/COMSTAT 2</td><td>Freeware (http://www.comstat.dk/)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Yaygın in vivo sözlü biyofilm içinde tespit sayısız türler içeren çok tür biyofilm gelişimi kolaylaştırmak in vitro sistemlerde birkaç yüksek verimli vardır. Bundan başka, bunun yerine yapay ortam, besin kaynağı olarak, doğal insan tükürük kullanan bir sistem olup, in vivo toplulukları taklit hücresel ve biyofilm özgü özellikleri ekspresyonunu desteklemek için özellikle tercih edilir. İnsan ağız boşluğu benzer koşullar altında, diş plakları supragingival için, tür kompozisyonu ile ilgili olarak, karşılaştırılabilir çok türleri, oral biyofilm geliştirilmesi için bir yöntem tarif eder. Özellikle, bu yöntemler makale piyasada mevcut mikroakışkan sistem türetilen çoklu türler sözlü biyofilm gelişimi kolaylaştırmak için uyarlanmış ve toplanmış tükürük içinde yetiştirilen nasıl anlatacağız. Ayrıca, ne sistemin bir açıklama confoca ile bağlantılı olarak da kullanılabilirl lazer tarama mikroskobu sunulacak mimari ve canlılık analizler için 3-D biyofilm yeniden inşa üretir. (Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella ve Porphyromonas dahil) mikroakışkan sistemde biyofilm içinde büyümek mikroorganizmaların geniş çeşitliliği dikkate alındığında, bir protokol ayrıca alt kültür veya DNA ekstraksiyon ve analiz için biyofilm hücreleri hasat nasıl açıklayan sunulacak. mikroakışkan biyofilm sistemi ve mevcut devlet-sanat veri analizleri, hem sınırları ele alınacaktır. Sonuçta, bu makalede, oral biyofilm çalışma artırmak ve mikroakışkan platformu ile entegre edilebilir ek teknolojilerin geliştirilmesine yardımcı olacak bir temel teknik sağlayacağı öngörülmektedir.

Biyofilmler 3D Rendering Temsilcisi sonuçları Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. IMARIS yazılım yararlı bir araç toplanan biyofilm yığının her dilim incelemek ve onları üç boyutlu rekonstrüksiyon oluşturmak için birleştirmek için bir seçenektir. Buna ek olarak, yapay gölgeleme etkisi görsel olarak yardımcı üç-boyutlu yapılara yorumlamak için ilave edilebilir. işlenen biyofilm biyofilm ya da mikro-koloni yapısı keşfetmek...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms at JoVE.com

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K Görüntüleme.  The University of Michigan.  Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için. 

Video: Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Biyomühendislik

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biyokimya

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

A Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media

Bacterial biofilms are found in several environmental and industrial porous media, including soils and filtration membranes. Biofilms grow under certain flow conditions and can clog pores, thereby redirecting the local fluid flow. The ability of biofilms to clog pores, the so-called bioclogging, can have a tremendous effect on the local permeability of the porous medium, creating a pressure buildup in the system, and impacting the mass flow through it. To understand the interplay between biofilm growth and fluid flow under different physical conditions (e.g., at different flow velocities and pore sizes), in the present study, a microfluidic platform is developed to visualize biofilm development using a microscope under externally-imposed, controlled physical conditions. The biofilm-induced pressure buildup in the porous medium can be measured simultaneously using pressure sensors and, later, correlated with the surface coverage of the biofilm. The presented platform provides a baseline for a systematic approach to investigate bioclogging caused by biofilms in porous media under flow conditions and can be adapted to studying environmental isolates or multispecies biofilms.

The present protocol describes a microfluidic platform to study biofilm development in quasi-2D porous media by combining high-resolution microscopy imaging with simultaneous pressure difference measurements. The platform quantifies the influence of pore size and fluid flow rates in porous media on bioclogging.

Gözenekli Ortamlarda Biyotıkanıklığı İncelemek için Mikroakışkan Bir Platform

Bacterial biofilms are found in several environmental and industrial porous media, including soils and filtration membranes. Biofilms grow under certain ...

Çevre

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Yüksek verimli bir kullanımı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler