Name: comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

Besleme Bakterilerin 1. Hazırlık NOT: Bu kısım besleme bakteri (E. coli OP50) hazırlanmasını anlatır. <ol><li> E. tek bir koloni yalıtmak aseptik olarak lizojeni suyu (LB) agar plakadan coli soy OP50 otoklave LB suyu 300 ml içine inoküle. </li><li> Doygunluğa ulaşıncaya kadar inoküle kültür, 200 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de bir çalkalayıcı içinde gece boyunca büyümeye izin verin. </li><li> 6, steril, önceden tartılmış 50 ml konik tüp içine OP50 aktarın. 6000 rpm&#39;de (5000 x g) 5 dakika boyunca santrifüj ile bakteriler Pelet. </li><li> Süpernatantı atın ve steril M9 50 ml bakteri yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra hiçbir M9 tüp bırakılırsa sağlamak, kalan M9 kaldırın. </li><li> Bakteriler pellet içeren tüp tartılarak pelet ağırlığı belirlemek ve 50 ml konik tüp ağırlığı çıkarılır. </li><li> Pelet i yeniden süspansen, M9, 100 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir. </li><li> Solucan kültürü için kullanılana kadar 4 ° C &#39;de OP50 çözeltisi saklayın. </li></ol> Nematod Büyüme Orta (NGM) Petri Tabaklar 2. Hazırlık NOT: Bu kısım plakaları C olan NGM Petri kapları hazırlanmasını tarif etmektedir elegans solucanlar rutin laboratuvarda muhafaza edilir. <ol><li> NGM agar ortamı otoklava. </li><li> Steril prosedürler kullanılarak, bir peristaltik pompa kullanılarak 6 cm Petri kapları içine NGM agar çözeltisi 17 ml dağıtmak. NOT: plakalarda agar sabit bir miktarının bir plaka geçerken mikroskop refocusing ihtiyacını azaltır. </li><li> Ağarı katılaştırmak izin ve fazla nemin buharlaşmasını sağlamak için kullanımdan önce, 2-3 gün süre ile, oda sıcaklığında plakalar bırakın. </li><li> Steril tekniği kullanarak NGM plakaları Tohum. OP50 sıvı kültürü 1-2 damla uygulayın ve bir cam çubuk kullanarak yayılır. Emin olun değilplakaların kenarlarına bakteri çim tüm yol yaymak için. </li><li> OP50 çim solucanlar büyümeye plakaları kullanılarak önce oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca büyümeye izin verin. </li></ol> Bir Senkron Worm Nüfus 3. Hazırlık NOT: C. yaşam döngüsü elegans embriyonik aşamada, dört larva evreleri (L1-L4) ve yetişkinlik oluşur. Bu bölüm, solucanlar yaşa senkron nüfusun hazırlanmasını tarif etmektedir. Ağartma işleminin ardından C.elegans ile temas eden bütün maddeler steril olması gerekmektedir. <ol><li> Gün 1 - Hamile Worm Nüfus hazırlanması <ol><li> Solucan nüfusunun çoğunluğu starved L1 larva oluşur hangi NGM tabak kullanın. </li><li> Steril bir solucan L1 larva almak toplayın ve taze 6 cm NGM plakalar aktarabilirsiniz OP50 ile ekildi. Solucanların çoğunluğu gebe yetişkin kadar 20 ° C&#39;de yaklaşık 65 saat süre ile inkübe edilir. Içinplaka aşırı kalabalık önlemek ve her yeni NGM plaka L1 larvaların fazla bir veya iki küme aktarmak değil, solucanlar bakteri tüketmeden büyümeye izin. </li></ol></li><li> 4. Gün - Bir Senkronize L1 Larva Nüfus kurulması <ol><li> M9 1-2 ml ile yıkayarak NGM plakaları gebe solucanları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Gebe solucanlar yaklaşık 5-10 dakika için 15 ml konik tüp altına sediment edelim. Solucan pelet bozmadan süpernatantı. </li><li> 2-4 mikrosantrifüj tüplerine solucan pelet aktarın ve ağartma maddesi / NaOH çözeltisi 1 ml. Oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Tüm solucanlar öldü onaylamak için stereomicroscope altında reaksiyonun ilerlemesini izleyin. Embriyolar ölebilir gibi daha uzun 5 dakika çamaşır suyu yok. </li><li> 3000 rpm&#39;de (900 x g), 1 dakika süreyle santrifüjlenerek solucanları toplayın. Süpernatantı ve steril M9 1 ml ekleyinTepkimeyi nötrleştirmek. </li><li> 3000 rpm&#39;de (900 x g), 1 dakika için santrifüjleme ile iki kere solucanlar yıkayın. </li><li> Süpernatantı ve en fazla 100-200 ul M9 ekleyin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti solucanın bir damla ekleyin kullanma / M9 embriyolar yumurtadan izin 20 ° C&#39;de en az 24 saat süreyle bunları NGM plakaları temizlemek ve inkübe karıştırın. NOT: Gıda olmadan larvaları büyüme L1 aşamada durdurulur. </li></ol></li><li> Gün 5 - Senkronize L4 larvaları Nüfus kurulması <ol><li> M9 1-2 ml plakaları yıkayarak açık NGM plakaları L1 larvaları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Yaklaşık olarak 5 dakika boyunca 15 ml konik tüp alt ölü büyütülmüştür tortu olsun. </li><li> Yeni bir konik 15 ml tüp içinde L1 solucanlar süpernatant, toplamak ve 2600 rpm&#39;de (1000 x g), 2 dakika süreyle santrifüjlenerek solucanlar çökeltilmesi. </li><li> Süpernatant le kaldıryaklaşık 500 ul aving. </li><li> Bir stereomikroskop kullanılarak damla 10 ml içinde solucanlar sayısının sayılmasıyla M9 çözeltisi solucan konsantrasyonunun belirlenmesi. En az 5 damla sayın. </li><li> 20-25 solucanlar / ul solucanlar konsantrasyonu ayarlayın ve OP50 ile seribaşı NGM plakalar solucan / M9 karışımı 50 ul ekleyin. </li><li> Onlar L4 sahne ulaşana kadar L1 senkronize nüfus büyümeye izin (hafta sonuna kadar inkübasyon için) 15 ° C&#39;de 65 saat inkübe. </li></ol></li></ol> 96 oyuklu plakalar içerisinde Chemicals Worms 4. maruz NOT: Bu bölümde Pxol1 kullanımını açıklar :: C içeren GFP transkripsiyonel muhabiri C. elegans suşu anöploidinin uyarılması için taranmaktadır. <ol><li> M9 1-2 ml plakaları yıkayarak açık NGM plakaları L4 larvaları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Altına L4 solucanlar tortu Let15 mi, yaklaşık 5-10 dakika boyunca konik boru. Solucan pelet bozmadan süpernatantı. </li><li> M9 3-5 mi ekleyin ve bir stereo mikroskop kullanarak damla 10 ml içinde solucanlar sayısının sayılmasıyla M9 çözeltisi solucan konsantrasyonunu belirler. Her bir numune için en az 5 damla sayın. </li><li> M9 1000 solucanlar / ml&#39;lik bir konsantrasyonda yeniden süspanse solucanlar. </li><li> Bölüm 1 OP50 bakteri sulandırmak M9 ile 10 kat. Alt sıcaklık solucan gelişimini etkiler, çünkü yeniden süspanse bakteriler oda sıcaklığına ulaşmasını emin olun. </li><li> İlk (aşama 4,4) sonsuz / M9 karışımı, 100 ul ve ardından 2 ml derin, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakanın her oyuğuna (adım 4.5 den) ile seyreltildi OP50 bakteri 400 ul, bir çok kanallı pipet kullanarak. Sonunda, her bir çukura 500 ul, 100 solucanlar olacaktır. </li><li> Önerilen son Concentr ulaşmak için, istenen kuyulara test kimyasal veya uygun denetim ya 0.5 ul ekle100 mcM tirme, bir konsantrasyon yaygın C kimyasal ekranlarında kullanılan elegans 12. % 0.1 bir son konsantrasyonda etanol ya da DMSO çözücü kontrol Açığa. NOT: Pozitif kontrol olarak nokodazolun (100 mcM) kullanılmasını tavsiye ederiz. </li><li> Yapışkan film kullanarak plaka Seal. Kuyular arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için plaka mühür emin olun. </li><li> Alüminyum folyo ile plaka sarın. </li><li> Zaman uygun uzunlukta (24 veya 65 saat) için uygun sıcaklıkta bir çalkalayıcı (170-180 rpm) plaka aktarın. oda sıcaklığı solucan büyümesini etkiler; yaklaşık 20 ° C sıcaklığı muhafaza. </li></ol> Bir 384-oyuklu bir plaka içerisinde Hamile Worms 5. Görüntü Alma NOT: Bu bölüm, ergin hermafrodit bireyler rahim içinde embriyo GFP tanımının görüntülenmesi için, görüntü maruz Pxol1 :: GFP solucanlar içeriği yüksek mikroskop kullanımını tarif eder. IçinHer 384 oyuklu plaka elenecek, 4 x 96-delikli plakadan solucanlar kullanır. <ol><li> Çalkalayıcı kimyasal maruz bırakıldıktan sonra, 10-15 dakika boyunca 96 gözlü plaka kalan büyütülmüştür plakasının tabanına kadar tortu izin sağlar. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plakanın alt solucanlar rahatsız etmemek için çok dikkatli olmak, M9 350 ul kaldırın. </li><li> M9 1 ml ve tekrar adım 5.1 ile solucanlar yıkayın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plakanın alt solucanlar rahatsız etmemek için vey dikkat ederek, M9 1 ml çıkarın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, geri kalan M9 solucanlar tekrar süspansiyon ve 96 oyuklu plakalar solucan / M9 karışımı 100 ul toplamak ve siyah bir duvar / şeffaf tabanlı 384-kuyucuklu plak kuyu içine yükleyin. 384-kuyulu plakanın tüm kaynaklar yüklü kadar, 4 x 96-delikli plakadan solucanlar kullanarak tekrarlayın. NOT: Bu önemlidir arttırmak için bütün bölümler aynı hacmi içingörüntü elde etme sürecinde verimlilik ve otofokus hızı. Her iyi 80 ila 100 solucanlar arasında içermelidir. </li><li> Her bir oyuğa, levamizol (100 uM), 1 ul ekle ve solucanlar yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe edin. Not: Levamisole bir asetilkolin reseptörü agonisti olarak görev yapar ve solucan hareketsiz. </li><li> Otomatik görüntüleme sağlayabilen bir widefield içeriği yüksek mikroskop plaka aktarın. </li><li> Görüntü elde etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir içeriği yüksek görüntü elde etme ve analiz yazılımı kullanmak. Kuyu başına 1 görüntü elde etmek 4X hedefi seçin. </li><li> Görüntü elde etme başlamadan önce, 2160 x 2,160 maruz ve görüntü çözünürlüğü 45 msn GFP görüntüleme parametrelerini ayarlamak. </li><li> Kuyudaki solucanlar toplam sayısına bölünmesiyle GFP pozitif solucanlar sayısı gibi verileri toplayın, ikinci ölçü kuyuları arasında nispeten tutarlı olmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada anlatılan yöntem germlıne Toksik maddelerin belirlenmesi için ilk büyük ölçekli stratejisini oluşturmaktadır. Bu sadakatle germ disfonksiyon için bir vekil olarak kullanılan erken embriyolar anöploidi indüksiyon raporları GFP transgenik Pxol-1 :: GFP içeren suşu kullanımını gerektirir. yöntem, bir C dikkat senkronizasyon gerektirir elegans solucan nüfus ve otomatik yüksek içerik mikroskobu ile GFP pozitif solucanlar görüntüleme ardından 96 kuyulu formatta kim...

Amerika Birleşik Devletleri ticaret için kayıtlı yaklaşık 87,000 kimyasallar, bu potansiyel sağlık etkileri 1 için test edilmiştir henüz sadece az sayıda bulunmaktadır. Test edilmiş olanların, sadece bir kısmı özellikle kadın germ hücre gelişimi ve farklılaşması sırasında memelilerde erken üreme olayların değişiklik belirlenmesinde zorluk nedeniyle kısmen üreme sağlığı etkileri için değerlendirilmiştir. Gerçekten de, birinci öz değişmesine ait olaylar dişi memelilerde embriyonik gelişiminin erken evrelerinde yer alan ve dolayısıyla erişim ve tarama amaçları için uygun sayıda toplama zordur. germ kuşaklar arasındaki önemli bağlantıyı sağlar, ve uygun fonksiyon hücresel ve kromozomal bölünme karmaşık programın kesin yürütme mayoz olarak adlandırılan bağlıdır. Öz değişmesine ait işlemin bozulması fertilite düşüklüğü ve üretimi ile sonuçlanabilirkromozom anormal sayıda gamet ve embriyo, bir durum anöploidi olarak adlandırılan. Mayoz kromozom ayrımı hataları insan sağlığı için son derece önemlidir. Kromozom anomalileri 1 150 canlı doğumda sıklığı, Trizomi 21, 18 ve 13 gibi en yaygın türleri 2,3 olan X ve Y kromozomu hataları ile, yaygındır. Ayrıca, kromozomal kökenli olanlar dahil olmak üzere, konjenital malformasyonlar, ABD 4 çevresel etkiler kromozomal ayrımı ve davranışlarını etkileyebilir fikri bebek ölüm önde gelen nedenidir 5 yeni değil, ama yine de tam olarak anlaşılamamıştır. İnsan doğurganlık, erken gelişim ve genel üreme sağlığı engellemesini çevremiz içine kimyasalların hangi araştırmak için bu nedenle çok önemlidir. Memeli modelleri, bu sınırlamaları sebebi olarak, &lt;yuvarlak kurt üreme toksisitesini test etmek amacıyla yüksek verimli bir ekran deneyi geliştirdikem&gt; C. elegans. Biz küçük boyutu, düşük maliyet, kısa üreme döngüsü, germ hücrelerinin yüksek oranda ve manipülasyon 6 kolaylığı olarak bu yaygın olarak kullanılan genetik model sistem tarafından sunulan birçok önemli özelliği seferber ettik. Solucanlar 96-oluklu plaka ya da yüksek hacimli sıvı kültürlerde yetiştirilebilir ve bu nedenle şeffaflığının doğrudan fluoresan muhabir saptanması için plakalar üzerinde görüntülenebilir. Aşağıda tarif edilen deney, bu özelliklerin avantajının ortaya germline bozulması ve embriyonik anöploidisi uyarılmasını tespit etmek için flüoresan raportör Pxol-1 :: GFP ihtiva eden bir sonsuz soyunun yararlanır. Bu muhabir gerginlik kullanımı esas hermafroditik solucan nüfus erkeklerin genellikle nadir görülmesi dayanmaktadır. Bu erkek (&lt;% 0.2) doğal X kromozomu 7 ayrılığı içinde hatasından kaynaklanmaktadır. Ancak, germ bozulma sık otozomal ayrılığı hatalara yol açarve heterochromosomes nedeniyle, erkek fenotip (X missegregation) yanı sıra, embriyonik öldürücülüğü (autosome missegregation) olarak yükseltilmiş bir oranı ile, her iki ilişkilidir. Embriyonik öldürücülük sorunu engellemeyi kolay kolay erkeklerde uyarılmasını tespit etmek için, bir erkek-özgü promoteri (xol-1), yine de, solucanların rahim içinde bulunan erken embriyolar GFP ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu nedenle, GFP ifade embriyo görünümü anöploid embriyoların varlığı için bir vekil olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem, daha önce germlin bakım ve mayoz 8,9 karışmış genleri tanımlamak için kullanılır olmuştur. Kimyasal tarama Uyarlanmış, bu suş yüksek verimli ekranına bir ortamda kullanılır. Önemlisi, gerilme sadakatle kimyasalların aneugenicity raporları ve memeli üreme uç noktalara 10 nedenle alakalı. Burada anlatılan tahlil seyir ilaç ve kimya sanayi ayarlarında toksikoloji özellikle yararlı olacaktırhızla üreme uç noktaları yönelik kimyasalların toksisite değerlendirmek için. Ayrıca, bu deney tamamen 21. yüzyıl raporunda 11 Toksik vurgulanan devlet öncelikleri ile aynı hizaya.

<table><tbody><tr><td>60 mm Vented, sharp edge Petri dishes</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 well plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisole hydrochloride</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress High Content Image Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rayon films for biological cultures</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.</td></tr><tr><td>TY2441 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;, &lt;em&gt;Pxol-1::GFP&lt;/em&gt; reporter strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

Çevremizde bulunan kimyasalların binlerce üreme toksisitesinin belirlenmesi, çevre sağlığı alanında en kabartan zorluklardan biri olmuştur. Bu omurgalı hayvanların yüksek sayıda ihtiyaç duymadan, (1) doğru (2) yüksek verimli moda bir orta bunu yapmak üreme süreçlerinin tuşları özelliklerini özetlemek ve edebilirsiniz model sistemler azlığı kısmen kaynaklanmaktadır. Biz nematod C. burada bir tahlil açıklamak Anöploid embriyoların indüksiyon izleyerek germlıne Toksik maddelerin hızla belirlenmesini sağlar elegans. GFP muhabiri hattının kullanımı yaparak, germ bozulma kaynaklanan kromozom ayrımı hataları kolayca görülebilir ve otomatik floresan mikroskobu ile ölçülebilir. Böylece toksisitesi bileşiklerin özel bir dizi tarama birkaç gün içinde bir 96- 384-kuyucuklu bir plaka biçiminde gerçekleştirilebilir. Pozitif h ikincil analizionun kromozom anomalileri mayoz bozulma veya erken embriyonik kromozom ayrımı hataları kaynaklanan olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Tamamen, bu deney, kimyasal maruziyet aşağıdaki germlıne disfonksiyonu hızlı değerlendirilmesi için hızlı ilk geçiş stratejisini temsil eder.

Gibi mikrotübül zehir nokodazol gibi kimyasal ajanlara Pxol-1 :: GFP raportör soyunun maruz (Şekil 1) DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında açık ergin hermafrodit bireyler rahmine GFP ifade oğulcukların yüksek bir oranda, indüklenmesine yol açacaktır. GFP pozitif embriyolar diğer embriyolar hem de hayvan bağırsağında görülen bir oto-floresan gözlenen zayıf eşiğe göre belirgin parlaktır. Maruz solucanlar doğrudan 384 çukurlu tabaklarda görüntülenmiş ve en...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Video: Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biyokimya

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Çevre

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

Toxicants Trans ve çok jenerasyonel etkileri okumak için Caenorhabditis elegans kullanma

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Kanser Araştırmaları

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use products. Based on their chemical structure and estradiol-like biological properties, they have been classified as endocrine disrupting compounds (EDC). Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked to various health defects including cancer, behavioral disorders and infertility, with greater vulnerability indicated during early developmental periods. Cellular and molecular studies with the genetically tractable nematode model Caenorhabditis elegans have demonstrated that exposure to BPA causes apoptosis, embryonic lethality and disruption in the DNA repair mechanisms. We have previously reported that exposure of C. elegans embryos to low doses of different bisphenols decreases fecundity. In addition, we have shown that the effects of exposure during the very early stages of development persist into adulthood as assayed by quantifying habituation behavior, a form of non-associative learning. Here, we provide detailed protocols for embryonic exposure to low-dose EDCs as well as the associated fecundity and anterior touch habituation assays, along with representative results.

Exposure to environmental toxicants can acutely impact development with long-term effects. Detailed protocols are provided to illustrate a strategy using an effective lab model to study the effect of early embryonic exposure to bisphenol A. We provide fecundity and behavioral assays to monitor the effectiveness of our toxicant exposure bio-assays.

Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Gelişim Biyolojisi

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biyoloji

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

Büyüme ve üreme Caenorhabditis elegans kimyasallar etkisi ölçme

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

Tıp

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

Nörobilim

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, pesticides, and a wide variety of toxic substances. These nematodes are easy to work with and can be used to generate novel research findings, even in the undergraduate biology laboratory. A multi-week laboratory series of authentic, student-driven research projects trains students in a toolkit of techniques and approaches in behavioral measurements, cell biology, and microscopy that they then apply to their projects. One technique in that toolkit is quantifying the percentage of neurons exhibiting neurodegenerative damage following exposure to a chemical toxicant like a pesticide. Young adult C. elegans nematodes can be exposed to different concentrations of commercially available pesticides or other types of toxicants for 2-24 h. Then, undergraduate students can visualize different neuron subtypes using fluorescent-expressing strains of C. elegans. These techniques do not require sophisticated image processing software and are effective at even low magnifications, making the need for expensive confocal microscopy unnecessary. This paper demonstrates how to treat the nematodes with pesticides and how to image and score the neurons. It also provides a straightforward protocol for the microscopy and analysis of neuron morphology. The materials used for this technique are inexpensive and readily available in most undergraduate biology departments. This technique can be combined with behavioral measures like locomotion, basal slowing, or egg-laying to conduct a potentially publishable series of experiments and give undergraduate students an authentic research experience at a very low cost.

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Young adult Caenorhabditis elegans nematodes are exposed to different concentrations of commercial pesticides or other toxicants for 2-24 h. Then, different neurons can be visualized using fluorescent-expressing strains. This paper demonstrates how to expose nematodes to pesticides and assess neuron damage.

Pestisitlerin Caenorhabditis elegans Nöronları Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler