The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

NOT: Tüm hayvanların barındırıldığı ve kurumdaki hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) uyarınca kullanılmalıdır. Burada açıklanan tüm işlemler Case Western Reserve Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmıştır. 1. Transgenik Hayvanlar <ol><li> Aksonlar (Thy-1 YFP H) 50 ve mikroglia / monositler etiket piyasada mevcut floresan muhabiri fareler kullanın (CX3CR1 GFP / GFP 51; malzemelerin listesine bakınız). Bu fareler intercrossed ve kurumsal hayvan bakım politikalarına göre bireysel üreme kolonilerinin olarak muhafaza edilmelidir. </li></ol> 2. Kemik İliği Chimeras <ol><li> Alıcı hayvan olarak kullanma yaşı en az 8 hafta olan hayvanları tanımlamak. </li><li> Hatta, tüm vücut ışınlaması sağlamak için bir konumda fare tutmak için tasarlanmış bir dairesel ışınlama tutan kafeste konak hayvanları yerleştirin. </li><li> Bir sezyum üzerine zamanlayıcı ayarlayın (Cs-137) ışınlayıcı bir tüm vücut radyasyon dos yönetmek içinÜreticinin talimatlarına uygun olarak, hayvanlara 800-1.000 Rads yaşı (Burada gösterilen örnekler 980 Rads vardır). </li><li> 4 saat en az dinlenmek için kafeslerine hayvanları dönün. </li><li> Uygun genotip verici hayvanlar seç iliği projenitör hücrelerin kaynağı olarak (Şekil 2A &#39;ya bakınız). NOT: Uygun donör farklı hücre popülasyonlarının, ya da kontroller aynı genotip birini tanımlamak için ana bilgisayardan farklı soy-spesifik floresan gazetecilere ifade hayvanlardır. </li><li> Bir Petri% 70 alkol ile çanak ve 10 ml Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) medya ve medyada batırılmış bir 40 mikron hücre süzgecinden ile ikinci tabak doldurun. RPMI medya ile bir 15 ml konik tüp doldurun. Buz üzerinde yemekleri ve tüp tutun. </li><li> Kurumsal kurallarına göre CO 2 boğulma donör hayvanlar Kurban. Tüm kürk ıslak kadar% 70 etanol ile tüm hayvan iliklerine cildi ve kürk temizleyin. </li><li> Sk kaldırorta bölümünde etrafında kesme ve tam bacak kaslarını ortaya çıkarmak için arka ayakları üzerinde cildi aşağı doğru çekerek hayvanın alt yarısında gelen. </li><li> , Kemik yerinden sonra steril forseps ve makas, kabuğu kullanarak ve tibia her iki ucunda uzak kasları kesmek için diz ekleminde anterior fazla uzaması ile tibia çıkarın. Ortamı içeren bir Petri kabı içinde hücre süzgecinden transfer sonra 30 saniye boyunca bir alkol ile Petri kabındaki kemik yerleştirin. </li><li> Kalça eklemini yerinden ve femur bağlı kasları soymaya, alkol femur kısaca yerleştirilir ve daha sonra çanak içinde aynı hücre süzgecinden koyun. </li><li> Bir doku kültürü kaputu, kemiklerin her iki ucunu kesti ve kemik ucunu bir 1 ml şırınga üzerindeki bir 21 iğne eklemek için steril makas kullanın. Medya ile 15 ml&#39;lik konik içine iliği yıkayın. Kalan kemikler için prosedürleri tekrarlayın. </li><li> 3 ml şırınga pistonu arka kullanarak, ezilme, kemik hücresinde biterpetri üzerinde süzgeç daha fazla hücre elde etmek. </li><li> 50 ml konik tüp üstüne filtreyi yerleştirin ve 15 ml konik tüp aspire hücreler ile medya aktarın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere kemik iliği ezmek için, pistonun geri kullanın. 15 ml konik tüp, kemik parçaları ve 50 ml konik bir tüp içine ortam 30 ml hücre süzgecinden yıkayın. </li><li> Pelet hücreleri, 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücreler santrifüjleyin. </li><li> Amonyum Klorür-potasyum (ACK) 2 ml ile lizleyin kırmızı kan hücreleri, 2 dakika boyunca liziz tamponunda. % 10 fetal sığır serumu içeren ortamda 10 ml liziz tamponu söndürüldü. 500 xg 5-10 dakika süreyle santrifüj pelet. </li><li> Her bir yıkama için pelet haline getirmek üzere, 5-10 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj, tuzlu su içinde iki kez RPMI ortamında 10 ml bir kez hücreler yıkanır ve. </li><li> Tuzlu su, 200 ul içinde 3 x 10 6 hücre bir nihai konsantrasyona kadar tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> IRR kuyruk ven enjeksiyon yoluyla Transferi 3 x 10 6 iliği hücreleriadiated alıcı fareler. </li><li> Alıcı kafeste asitleştirilmiş su (pH 3.0), koyun ve fare kurtarmak için izin verir. NOT: transplantasyonu sonrası 10-14 gün içinde ölecek başarısız Fareler. </li><li> 8 hafta sonra, akış sitometri (Şekil 2B-C) ile periferik kan bağışıklık hücrelerini inceleyerek iliği sulandırılması doğrulayın. </li></ol> 3. Sırt Sütun Crush Yaralanma NOT: Uygun chimera hayvanları veya istenilen deneye dayalı cerrahi çift transgenik hayvanların seçin. Ya etiketli ikamet veya kemik iliğinden elde edilen hücrelerle Hayvanlar önceki adımlarda oluşturduğunuz bulundu. <ol><li> Hazırlayın ve rongeurs dahil cerrahi aletleri, otoklav, Dumont # 4 forseps, iris makas, holding dokular, iğne sürücüleri ve yara klipleri için forseps. </li><li> Ağrı kontrolü için farelere yönetmek için ilaçlar hazırlayın. Bupernex ve Marcaine yaygın ağrı kontrolü için kullanılır. Gerektiği gibi uygun ilaçlar kullanınnd Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış. </li><li> % 4 izofluran ile anestezi øndükle ve min başına 60-100 nefes bir nefes oranını elde etmek için% 1-2 izofluran ile korumak. Anestezi altında kuruluğunu önlemek ve ayak tutam tarafından tepki eksikliği onaylamak için hayvanın gözlerine göz yağlayıcı. Bir ısıtma pedi kullanarak sıcaklığını korumak ve bir rektal prob kullanılarak sıcaklığını izlemek. </li><li> Hedeflenen omurilik seviyesinin üzerinde bir elektrikli tıraş makinesi ile fare arka Tıraş ve daha sonra iki kez% 70 alkol takip povidon-iyot ile alanı üç kez çubukla. Steril bir örtü üzerinde hayvan yerleştirin ve cerrahi siteyi görselleştirmek için uygun bir konumda kesilmiş bir delik ile başka bir steril örtü ile hayvan kapak. Ameliyat boyunca steril örtüler üzerinde tüm araçları koruyun. </li><li> Hayvan arkasındaki kas maruz iris makas ile istenilen spinal düzeyde orta hat boyunca cildi kesin. </li><li> Bir diss altındamikroskop etkilemeden, trapez ve dorsal spinal süreçleri eklemek orta hat boyunca latissimus dorsi ligamanlarında dahil sırt kasları, kesip, ve vertebra sütun maruz. </li><li> Belirli vertebra lamina ortaya çıkarmak için vertebra dorsal ve enine süreçleri arasındaki rotator kasları çıkarın (bu durumda T11) kaldırılacak. Bu süreçte üzerine son olmayan yüzen kaburga sokulmasıyla T11 belirleyin. </li><li> Kaldırılacak süreci üstünde ve altında uzaya rongeurs ipuçları yerleştirin ve emin onlar omurga zarar çok derin vertebra lamina etrafında yerde güvenli ama yapmak için biraz kaldırın. Tek harekette yakın rongeurs lamina kaldırmak için. </li><li> Kalan vertebra küçük parçalarını kaldırmak için rongeurs kullanarak gerektiği gibi laminektomi büyütün. </li><li> Bir cetvel karşı tutarak ve kalıcı bir kalem ile işaretleyerek bir 4. forseps ipuçları 1 mm ölçün. Ayırma bahiste 1 mm ölçüncetvel karşı forseps tutarak iki uçlarını ween ve forseps milin üzerine yerine bir lastik forseps halka kaydırarak 1 mm ipuçları maksimum genişliğini düzeltmek. </li><li> Omuriliği erişmek için forseps uçları iki ekleme noktasında dura ile 30 iğne takarak küçük bir delik oluşturun. </li><li> Işareti dura üzerinde emin, forseps tarafta işaretlenmiş 1 mm derinliğe kadar deliklerden dura bir 90 ° açıyla forseps uçlarını takın. Forseps kapatın ve 10 saniye tutun sıkıştırın. Yayın ve tekrar forseps üç tutan toplam iki kez daha sıkın. Omurilikten forseps çıkarın. </li><li> Yaralanma sitesi üzerinden tuzlu ve yerinde emilebilir jelatin sünger sıkıştırılmış bir parça bekletin. </li><li> Bir çalışan dikiş kullanarak, # 4 sentetik olmayan emilebilir dikişlerle naylon ile laminektomi üzerinde yer kas ve batırılmış jelatin sünger sütür. </li><li> 5 mm&#39;lik yara cli kullanarak yerinde cilt Klipps. </li><li> Kas gluteus kas içine 10 ul Marcaine 490 kesi yeri etrafında tuzlu subkutan ul ve 5 ul Bupernex (0.1 mg / kg) (1.0 mg / kg) enjekte edilir. </li><li> Hayvan sıcak pad üzerinde kurtarmak ve arka bacaklarda herhangi bir harekette zorluklar veya felç belirtilerini izlemek için izin verin. Tam anestezi kurtarıldı kadar gözetimsiz veya diğer hayvanların varlığında hayvan bırakmayın. Gözlemlenebilir motor açıkları görüntüler herhangi bir hayvan kullanmayın. NOT: Bu ezilme lezyon omurilik boyunca herhangi bir düzeyde yapılabilir rağmen, pratikte, T10-L4 nefes ve kelepçeler kullanarak vücut hareketini stabilize göre görüntüleme için daha az teknik zorluklar oluşturmaktadır. Kelepçe yerleştirme torakal düzeyde görüntü göğüs kafesinin etrafında modifiye edilmelidir. </li></ol> 4. Intravital Görüntüleme <ol><li> Hazırlayın ve doku, iğne d tutmak için Dumont # 4 forseps, iris makas, forseps, cerrahi aletler, otoklavnehirler ve yara klipleri. </li><li> Izofluran ile daha önce olduğu gibi fare anestezisi. % 4-5 anestezi øndükle ve dakikada 60-100 nefes bir nefes oranı ve ayak tutam yanıt eksikliği korumak için gerektiği gibi% 1-2 korumak. , Isıtmalı fare tutun görüntüleme değil nefes oranını izlemek ve sürekli bir rektal prob ile hayvan sıcaklığını izlemek. </li><li> Alkol daha sonra yara Betadine ile klipleri ve etrafındaki deriyi temizleyin ve üretici talimatlarına göre yara klipleri çıkarın. Yara klipler çıkarıldıktan sonra, gerekirse Nair ile tüylerden ve povidon-iyot ve% 70 alkol ile tekrar siteyi temizleyin. </li><li> Makas ile cilt yeniden açın. Kas kalan sütür çıkarın ve gerekirse makasla kesme, forseps ile ayrı kas çekin. </li><li> Omurilik üstünde ve altında Lami vertebra bir vertebra düzeyinde enine süreçlerin tarafında makas ile keserek kasın kelepçeleri için bir mikroskop altında, cepler oluşturmaknectomy. </li><li> Bu omur her etrafında kelepçeleri yerleştirin ve sıkın. Omuriliği ulaşmak için mikroskop amaç için oda izin gerektiği gibi ayarlayın. Spinal kord görüntüleme platformu paralel olduğundan emin olun ve görüntüleme için doku istikrarı korumak. Solunum artefakt görülürse, görüntüleme alanında hareket aza indirmek için buna göre kelepçeleri yeniden ayarlayın. </li><li> Parafilm kelepçeleri örtün. </li><li> , Forseps ile omurilikten emilebilir jelatin sünger sıkıştırılmış çıkarın ince de mümkün olduğunca meninkslerden yerinden kadar skar dokusu kaldırarak, mümkün olduğunca çok sayıda parça kapalı alıyorum. Gerekirse Kapak tuzlu ve yeni sünger ile omurilik maruz. NOT: Herhangi bir kanama sünger ile sadık ya da gerektiği gibi dağlamak ya, çevredeki kas oluşursa. Ancak, koter ile omurilik dokunmamaya özen gösterin. Dağlama sırasında nemli dokusu veya jelatin sünger sıkıştırılmış bir parça ile ya omuriliği örtün. </li><li> Bir wel oluşturunl İlk omurilik sahibinin iki kelepçe ve hayvan taraflar arasında iyi kurmak için diş akrilik kullanarak daha sonra Vetbond ile deri ve doku sızdırmazlık, tarafından daldırma sıvısı tutun. Akrilik tedavileri kadar bekleyin. </li><li> Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile kuyu doldurun ve cerrahi site çevresinde kanama herhangi tekrar kontrol edin. </li><li> İsteğe bağlı bu noktada, görüntüleme sırasında kan damarlarını vurgulamak için kuyruk ven enjeksiyon yoluyla intravenöz floresan gemi boyaları enjekte. NOT: kuantum noktaları ve floresan etiketli lektinleri olarak da yararlı gemi boyaları hizmet rağmen 70 kDa üstünde Floresan dekstran sıklıkla kullanılır. 150.000 WM TRITC-dekstran 50 ul, tipik olarak intravenöz yolla enjekte edildi. </li><li> Fizyolojik olarak uygun immün hücre motilitesini elde edilmesi için, fare ve sıcaklık 37 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. Görüntüleme için mikroskop altında bir sıcaklık kontrollü bir ortamda fareyi hareket ettirin ve doğru Anes için hayvan izlemeknefes hızı ve ayak tutam tarafından hipestezi seviyesi. Dakikada 100 nefesten - 60 bir solunum hızı elde etmek amacıyla, anestezi derinliğini belirlemek için görüntüleme sırasında sık sık hayvan izleyin. </li><li> Mikroskop mercek aracılığıyla görüntüleme sitesini bulun. </li><li> Dinamik görüntüleme verileri elde etmek z-yığın görüntüyü her 30-60 sn almak için 2-foton lazer tarama mikroskobu ayarlayın. </li><li> Görüntüleme oturumu tamamlandıktan sonra ısıtılmış kutusundan hayvan kaldırmak. </li><li> Spinal kelepçelerini gevşetin ve kelepçeler fareyi çıkarın. Kelepçeler çıkarırken deriden de uzak akrilik çekin. </li><li> Fare tekrar görüntüsü gerekiyorsa, omurilik üzerinde tuzlu batırılmış jelatin sünger sıkıştırılmış yerleştirin. Cerrahi sitesi üzerinden kas ve cilt kapatın. Anestezi kurtarma sırasında gözetimsiz bırakmayın hayvan veya diğer hayvanların varlığında yok. Hayvan kurtarma sonra nörolojik belirtisi gösterirse, hayvan ötenazi edilmelidir. Aksi takdirde, euthanizebir CO2 odası içinde fare bu IACUC onaylı ötenazi protokolüne uygun olarak anestezi ortaya çıkmadan önce. </li><li> Üreticinin yönergeleri izleyerek görüntü analiz yazılımı kullanarak floresan görüntüleri analiz. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Gerçek zamanlı olarak patolojiyi izleyen sırasında kendi doğal doku bölümlerinde farklı hücre tiplerinin Görüntüleme etkileşimleri büyük ilgi yarattı. MSS, hücre-hücre teması yoğun ağ içinde ve komşu hücrelerle sinyal normal fonksiyon ve MSS patolojiyi anlamak için gereklidir. Burada, spinal kord mekanik lezyon içinde hücresel hareketin gözlem için 2-foton lazer tarama mikroskobu kullanımı nitelendirdi. Cerrahi ve doku hazırlık kalitesinin yanı sıra, doku mekanik stabilite başarılı time-lapse mikroskobu, hareket objeyi nefes spinal kord özellikle izolasyonu için her şeyden önemlidir. Stabilite hayvanın kalp atış hızı ve solunum tekabül eden bir mikroskop altında, omurilik hareketi için ideal ile değerlendirilebilir. Cerrahi performans ve ayrıca görüntüleme başlamadan hemen önce ise Kararlılık hem değerlendirilmelidir. Anima Eğerl ayarlamaları omurilik kelepçeler yerleştirme ve gerginlik yapılmalıdır, istikrarlı değildir. Kemik iliği kimera yaklaşımları ile birlikte hücre tipi özel flüoresan raportör fare modelleri mikroglia ve akson karşı monositik hücrelerin tanımlanmasına izin vermiştir. Önceki çalışmalar, kan türevi monositler ve mikroglia burada 43 tarif metodoloji kullanılarak travma sonrası ikincil akson hasar için sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Dextran&#39;ın konjuge damar boya hem işaretlerini sağlamak ve damar bütünlüğü ihlalleri tespit etmek damar tanımlama sağlar. Uygun flüoresan raportör fare modelinde seçimi arzu edilen hücre tipleri uygun bir şekilde tanımlanması görüntülü izin vermek için çok önemlidir. Üstlenilen çalışmalar için uygun floresan fare modellerinin geliştirilmesi de deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. CX3CR1 + / GFP iki fagositik nüfus ayırt </sup&gt; MSS hücreleri geleneksel zor olmuştur. Burada gösterildiği gibi, ortak bir immünolojik teknik, ışınlama kimeralar, kemik iliği türevli makrofajlar radyo dayanıklı, merkezi sinir sistemi yerleşik mikroglia ayırmak için kullanılabilir. ışınlama işlemi hücre fenotipleri kan beyin bariyerini zarar ve değiştirme potansiyeline sahiptir, bu nedenle bu modelin kullanımı dikkatle düşünülmelidir. Bu değişikliklerin ölçüde radyasyon dozu hem de geri kazanım dönemi süresi farklıdır ve farklı ateşli modelleri üzerindeki etkisi tam olarak incelenmemiştir. merkezi sinir sistemi, kan-beyin bariyeri ile ışınlama etkileri uygulama sırasında kafa koruyucu ile minimize edilebilir ve bu, omurilik, doğrudan 52 korunmamış olsa bile, aydınlatmadan sonra, omurilik içine, hücre sızmasını azaltmak için gösterilmiştir. Burada kimera oluşmasının bir sonucu olarak kalıcı halde CNS&#39;ye nüfuz eden hücre sayısı uyuşmuş aksine önemsiz olduğunu gözlemiştirlezyon giren hücrelerin er. Dikkate diğer alternatif modeller ilaca bağlı kimeralar 52 veya Parabiyotik fare modelleri 53 içermektedir. Burada, biz 2-foton mikroskopi kullanılarak görüntü kolay omurilik dorsal beyaz cevherde bir lezyon ile sonuçlanan, belirli basit ve tekrarlanabilir küçük yaralanma modeli sunduk. Bu yöntem aynı zamanda literatürde tamamlayıcı sabit doku analizi 16,18,43,48,54 ile birleştiğinde olmuştur dorsal sütunları aksonal kurumaları derecesini tahlil için ölçülebilir lezyon sağlar. Bu modelde, hayvanlar sadece asgari açıkları görüntülemek ve yaralanma sonrası özel bakım gerektirir. Burada anlatılan dorsal kolon ezilme yaralanması ve görüntüleme teknikleri kullanılarak gelecekteki çalışmalar spinal kord yaralanması tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için güçlü tarama araçları olabilir. Bu tedaviler, küçük molekül inhibitörleri, ilaçlar, hücre ürünleri, doku greftleri ve kombinasyon tedavisi bulunabilirs. makrofajlar, mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşim ayrıca, çoklu skleroz, tümör, menenjit ve amiyotrofik lateral skleroz, omurilik diğer hastalık modellerinde, bir rol oynaması olasıdır ve bu teknik de bu hastalıkların incelenmesinde yararlı olabilir .

merkezi sinir sistemi (MSS) hastalık veya yaralanma iltihabi reaksiyon kötü, özellikle doku içinde bağışıklık ve yerleşik hücreleri arasındaki etkileşimler açısından, anlaşılmaktadır. Omurilik bu hücresel etkileşimler araştırmalar canlı bir hayvanda özel bir öneme sahiptir. Sadece kolayca erişilebilir MSS beyaz cevher yolu bu mümkün deneysel yaklaşımı geliştirmeye çaba için önemli bir alan yapım, omurilik dorsal sütunlar bulunmaktadır. Bu araştırmalar nedeniyle erişmek ve görüntüleme için MSS stabilize teknik zorluk sınırlı olmuştur. Omurilik Canlı görüntüleme ilk tetkikten sonra birkaç saat ötesinde bir omurilik yaralanması önce, ancak, birkaç çalışma 1-13 ele hücresel hareketi tarif edilmiştir. travmatik omurilik lezyon nöronlar, astrositler, fibroblastlar, NG2 progenitör hücreleri ve bağışıklık hücreleri includi ile, karmaşık bir ortamdırmikroglia, nötrofiller, makrofajlar, T-hücreleri, B hücreleri ve dendritik hücreler 14,15 ng. Makrofajlar dolaşımdan infiltre lezyonda fagositoz sorumlu bağışıklık hücrelerinde, bir alt kümesidir. Bu fagositik hücrelerin rolü bu hücrelerin yaralı dokuda hasar ve koruyucu rolleri hem alabilir belirten raporları ile tartışma konusu olmuştur. Bu roller yaralı hayvan 21,23,24 fonksiyonel açıklarının bir yara alarak fenotip şifa ve azalan bir yaralanma sonrasında sekonder aksonal tepe kurumalarına artan ve bir fagositik bir şekilde 16-22 hareket aralığı. Daha önce, öncelikle sağlıklı dokuda morfolojisi dayanıyordu mikrogliada gelen makrofajlar ayırt çalışır. Ancak, aktif mikrogliya ve makrofajlar aynı belirteçlerin birçoğu ifade ve bas çalışmak zordur, bu hücrelerin farklı etkinlikler ayrılmasını yapma, yaralanma 25-29 sonra ayırt morfolojisi gösterilecek30 yalnız bu faktörlere ed. Bu yaklaşım, in vivo olarak, bu hücre tiplerinin ayırt edilmesi daha az yararlı olmasına rağmen, bu hücreler, 33,34, akış sitometrisi kullanılarak CD45 ayırıcı ifadesi ile ayrılabilir. Monositler gibi bu belirteçlerin ifadesi dinamik değişimler doğru analiz 35,36 komplike edebilir makrofajlar içine ayırt rağmen mikroglia ve makrofajlar içinde CCR2 ve CX3CR1 ve kullanmak diferansiyel ifadesi de, araştırılmaktadır. Makrofajlar kemik iliği atalarıdır türetilen ve bir hakaret 31,32 sonra yaralı MSS girmek sırasında mikroglia, MSS ikamet bağışıklık hücreleri ve fetal gelişim sırasında sarısı kesesi atalarıdır kaynaklanmaktadır. Bu iki hücre tiplerini ayırt etmek morfoloji kullanarak alternatif bir yaklaşım MSS ikamet korurken, donör atalarıdır türetilen makrofajlar izlenebilir işaretleyici ifade eden bir donör hayvandan atalarıdır ile kemik iliği değiştirmektir, tilki kuyruğutakabilir türetilen mikroglia. Bu kemik iliği kimerik modelleri yaygın pek çok diğer uygulama 37-40 kullanılmaktadır. Bu yöntem, bu nedenle belirli uygulamalardaki kullanımını sınırlamaktadır konakçıda, ilik progenitörlerinden ortadan kaldırmak için, kullanılan ışıma ya da sitotoksik ilaçların neden olduğu kan-beyin engelinin bütünlüğüne hasar ile ilişkili benzeri olmayan uyarılar yer alır. Son zamanlarda, MSS mikroglia ve makrofajlar arasındaki işlevsel farklılıklar flow sitometri, gen çip dizisi analizi ve gelecekte çok yararlı olacağını kimerizm yöntemleri 24,26,41-44 kullanarak ayırt edilmesi başlıyor. Bu iki hücre tipleri ayıran zor olmasına rağmen, kendilerine özgü işlevleri anlamak CNS içinde hem de mikroglianın ve makrofajlar içeren bozuklukların daha hedefli tedaviler yol açan önemlidir. Spinal kordon hasarı hücresel etkileşimler Açıklaması ilk olarak hücre kültürü modelleri çalışmalardan elde gelmiştir. Bu dcanlı bir hayvanda bir araya görüntüleme spinal kordon hasarı ve bağışıklık hücreleri ile ilgili sorunlara vi. Değişen tipine ve şiddetine spinal kord yaralanması Güncel kemirgen modelleri kontüzyon modelleri 45,46, pin-prick yaralanmalar 2, laserasyon 47, ve burada 16,18,48 açıklanan dorsal kolon ezilme yaralanması bulunmaktadır. Meninkslerde Enflamasyon yaralanma şiddeti artar ve seri görüntüleme için pencere veya cerrahi implantasyon için benzersiz zorluklar oluşturmaktadır. Bu sorunlardan bazıları fagositik hücrelerin infiltrasyonu yanı sıra cerrahi sitesi üzerinden fibröz doku oluşumunu içerir. Dorsal kolon ezilme yaralanması incelemek için buraya yapıldığı gibi, bu konuların bazıları, küçük lezyonlar oluşturmak ve dura ve sonraki yeniden açılması ameliyatı için izin paraspinöz kaslar arasındaki olmayan bağışıklık cerrahi pansuman ile maruz omurilik kapsayan üstesinden gelinebilir . Spin görüntü sadece dorsal kısmı yeteneğikontüzyon modelleri öncelikle sık yaralanma 45,49 sonra özellikle erken zaman noktalarında, sırt sütunların en dorsal kısmını koruyucu, merkez kordon zarar beri el kablosu da, yaralanma seçim sınırlar. Bu nedenle, lezyon içi ve lezyona aksonal konumda kolayca ölçümü için hücre hareketinin gözlenmesi için yararlıdır olan temiz, tekrarlanabilir, dikdörtgen şekilli bir lezyon verir, basit bir yaralanma modeli açıklar.

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 GFP mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP H mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>Mouse pie cage</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 set</td><td></td></tr><tr><td>60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Petri dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;mu;m cell filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>21 gauge needle</td><td>BD</td><td>305177</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>For FACS verification of chimeras</td></tr><tr><td>30 gauge insulin syringe</td><td>BD</td><td>328280</td><td>For tail vein injection</td></tr><tr><td>Spinal Cord Clamps</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic powder</td><td>Lang Dental</td><td>REF1320</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Gelfoam gelatin sponges</td><td>Pfizer</td><td>9034201</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon sutures</td><td>Ethilon</td><td>1667G</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Reflex Clips, 7 mm</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750344</td><td>For surgery. Sterilize before use</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>45/5 Forceps, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>30 gauge needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td>For making access holes in dura</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #4 Biology tips</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Needle Drivers</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Michel Wound Clip Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700753</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Wound clip remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>O-rings for Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-00</td><td>For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td></tr><tr><td>Cordless Rechargable Animal trimmer</td><td>Wahl</td><td>Series 8900</td><td>for surgery</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Nair Hair remover lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc.</td><td>NRSL-22329-05</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery</td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously</td></tr><tr><td>Bupernex</td><td>Henry Schein</td><td>121-7793</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Chemicals from Sigma</td><td>119 mM NaCl&lt;br /&gt;26.2 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;2.5 mM KCl&lt;br /&gt;1 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;1.3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;10 mM glucose</td><td>For surgery&lt;br /&gt;From Cold Spring Harbor Protocols</td></tr><tr><td>TRITC-dextran 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>For intravenous administration to label vasculature</td></tr></tbody></table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Dorsal kolon ezmek lezyon gösteren bir şematik Şekil 1A gösterilmiştir. Lezyon sonra hayvan hazırlanır ve spinal kelepçeleri (Şekil 1B) kullanılarak intravital mikroskobiyle için stabilize edildi. Dorsal kolon ezilme yaralanması hemen sonra çekilen bir görüntü açıkça belirtilmektedir forseps tine ekleme noktaları ile açıkça görülebilir dikdörtgen lezyon gösterir. Yara bölgesinde Aksonlar tüm sırt kolonu (Şekil 1C) süresi boyunca ayrılır. kan damarlarının bütünlüğü bozulmadan kalır ve damar Sızıntı hiçbir kanıt floresan sayesinde ispatlanmıştır. Hafta boyunca aynı lezyonun seri görüntüleme gerçekleştirmek için, kaslar ve cilt sonra yeniden maruz kalma laminektomi üzerinde dikilebilir. Benzer lezyon morfolojisi sonra zaman noktalarında (Şekil 1D, E) görülür. 5 gün yaralanma sonrası, forseps ekleme siteleri hala görünür ama lezyon boyutu d artmaya başlamıştırinflamasyon nedeniyle ikincil yaralanma vi. Lezyonun kuyruk ucundaki akson &quot;aksonal geriye doğru kurumaların yaygın&quot; denilen bir işlem yoluyla yaralanma ilk siteden geri gelmiş. Lezyonun rostral sonunda aksonlar Wallerian gibi dejenerasyon (Şekil 1D, E) sergiledi. Gün 5 ve yaralanma sonrası 22 arasında, lezyonun büyüklüğü stabilize. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bu hücrelerde (makrofajlar karşı mikroglia) kimlik hazırlanmasında ayırt edilemez, ancak eş zamanlı olarak, CX3CR1 + hücrelerinin büyük bir akışı, ve bu zaman noktalarının sırasında ezilme lezyon çevresinde infiltre görülebilir. Ezilme lezyon mikro-içinde mikroglia ve makrofajlar davranışını ayırt etmek için, bir ışınım kimera modeli (Şekil 2A&#39;da tarif edilmektedir) kullanılmıştır. İlk olarak, bir CX3CR1 + / GFP fare kemik iliği projenitör hücrelerin florenas özelliğine sahip olmayan verici cel ile değiştirilirls, böylece sadece GFP + MSS-resident mikrogliya floresan görüntüleme görebilir. kemik iliği yeniden etkinliği 8 hafta iliği nakli (Şekil 2B, C) ​​sonra periferal kan incelemesi akış sitometresi ile teyit edilebilir. Şekil 2B, F4 / 80 ve GFP pozitif makrofajlar ise, mavi vurgulanan, hangi bazı GFP negatif ama F4 / 80 olumlu monositler de mevcut, bir CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 kimerik fare tespit edilir. Şekil 2C, herhangi bir çift pozitif F4 / 80 ve GFP pozitif hücrelerinde vahşi tip kemik iliği CX3CR1 + / GFP alıcı kemik iliği değiştirilmesinden sonra bırakılır. Yaralanma önce mikrogliya eşit bir dinlenme, dallanmış morfolojisi (Şekil 2B) görüntüleme, omurilik içinde dağıtılır. 8 gün yaralanmasından sonra, sadece bir kaç mikroglia ve lezyon çevresinde tespit edilebilir. Bu mikroglia bir amoeboid morfolojisi (Şekil 2E) görüntüler. İkinci olarak, kemikBir floresan olmayan fare kemik iliği projenitör hücrelerinin, bu nedenle, kemik iliği CX3CR1 + monositleri / GFP floresan görünür makrofajlar (Şekil 2A) türetilen, bir fazla CX3CR1 + / GFP fare kemik iliği hücreleri ile değiştirilmiştir. Yaralanma önce, sadece GFP + tespit hücreler, kemik iliği kaynaklı ve sürekli olarak düzenli bir şekilde 28 (Şekil 2F) ile teslim olduğu rapor edilmiş olan, büyük ölçüde perivasküler bulunmaktadır. Ezilme yaralanması sonrasında, CX3CR1 + / GFP hücreleri lezyon (Şekil 2H-J) çevreleyen kan damarlarının iç kısmı boyunca görülebilir, ve lezyon merkezi CX3CR1 + / GFP makrofajlar (Şekil 2G) infiltre ile doldurulur. Dorsal sütunları Zaman atlamalı görüntüleme 6 saat kadar için yapılabilir. Burada dolaşımdan hücreleri görmek mümkündür Şekil 3&#39;te, yaralanmadan sonra hemen olmayan bir kimerik CX3CR1 + / GFP fare göstermektedirn lezyon çekirdeğe doğru kan damarı dışarı hareket ve yaralanma sitesinde (Şekil 3A, B, Ek Film 1) içinde hareket. Makrofajlar (; Ek Film 1 Şekil 3A, B) tarafından alınan yolları izleyebilirsiniz hücreleri tanımlamak için floresan yoğunluğu kullanan Görüntü analizi. Gibi görüntü analizi, elde edilen istatistikler lezyon makrofajların ortalama motilite 3.6 mm / dakika (Şekil 3D) olduğunu göstermektedir. Yaralanma, akson, mikroglialar ve makrofajlar sonra 22 gün hala görüntüleme alanını gösteren lezyon içinde tespit edilebilir nihayet, zaman (Ek Film 2) uzun süreler boyunca stabildir. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: Yaratılış ve dorsal kolon ezilme yaralanması sıralı görüntüleme. (A), sırtSütun ezilme yaralanması ilgi düzeyinde vertebra dorsal sürecini kaldırarak yapılır. Forseps dışında omurilik 1 mm dorsal sütuna yerleştirilir ve daha sonra mor gösterilen lezyonu üretmek için 3 kez kapalı. (B) Hayvan daha sonra omurilik ile konumlandırılmış intravital görüntüleme için istikrar elde etmek için kelepçeler. (C) Hemen yaralanma sonrası, forseps ekleme siteleri (kırmızı oval) ve dikdörtgen ezilme yaralanması hacmi (gri kutu) açıkça tespit edilebilir. Dorsal kök aksonların (beyaz oklar) yanı sıra, bir lezyon (dolu ok başları) kaudal tarafında akson yaralı uçlara görülebilir. (D) 5 gün yaralanma sonrası, forseps girme mevkilerini (kırmızı, oval ), ve lezyon (gri kutu ölçüde) hala kolayca görülebilir. lezyon ilk hakaret beri boyutu artmıştır. Wallerian gibi dejenerasyon geçiren aksonlar Additi lezyon (açık ok başları) rostralinde görülebilirdorsal kökler (beyaz oklar) ve yaralı akson uçlarında (beyaz ok başları). (E) 22 gün yaralanma sonrası akson üzerine, lezyon site hala 5 gün sonra yaralanma benzer boyutları ile tanımlanabilir. Ve hasarlı alana çevresinde CX3CR1 + hücrelerinin büyük sayısını not edin. Etiketli Özellikler (D) &#39;de olduğu gibidir. Tüm ölçek çubukları 200 mikron =. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2: kimerik farelerin İnşaat dorsal kolon ezilme lezyon CNS-yerleşik mikroglia veya kemik iliği kökenli makrofajlar ifade CX3CR1 + / GFP izlemek için. (A), CX3CR1 + / GFP ya da mil ifade kimerik farenin üretimi bir şematik diyagramıdırcroglia ya da makrofajlar. İlk olarak, Thy-1 YFP lH farenin ışınlanır ve kemik iliği olan makrofajlar GFP + olan bir kimerik fare ile sonuçlanan bir CX3CR1 + / GFP fareden izole edilen kemik iliği hücreleri ile sulandırılır. İkinci olarak, Thy-1 YFP lH / CX3CR1 + / GFP farelerden ışınlanır ve kemik iliği olan mikroglia GFP + olan bir kimerik fare üreten bir floresan olmayan bir fareden izole edilen kemik iliği hücreleri ile yeniden oluşturulur. (B) veri akış sitometrisi Örnek ışınlanmış, C57BL / 6 alıcıya nakledilen bir CX3CR1 + / GFP kemik iliği verici ile bir kimerik bir hayvandan alınan kan F4 / 80 + ve CX3CR1 GFP + hücreleri ile. Bir C57BL6 bir kimerik hayvanda F4 / 80 + ve CX3CR1 GFP + hücreleri ile veri akış sitometri mavi bir alan öne hem de GFP ve F4 / 80 pozitif olan CX3CR1 pozitif donörlerden elde edilen hücreler gösterilmiştir. (C), Örnek Donör iliği bir ir nakledilenYayılan CX3CR1 + / GFP alıcı. Mavi alan vurgulanan içinde çift pozitif CX3CR1 + / GFP ve F4 / 80 hücrelerinin eksikliği dikkat. (D) birinci kimerik düzeni bir fare bir intravital iki foton mikroskobik anlık, dorsal içinde dallanmış morfolojisi ile GFP + mikroglia gösteren Kolon (ok başı). Bu hücreler dorsal kök ve dorsal sütununda akson (sarı) arasında serpiştirilmiş. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (E) aynı fare Intravital görüntüleme (B) 8 gün dorsal kolon yaralanma süreçleri (ok kafa) eksik olan büyük ve şekilli amoeboid hücre gövdeleri ile bir kaç CX3CR1 + mikroglia ortaya sonra. MSS parankimi içinde yetersiz GFP + makrofajlar gösteren Ölçek çubuğu ikinci kimerik düzeni bir fare = 100 mikron. (F) Fotoğraf (A),. 100 um. 8 gün sırt kolon yaralanmadan sonra (G) (F) &#39;de, aynı fare intravital görüntüleme al ortaya = Ölçek çubuğuve lezyonun etrafında makrofajların arge akını. Ölçü bar = 100 um. (H), yaralanmamış hayvanda damarları ile temas CX3CR1 + kan kökenli hücrelerden daha yüksek bir büyütme görüntü. Ölçü bar = 30 um. Kabın iç tarafından bakıldığında kabı ile temas halinde CX3CR1 hücrelerinin (I) yeniden oluşturma. Ölçü bar = 30 um. (J), tekne ile temas içindeki CX3CR1 bir hücre yeniden düzenleme, kabın dışarıdan görülebilir. Ölçek çubuğu = 20 mikron. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 3 :. Hemen dorsal kolon ezmek sonra olmayan bir kimerik CX3CR1 + / GFP fare Temsilcisi hücre izleme verileriyaralanma. (A) hemen dorsal kolon ezilme yaralanması sonrası CX3CR1 + mikroglia ve Katkı Film 1 makrofajlar etrafında hasarlı aksonlar (sarı) bir anlık. (B) (gri) yolları (A) CX3CR1 + hücreleri tarafından alınan bir 110 sırasında dk Intravital görüntüleme oturumu. (C) (B) parçaların bir zaman kodlu gösterimi. Zaman çubuğunda gösterilen parçalar, bütün 110 dakika film içindeki zamana göre renklidir. CX3CR1 + hücrelerin genel motilite (D) Histogram. Tüm ölçek çubukları 30 mikron bulunmaktadır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ek Film 1: hemen çift heterozigotlarda dorsal kolon ezilme yaralanması sonrası Temsilcisi intravital film Thy-1 YFP / + <stRong&gt; / CX3CR1 GFP / + fare. Intravital spinal görüntüleme T11 seviyesinde dorsal kolon ezilme yaralanması hemen sonra yapıldı. Sağ paneli CX3CR1 + mikrogliya ve makrofajlar hareketini gösterir. Hücre hareketinin yolları sol panelinde beyaz parça olarak gösterilmiştir. yaralanma sol üst köşesine yer almaktadır. CX3CR1 + hücreleri, bu raylar boyunca yaralanma bölgesinde doğru hareket görülebilir. Aksonlar sarı gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 40 mikron =. Toplam süre: 110 dak. Çalma hızı: 300x. Ek Movie 2:. Çift heterozigot Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + fare dorsal kolon ezilme lezyon sonra 22 gün Temsilcisi intravital film burada gösterilen 22 gün ilk dorsal kolon ezmek sonra bir fare alınan bir temsilci film Spinal düzeyde T11 de yaralanması. enjUry çerçevenin sağ üst köşesinde yer almaktadır. Aksonlar (sarı) artan rostrally sağ alt köşesinde gösterilir. dorsal ven ve kan damarları (kırmızı) TRITC-dekstran ile etiketli. Hemen yaralanma sonrası kıyasla daha yavaş bir hızda hareket lezyon içinde CX3CR1 + hücreler. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Toplam süre: 90 dk. Çalma hızı: 600x.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Video: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Erişkin Farelerde Cam Omurilik Windows&#39;u implante

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Tıp

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Omurilik Görüntüleme

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler