This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.

Bu protokol daha fazla ayrıntı ve özel hususlar 3, 25-28 sevk edilecek olan aşağıdaki kaynaklara dayanmaktadır. 2, H2O ile deterjan miseller 1. Yoğunluk eşleştirme Not: tampon çözeltisi yoğunluklu deterjan miseller yoğunluğuna uyumlu olması gerekir. Ortak yoğunluk ayarlayıcı maddeler 2 H2O, H2 18 O, 2H 2 18 O, gliserol ve sakaroz 29 içerir. &#39;H 2 18 O 2 H2O ile aynı yoğunluğa sahiptir ve protein değiştirilebilir protonlar dötertumlanma istenmiyorsa, daha iyi bir seçim olabilir. Bu prosedürde, 50 mM Tris, pH 7.3, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) deterjan yoğunluğu, 100 mM NaCI 2 H2O ile uyumlu olacak Bir ilk tahmin olarak, aşağıdaki konsantrasyonlar2 H2O kullanılacaktır: 10, 30, ve% 50 hac / hac. 1.1. Örnek hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki stok çözeltileri ve filtre bir 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir sterilize hazırlanması: 50 ml, 500 mM Tris pH 7.3, 1 M NaCI (10 X tampon çözeltisi); 1 mi, 250 mM C14SB (50X deterjan çözeltisi). </li><li> 20 ul 10X tampon çözeltisi, 4 ul 50X deterjan çözeltisi, 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 156 ul karıştırılarak numune çözeltisinin 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 160 ul, 20 ul 10X tampon çözeltisi karıştırılarak bir referans çözeltisi, 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize </li><li> Diğer 2 H2O konsantrasyonları için yineleyin 1.1.2, uygun 2 H2O ve H2O miktarlarını ayarlamaya,% 30 ve% 50, yani. </li></ol> 1.2. 6-kanal A MeclisiHücre içine UC hücreleri ve örnek yükleme. Not: Örnek yükleme yöntemine bağlı olarak EAA hücrenin iki türü vardır. Hücreler mühürlü sonra hücreler yüklenebilir dış dolgu ise dış dolgu olmadan Hücreler, hücre sızdırmazlık önce yüklenecek olan. Harici-dolgu AUC hücre Meclis, daha önce 3 tarif edilmiştir. Bu protokolde, dış dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre montajı anlatılmıştır. Ana fark, ayrıca sıkılır her iki tarafta vida halkalar olmasıdır, ve (Şek. 1) muhafaza fişleri gerek yoktur. montaj aşamalarında fark aşağıda belirtilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Şekil 1. Harici dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre görünümü patladı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti modifiye ve An-60 Ti Analyti olmuşturcal Rotor, Hücreler ve karşı ağırlıklar kullanım kılavuzu. <ol><li> Safir penceresinin yerine kuvars penceresinde (Şekil. 2) Her EAA hücre için iki pencere meclisleri hazırlayın. Pencere tutucu içine pencere conta yerleştirin. Biraz pencere astarı viraj ve boşluk pencere tutucu şafta karşısında oluşturacak şekilde pencere tutucu içine yerleştirin. Pencere tutucu yivli işareti hizalayarak, pencere liner içine safir penceresini yerleştirin. . Not: Bu tür bu yoğunluk eşleştirme deneyde olduğu gibi 30000 rpm üzerinde parazit ölçümleri, Bu nedenle yüksek hızda 28, 30 daha fazla ışık kırılma üretecek ve böylece kuvars cam sıkıştırılabilir ve safir camlar kullanılmaktadır. Bir safir cam kuvars penceresinden daha ağırdır ve yüzüne kazınmış bir &quot;X&quot; vardır. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Şekil 2. patlamış görünümü of pencere montajı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti ve An-60 Ti Analitik Rotor, Hücreleri ve karşı ağırlıklar kılavuzdaki modifiye edilmiş <ol><li> Parça numarası baş aşağı hücre gövdesini yerleştirin. Konut tuşu ile uyumlu kama yatakları ile, (sol, Şek. 1) aşağı bakan pencere ile bir pencere montajı ardından, öncelikle hücre konut aşağı eğimli tarafı 6-sektör merkezinde içine kaydırın. </li><li> Hafifçe kat spinkote vida halka konuları ve vida halkası yıkama. Pencere montaj üstüne bir vida halka pulu yerleştirin. Dışında bakan kelime &quot;OUT&quot; pencere gövde içine vida halkası takın. Hücre hizalama aracını kullanarak vida halkası elle sıkın. </li><li> Tork anahtarı kullanarak, sadece 60 inç-pound vida halka sıkın. </li><li> Parça numarası dik ve 12-öğle saatlerinde konumlandırılmış olan hücreyi yerleştirin. LSol satır içine OAD 120 ul referans ve sağ satır içine 110 ul örnek. Her numune ve referans doğru eşleştirilmiş emin olun. Not: Tam numune hacmi kritik öneme sahip değildir, ancak örnek menisküs farklı olacak şekilde bir referans numunesi (5-10 ul) biraz daha fazla hacme sahip olması gerekir. </li><li> Dikkatle pencere (Şekil. 1, sağ) aşağı bakacak şekilde hücre gövdesi, bir pencere montaj içine kaydırın. Aşırı hücre rahatsız ve içeriğini dökmek için değil dikkat edin. </li><li> Adımı yineleyin 1.2. 3 ve 1.2. 4, 120 inç-pound ikinci vida sıkma halkasını. Hücreyi ters çevirin ve 120 inç-pound ilk vidalı halka yeniden sıkın. </li><li> , Rotor içine hücreleri yükleyin santrifüj içine rotor yüklemek ve üreticinin talimatlarına göre 28 monokromatörü yükleyin. Not: Bu st AyrıntılarAP, bu referansta 3 bulunabilir. </li></ol> 1.3. Girişim ölçümü kurma <ol><li> Kısaca şu aşamada özetlenebilir olacak üreticinin talimatlarına göre, EAA enstrüman için kullanıcı arabirimi yazılımını başlatın ve 3000 rpm&#39;de her hücre için lazer kurulum ve radyal kalibrasyonu yapın. </li><li> Yeterli bir vakum sonra 1.3.1.1 (&lt;100 mikron), 3000 rpm&#39;de santrifüj çalıştırmak ulaşıldı. Kullanıcı arayüzü yazılımı girişim deseni önizlemesini ve yüksek kontrast elde etmek için lazer parametrelerini ayarlamak. </li><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Girişim&quot; ölçüm belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Bir sedimantasyon denge yöntemi (&quot;Yöntem&quot; düğmesi) 20 ° C&#39;de çalışma sıcaklığı, 45000 rpm veya daha yüksek hangisi protein örnekleri için beklenen en yüksek hızında çalışacak ve 1 tarama toplamak için her 15 dakikada ayarlayın. MonitoHeteroAnalysis veri dosyaları açma ve en az 12 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu seçerek r denge ilerleme (yaklaşık gecede Şekil. 3). Not: Benzer bir fonksiyonu da SEDFIT (Seçenekler | Yükleme Seçenekleri | Denge Test Yaklaşımı) mevcuttur. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Şekil HeteroAnalysis Maç işlevi 3. Sonuç. Maç işlevi ardışık tarama ve son tarama arasındaki RMSD karşılaştırarak denge ilerlemesini izlemek için kullanılabilir. X ekseni asimptotik RMSD değerleri ile gösterildiği gibi bu örneğin 8 saat sonra denge elde edilmesini gösterir. 1.4. Veri analizi <ol><li> Numunelerin her bir grubu için, 2 H2O konsantrasyonuna karşı radyal dağılım profili eğimini çizilir. Not: Dağıtım çok sığ üstel o ap olacakyaklaşımlar çok doğrusallık. X ekseni ile kesişme noktasını eşleşen 2 H2O konsantrasyonuna karşılık gelir. </li><li> Daha doğru sonuçlar için, çeşitli çoğaltır deneyi gerçekleştirmek. Seçenek olarak ise, 2 H2O konsantrasyonunun daha dar bir aralık deneyi tekrar. </li></ol> C14SB miselleri içine SH 2. çökelme dengesi 2.1. Run parametreler <ol><li> SEDNTERP kullanarak tampon yoğunluk ve viskozite, protein kısmi spesifik hacim ve santrifüj hızı hesaplayın. D 2 O konsantrasyonu da dahil olmak üzere, &quot;Tampon Veri Seç&quot; bölümündeki tampon ve yoğunluk seçin Compute hesaplamak ve buna göre tampon bileşenleri girmek için. </li><li> 2.1.1.1 &quot;V-bar&quot; bölümünde protein kısmi spesifik hacim seçin Compute hesaplamak ve protein amino asit dizisini girin. &quot;N = Bu monomer bir oligomer olun&quot; en yüksek beklenen oligomerik boyutunu belirtinalan, bu durumda N = 5. ana penceresinde RPM alanındaki değerleri girerek hızını hesaplayın kadar σ ≈ 1; Bu radyal dağılım profili 25 iyi bir üstel şekli sağlamak için başparmak bir kuraldır. Not: Bu, aşağıdaki gibi deney için hesaplanan değerler olarak: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g arasında, ω 1 = 16000 rpm. </li><li> Bir hız ve sonraki 25 de dağıtım profili arasında yeterli fark sağlamak için takip sonraki hızları hesaplayın. Not: Bu da işlevinden yapılabilir hesaba çözüm sütunu (dolum hacmi) alır SEDFIT içinde, &quot;denge rotor işlevi hızlandırır tahmin&quot;. </li></ol> 2.2. Numune hazırlanmasına, <ol><li> 5 mM C14SB ile 1 ml referans solüsyonu ve% 32,3 2 H 2 O hazırlayın 100 ul 10X tampon Solutio karıştırarak yoğunluk eşleştirme deney (bölüm 1), belirlenen şekilden, (aşama 1.1.1), 20 ul 50X deterjan çözeltisi (aşama 1.1.1), 323 ul 2 H2O (% 99.9) ve 527 ul H2O deiyonize </li><li> Örneğin metanol veya% 50 h / h sulu asetonitril gibi uygun bir çözücü içinde, liyofilize edilmiş, HPLC ile saflaştırılmış, SH peptidleri (daha önce tarif edilen 31 ifadesi ve saflaştırılması) çözündürülür. Her bir seyreltilmiş bir 280 vermek üzere üç numune için bir mikrolitre ölçekli UV / Vis spektrometre ve kısım içinde çözülmüş peptidlerin A280 ölçümü, 12 mm = 0.3, 0.5 ve 0.8 (A 280, 10 mm = 0.25, 0.417 ve 0.67) 130 ul. Gecede örnekleri liyofilize ve tekrar süspansiyon 130 ul referans çözeltisi (adım 2.2.1) örnek çözümleri vermek. Not: Trp, Tyr ve kalıntılarını içerdiği için, SH proteini 280 nm&#39;de UV / Vis emme tespit edilebilir. Aromatik artıkların olmayan proteinler ya da müdahale ile, uygun bir kromofor ile etiketleyerek Bir Trp ihtiva eden mutant kullanılarak tespit edilebiliryerine absorbans ım ölçümleri. </li><li> Kuvars pencereli bir 6-kanal EAA hücre montajı bölüm 1.2 adımları izleyin. En yakın rotor merkezine rotor merkezi ve en düşük konsantrasyon numunesi (A 280, 12mm = 0.3) uzak (A 280, 12mm = 0.8) kanal yüksek konsantrasyon örneği yükleyin. </li></ol> 2.3. Absorbans ölçümleri ayarlama <ol><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Absorbans&quot; ölçümü belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Dedektör dalga boyu olarak 280 nm belirtin. </li><li> Tek Tarama Radyal adım büyüklüğü = 0.01 cm, çoğaltır = 3 (düşük çözünürlükte, hızlı) ile örneğin, düşük çözünürlükte veri toplama belirterek, Tarama Seçenekleri &quot;ilk taramadan önce Radyal kalibrasyon&quot; kontrol ve yürüterek 3000 rpm&#39;de radyal kalibrasyon yapın . Tarama tamamlandıktan sonra, seçeneğinin işaretini kaldırın. </li><li> &quot;(Metho bir sedimantasyon denge yöntemi kurmak&quot;düğmesi) d 20 ° C&#39;de, adım 2.1.3 hesaplanan ilk hızda çalışacak ve 1 Tarama her 30 dakikada bir toplamak. Her hücrelerin &quot;Detay&quot;, adım 2.3.2 gibi düşük çözünürlükte veri toplama belirtin. En az 18 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu HeteroAnalysis veri dosyaları açma ve seçerek denge ilerlemesini izlemek (yaklaşık gecede, Şek. 4). Not: sonraki hızları daha az zaman alacak ise denge ulaşılması, ilk hız için önemli ölçüde daha uzun sürebilir. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> HeteroAnalysis Maç işlevinden Şekil 4. sonuçları. Birinci ve ikinci hızları (sol üst ve sağ) dengeye ulaşmış görünüyor, ama emin olmak için bir kaç saat daha beklemek daha iyidir. Buna karşılık, üçüncü ve dördüncü hızları (alt sol ve sağ) açıkça dengeye ulaşmıştırdaha kısa sürede. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Denge ulaşıldığında, Radyal adım büyüklüğü = 0.001 cm, çoğaltır = 10 (yüksek çözünürlüklü, yavaş) ile yüksek çözünürlükte, örneğin tek bir tarama toplamak. </li><li> Tarama tamamlandıktan sonra, bir sonraki hız için adım 2.3.3 ve 2.3.4 tekrarlayın. </li><li> Zaman, her hız için denge bilinen (hesaplanan veya deneyim) ulaşması için gerekli zaman İsteğe bağlı, her biri için dengeleme süre sonra 1 tarama toplamak için adım ve 2.1.3 hesaplanan tüm hızları dahil sedimantasyon denge yöntemi tarama kurmak hız. Bu durumda, her bir hücrelerin &quot;Detay&quot; yüksek çözünürlüklü veri toplama belirtin. </li></ol> 2.4. SEDFIT ve SEDPHAT Veri analizi Not: Daha fazla bilgi ve veri analizi okuyucu olarak hususlar için t denirwww.analyticalultracentrifugation.com: Aşağıdaki web o. <ol><li> Açık yüksek çözünürlüklü SEDFIT içinde taramalar (Veri | yük sedimantasyon denge verileri) ve 3 kanallar (; | Yükleme Seçenekleri | 3 Alt Grupları 6-kanal ham veri kaydetme Seçenekler bu farklı her bir örnek için konsantrasyonlara karşılık) veri bölünmüş. </li><li> Yeniden-açık SEDFIT aynı örnek ve aynı konsantrasyonda ancak farklı hızlarda ait veri dosyaları. Menisküs (dikey kırmızı çizgi), hücre alt (dikey mavi çizgi) ve montaj sınırları (dikey yeşil çizgiler) ayarlayın ve SEDPHAT kullanılmak üzere veri ihracat (Veri | SEDPHAT İhracat Verileri). Girdi istendiği gibi rotor türü ve merkezinde türü yanı sıra, adım 2.1.1 hesaplanan parametreler. Her numune ve konsantrasyon için bu adımı tekrarlayın. </li><li> SEDPHAT aynı örnekten tüm verileri (tüm konsantrasyonlar ve hızlar) açın ve Deney Parametreleri doldurun; Bir örnek, Şekil l&#39;de gösterilmiştir. 5. Not: D 2 O tamponu Deut ilave edildiğinde<html> Değiştirilebilir protonlar birleşmeleri T ciddi ölçüde suda çözünür proteinleri, protein moleküler ağırlığı değiştirebilir. Membran-gömülü bölgeler döviz korunur, çünkü zar proteinleri, SH proteini gibi özellikle küçük olanlar, daha az etkilenir. Bunu düzeltmek için, girişi &quot;D mol fraksiyonu tampon&quot;. Not: Bu aşamada menü Veri seçerek ayrı ayrı düzenlenmiş veri kümesi kaydetmek için tavsiye edilir | Yeni Yapılandırması Olarak Kopyala Tüm Veri ve Kaydet. </li><li> Bir Model seçin ve bu model için Küresel Parametreleri doldurun. Not: Örnek olarak, &quot;monomer-n-mer kendi kendine birleşmeme özelliği&quot; modeli ve parametreleri Şekil l&#39;de gösterilmektedir. 6. </li></ol><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Şekil 5. Deneysel Parametreler doldurmak için nasıl bir örnek. dosya / ftp_upload / 52.404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. Monomer-n-Mer Self-Dernek modeli için Küresel Parametreleri doldurmak için nasıl bir örnek. <ol><li> Menü Fit seçerek Küresel Fit çalıştırın | Küresel Fit ve fit yakınsak kadar bekleyin. Aşağı Not (veya bir ekran görüntüsü almak) uydurma sonuçlar, özellikle küresel azaltılmış ki-kare ve K adet bir günlük değerleri. Termodinamik Bilgileri Göster | sığdırma veri ve menü Kopyala ve Display montaj artıklar gibi diğer verileri ayıklayın. </li><li> Küresel Parametreler dönün ve (1) monomer molekül ağırlığı uyacak ve adım 2.4.5 tekrarlamak için M kontrol edin. Takılan molekül ağırlığı ve küresel azaltılmış ki-kare not edin. </li><li> Adımı yineleyin 2.4.3 her model test edilecek için 2.4.6 ve düşük küresel ki-kare değerinin yanı sıra montaj artıklar karşılaştırarak, her modelin uygun kalitesini karşılaştırmak için. Not: Küçük ve rastgele uydurma artıklar genelde iyi bir uyum gösterir, ve olur en uygun modeliküçük küresel azaltılmış ki-kare var. monte monomer molekül ağırlığı ve ki-kare değeri sabit (teorik) molekül ağırlığı bundan önemli ölçüde farklılık olmamalıdır. </li><li> İlk seçme İstatistik göre değer elde günlüğüne Ka için güven aralığı hesaplayın | Kritik hata yüzey projeksiyonları için ki-kare ve istenen güven aralığı girilerek. Günlük Ka için ki-kare değerleri elde etmek için Küresel Parametreleri iletişim Ka giriş 1-boyutlu hata yüzey projeksiyon oluşturun ve seçimini kaldırabilirsiniz | Sonraki İstatistik gidin. Not: okuyucular, bu yöntemin 33 yöntemi 32 yanı sıra illüstrasyon hakkında daha fazla bilgi için aşağıdaki kaynakları (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) başvurmaları önerilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+A+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).</li><li>Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+heterologous+protein-protein+interactions+using+analytical+ultracentrifugation.">Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation.</a> Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+association+and+assembly+the+study+of+protein.">Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+for+the+XLI+analytical+ultracentrifuge.">Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge.</a> Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions+-+Methods+for+Detection+and+Analysis.">Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis.</a> Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).</li><li>Alexandrov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+high-throughput+co-expression+of+protein+pairs.">A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).</li><li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions.">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).</li><li>Ebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+to+characterize+surfactants+and+solubilized+membrane+proteins.">Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins.</a> Methods. 54, 56-66 (2011).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+reversible+macromolecular+associations+via+sedimentation+equilibrium:+an+introduction.">Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction.</a> Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).</li><li>Dowell, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+is+an+important+cause+of+community-acquired+lower+respiratory+infection+among+hospitalized+adults.">Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults.</a> J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).</li><li>Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+virus+from+which+the+entire+SH+gene+has+been+deleted+grows+efficiently+in+cell+culture+and+exhibits+site-specific+attenuation+in+the+respiratory+tract+of+the+mouse.">Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse.</a> J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).</li><li>Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+respiratory+syncytial+virus+small+hydrophobic+protein.">Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein.</a> J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).</li><li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1,+NS2,+SH,+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo.">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li><li>Karron, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+(RSV)+SH+and+G+proteins+are+not+essential+for+viral+replication+in+vitro:+clinical+evaluation+and+molecular+characterization+of+a+cold-passaged,+attenuated+RSV+subgroup+B.">Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).</li><li>Whitehead, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+virus+bearing+a+deletion+of+either+the+NS2+or+SH+gene+is+attenuated+in+chimpanzees.">Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees.</a> J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).</li><li>Rixon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+(SH)+protein+accumulates+within+lipid-raft+structures+of+the+Golgi+complex+during+respiratory+syncytial+virus+infection.">The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection.</a> J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).</li><li>Collins, P. L., Mottet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+and+oligomerization+of+the+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus.">Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus.</a> J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).</li><li>Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus:+comparison+between+antigenic+subgroups+A+and+B.">The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B.</a> J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).</li><li>Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+respiratory+syncytial+virus+SH+gene.">Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene.</a> J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+protein+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+forms+pentameric+ion+channels.">The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment.">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li><li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weights+and+association+equilibrium+constants+using+sedimentation+equilibrium+and+sedimentation+velocity.">Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).</li><li>Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation:+Sedimentation+Velocity+and+Sedimentation+Equilibrium.">Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).</li><li>Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation:+Different+methods+for+density+matching.">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li><li>Laue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+20.3.">Ch. 20.3.</a> Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels.">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).</li><li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1.">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li><li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins.">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li><li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus).">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li><li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions.">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li><li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+endocytosis:+Close+encounters+of+many+kinds.">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma, numune hazırlama ve denge sedimantasyon kullanılarak deterjan küçük bir zar proteini oligomerizasyon analizi için bir deney protokolü sağlar. yoğunluk eşleme aşaması gerekli değildir olarak açıklanan protokol, aynı derecede geçerlidir -ve çözünür proteinler için simpler- olup. Gerçekten de, deterjanlar ve proteinin bir karışımından teşekkül eder. Parçacık flotasyon katkıda bulunmaz, böylece sedimantasyon çalışmalar yapmak, deterjan yerçekimi alanına görünmez olmalı...

Analitik Ultrasantrifügasyon 1-5, fizyolojik koşullar altında makromoleküllerin etkileşimleri incelemek zayıf ve güçlü etkileşimler hem erişilebilir olmasının en önemli yöntemlerden biridir. yöntem etiketi içermez ve ışık emiliminin veya girişim kullanır ve hatta floresan optik sistemler büyüklüğü 6 birkaç düzeyleri üzerinde konsantrasyon aralıkları ulaşmak için kullanılabilir. En biyokimyasal işlemler tersine etkileşimine bağlıdır, bu yöntem özellikle faydalıdır. Bu etkileşimlerin stoikiometri ve gücü kantitatif biyolojik süreçleri anlamak için karakterize lazım, ve bir dizi yöntem, bu amaçla 7, 8 için var. Bununla birlikte, geçici etkileşimler 9 çalışma zordur. makromoleküler etkileşimleri tanımlamak için bir yöntem seçimi statik veya dinamik doğasına bağlıdır. İlk durumda, Sedim<html> yönelimi hızı (SV) radyal ulaşım oranı ölçülür ve kompleksleri yüzer kütle ve şekil farklılıkları esasında kesirleştirilmiştir yerlerde kullanılır. Buna karşılık, deney zaman ölçeği üzerinde ters çevrilebilir dinamik dernekler fiziksel ayrılamaz. Bu durumda, kendi kendine ya da kovalent olmayan etkileşimlerin neden hetero etkileşimleri toplam protein konsantrasyonuna bağlı olan bir denge içindedir. Bu dinamik etkileşimler sedimantasyon denge (SE) ve sedimantasyon hızı (SV) 10 hem ele alınabilir. Bununla birlikte, birinci yöntem gerçekleştirmek için basit ve burada tarif edilmiştir. Bir denge difüzyon ve çökelme ile ulaşılır, böylece SE olarak, santrifüj, yeterince düşük bir hızda gerçekleştirilir. Bu noktada her iki radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir optik işaret (UV-VIS) denge profili, dernekler 11 için önceden belirlenmiş bir termodinamik modeller kullanılarak analiz edilebilir. ve_content &quot;&gt; Bu yazıda, bir sedimentasyon dengeleme çalışması nedeniyle hidrofobisite. iyon kanallarını oluşturur viral zar proteininin kendi kendine birleşmeme özelliği sunulmuştur deney deterjan varlığında gerçekleştirilir, ve bu durumda yoğunluk olduğu Çözücü deterjan edilene uyumlu olması gerekir. Bununla birlikte, protokol solvent yoğunluk eşleme gerekli olacaktır, bunun dışında, suda çözünür protein halinde olur aynı tanımladı. kullanılan protein, insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV), alt solunum yolu bebeklerde hastalığı, yaşlılar ve bağışıklık popülasyonları Dünya çapında 12 neden Paramyxoviridae ailesinden bir zarflı Pneumovirus kodlanmıştır. HRSV enfeksiyonu kadar 64 milyon bildirilen vaka ve ölüm 160,000 her yıl meydana gelir. hRSV genom üç membran proteinleri, F, G ve küçük hidrofobik (SH) dahil olmak üzere 11 proteinleri transkripsiyonunu yapar. SH proteini katılırRSV enfeksiyonu patogenezinde. SH gen (RSVΔSH) eksik RSV mümkün olduğunu sinsitiyumların oluşmasına neden ve vahşi tip (WT) virüsü 13-16 kadar büyüdü. Bununla birlikte, RSVΔSH virüsü üst solunum yolu 15, 16 WT daha az verimli bir şekilde 10-kat çoğaltılır. Ayrıca, RSVΔSH virüs in vivo fare ve şempanze modelleri 13, 17 in zayıflatılmış oldu. SH proteini 64 (RSV alt grup A) veya 65 (RSV alt grup B) amino asitler, uzun türü Golgi 18 zarlarına çoğunlukla birikir II integral membran proteinidir. SH proteini, tek bir yüksek 20,21 korunmuş bir sarmal transmembran (TM) etki 19 tahmin vardır. C- ve N-terminal extramembrane etki lumenally / hücre dışı ve sitoplazmik sırasıyla yönlendirilir. Hem sentetik TM domeni (kalıntılar 18-43) Ve tam uzunlukta SH proteini deterjanların çeşitli homopentamers oluşturmak için gösterilmiştir. homopentameric bir şekilde düzlemsel bir lipid çift tabakaları 22,23 kanal aktivitesi için sorumludur. Lipit TM monomerlerin doğru yönlendirme ilk His-22, bir lümene ilişkin olması yakın yönde arası sarmal için gösterdi alana özel kızılötesi dikroizma 23 kullanılarak belirlenmiştir. Aynı TM domeni yönü (DPC) dodesilfosfokolin olarak pentamerik proteinin tam uzunluğunun bir sarmal demeti yeniden 22 miseller NMR çalışmaları ile teyit edilmiştir. Bu &#39;misel&#39; modelinde, tek bir a-helis TM domeni bir genişletilmiş B-hairpin C-terminal a-helisin göre N-terminal olarak sınırlanan ve edilmiştir. SH proteininin iki protonize kalıntıları, His-22 ve His-51, TM domeni (lumenally yönelimli) bulunur ve extramembrane C-terminali β firketenin ucunda sırasıyla (kadar kanal gözeneğinden). Bir bicellar Çevreyinment, ancak TM α-heliks His-51 kadar uzanır ve her ikisi de His artığı kanalı 24 lümenine erişilebilir. 22 hidrofobik yan zincirler (Ile-32, Ile-36, Ile-40 ve Leu-44), ve kaplı olan kanal yapısı, bir huni benzeri bir mimari 22 dar bölümün benimser (Cys-45, Ser-29) Ile-36 kanal lümen dar noktasını tanımlar. His-51 küçük açıklığın ucunda ise His-22, bu huni büyük açıklık yer almaktadır. Bu yazıda, bir sedimantasyon denge modunda analitik santrifüj O&#39;nun protonlanma SH, protein pentamerin istikrar etkiler olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Bu durumda, SH protein, literatürde bu SH protein yapılarını pentamerik oligomerler 22 göstermek için daha önce kullanılmış olan C14-betain deterjan içinde çözünmüştür.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide 99.8%</td><td>Cambridge Isotope</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Cell housing</td><td>Beckman Coulter</td><td>334784</td><td></td></tr><tr><td>12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled</td><td>Beckman Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Window holder</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Window gasket</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Window liner</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire window</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Quartz window</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Screw-ring washer</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Screw ring</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>Torque stand assembly</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Counterbalance</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Cell alignment tool</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation&lt;br/&gt; .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation&lt;br/&gt; .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability

Analitik ultrasantrifügasyon, (EAA) etkileşim kuvvetleri geniş bir aralıkta ve fizyolojik koşullar altında, makro moleküller arasındaki tersine çevrilebilir etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Bu AUC&#39;sini nicel stoikiyometri ve homo ve biyokimyasal süreçlerde geçici ve geri dönüşümlüdür hetero-Dernek termodinamik değerlendirmek için bir seçim yöntemi yapar. Sedimantasyon denge yöntemi (SE) &#39;de, difüzyon ve çökelme arasında bir denge, belirli bir ilişki modeline bağlıdır radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir profil sağlar. Burada detaylı bir GD protokolü bir analitik ultrasantrifüj kullanarak küçük bir zar proteini oligomerin boyut ve monomer ilişki enerjisini tespit etmek üzere tarif edilmiştir. AUC-ES sadece fiziksel ilkelere dayalı, etiket-ücretsiz, ve hem suda çözünür ve membran proteinleri kullanılabilir. Bir örnek ikincisinin gösterilir, insan solunum sinsisyal virüsü küçük hidrofobik (SH) proteini (hRSV), Pentamerik iyon kanallarını oluşturan tek bir α-sarmal transmembran (TM) etki alanı ile 65-amino asit polipeptit. NMR tabanlı yapısal veriler SH proteini kanalının lümen bakan yönlendirilmiş olan zar ötesi etki protonlaştırılabilir iki His kalıntılarını sahip olduğunu göstermektedir. SE deneyleri pH dernek sabiti ve SH protein oligomerik boyutunu nasıl etkilediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Pentamerik bir şekilde her durumda muhafaza ederken, bunun birleşme sabiti düşük pH değerinde indirgendi. Bu veriler, SH proteinde iki His tortularının bir lümene ilişkin yönlendirme ile tutarlı SH kanal aktivitesi için gözlenen benzer bir pH bağımlılığı ile uyum içindedir. ikincisi, düşük pH elektrostatik itme ve düşük oligomer istikrarı karşılaşabilirsiniz. Fizyolojik koşullarda ince, protein-protein ilişki değişiklikler hakkında niceliksel bilgi olarak ölçülmesi için her Özetle, bu yöntem uygulanabilir.

50 mM Tris, C14SB deterjan miseller radyal dağılım profili, 100 mM NaCI, pH 7.3 formları doğrusal modeli (Şekil 7A) monte edilebilir, çok sığ bir üslü. Bu dağılım eğimi ters D 2 O konsantrasyonu (Şekil 7B) ile korele edilir. eğim sıfır olduğu nokta, eşleştirme D 2 O konsantrasyonu,% 32.3 olarak bulunmuştur, yani. Aşağıda Şekil 7 Bkz. Aynı deney f...

Watch this Scientific Journal Video about Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability at JoVE.com

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Acids and Bases

SCIENTISTS IN ACTION

10.6K Görüntüleme.  Nanyang Technological University. Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Video: Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Kimya

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Biyomühendislik

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biyokimya

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the investigation of biological materials, biofuel processing, and bio-inspired materials covering nanometer to micrometer length scales. The methods presented here for investigating physical properties (i.e., size and shape) of membrane proteins (here, MmIAP, an intramembrane aspartyl protease from Methanoculleus marisnigri) in solutions of micelle-forming detergents are well-suited for this small-angle neutron scattering instrument, among others. Other biophysical characterization techniques are hindered by their inability to address the detergent contributions in a protein-detergent complex structure. Additionally, access to the Bio-Deuteration Lab provides unique capabilities for preparing large-scale cultivations and expressing deuterium-labeled proteins for enhanced scattering signal from the protein. While this technique does not provide structural details at high-resolution, the structural knowledge gap for membrane proteins contains many addressable areas of research without requiring near-atomic resolution. For example, these areas include determination of oligomeric states, complex formation, conformational changes during perturbation, and folding/unfolding events. These investigations can be readily accomplished through applications of this method.

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

This protocol demonstrates how to obtain a low-resolution ab initio model and structural details of a detergent-solubilized membrane protein in solution using small-angle neutron scattering with contrast-matching of the detergent.

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

<meta charset="utf8"></head><body>Katı Hal NMR ile Doğal Membranlardaki Proteinlerin Yüksek Çözünürlüklü Çalışmaları

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Katı Hal NMR ile Doğal Membranlardaki Proteinlerin Yüksek Çözünürlüklü Çalışmaları

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven. In many cases membrane-spanning proteins have evolved highly sophisticated mechanisms of action.1-3 One way in which membrane proteins can modulate their structures and functions is by direct and specific contact of hydrophobic helices, forming structured transmembrane oligomers.4,5 Much recent work has focused on the distribution of amino acids preferentially found in the membrane environment in comparison to aqueous solution and the different intermolecular forces that drive protein association.6,7 Nevertheless, studies of molecular recognition at the transmembrane domain of proteins still lags behind those of water-soluble regions. A major hurdle remains: despite the remarkable specificity and affinity that transmembrane oligomerization can achieve,8 direct measurement of their association is challenging. Traditional methodologies applied to the study of integral membrane protein function can be hampered by the inherent insolubility of the sequences under examination. Biophysical insights gained from studying synthetic peptides representing transmembrane domains can provide useful structural insight. However, the biological relevance of the detergent micellar or liposome systems used in these studies to mimic cellular membranes is often questioned; do peptides adopt a native-like structure under these conditions and does their functional behaviour truly reflect the mode of action within a native membrane? In order to study the interactions of transmembrane sequences in natural phospholipid bilayers, the Langosch lab developed ToxR transcriptional reporter assays.9 The transmembrane domain of interest is expressed as a chimeric protein with maltose binding protein for location to the periplasm and ToxR to provide a report of the level of oligomerization (Figure 1).
In the last decade, several other groups (e.g. Engelman, DeGrado, Shai) further optimized and applied this ToxR reporter assay.10-13 The various ToxR assays have become a gold standard to test protein-protein interactions in cell membranes. We herein demonstrate a typical experimental operation conducted in our laboratory that primarily follows protocols developed by Langosch. This generally applicable method is useful for the analysis of transmembrane domain self-association in E. coli, where &#946;-galactosidase production is used to assess the TMD oligomerization propensity. Upon TMD-induced dimerization, ToxR binds to the ctx promoter causing up-regulation of the LacZ gene for &#946;-galactosidase. A colorimetric readout is obtained by addition of ONPG to lyzed cells. Hydrolytic cleavage of ONPG by &#946;-galactosidase results in the production of the light absorbing species o-nitrophenolate (ONP) (Figure 2).

An efficient procedure to assess the oligomerization propensity of single-pass transmembrane domains (TMDs) is described. Chimeric proteins consisting of the TMD fused to ToxR are expressed in an E. coli reporter strain. TMD-induced oligomerization causes dimerization of ToxR, activation of transcription and production of the reporter protein, -galactosidase.

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Katı Hal NMR ile Doğal Membranlardaki Proteinlerin Yüksek Çözünürlüklü Çalışmaları

Katı Hal NMR ile Doğal Membranlardaki Proteinlerin Yüksek Çözünürlüklü Çalışmaları

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi