NSF-MR program (CHE: 1229103) yeni kontrol elektroniği, yazılım, sıvı hücreleri ve bir çift AFM / STM montajı için gerekli diğer ekipmanların satın finansman için kabul edilmektedir. Biz AFM enstrümantasyon, eğitim ve görüntüleme ile yardım Chicago NSF-MRSEC programının Üniversitesi (DMR-0820054) de ortak tesisler kabul ve enstrüman süre Malzeme Araştırma Olanakları Ağı (DMR-0820054) hazır. Biz özellikle bizim kampüs için gerekli enstrümantasyon getirdi NSF-MR teklifin finansmanı önce öğrencilerimizi ağırlamak için Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller ve Prof Ka Yee Lee teşekkür ederim. Sarf malzemeleri için yaz araştırma öğrenci ve öğretim burslarını yanı sıra destek sağladı Northeastern Illinois Üniversitesi&#39;nde verilir: (P031C110157 ID) Biz Başlık III KÖK hibe fon yny. Son olarak, biz devam enstrümantal destek ve r için izin Bruker-Nano, Inc kabulPeakForce QNM mekanizmasını gösteren bir arsa eproduce ve otomatik yazılım açıklamak için kelime ScanAsyst kullanımı.

1. Bilgisayar ve Mikroskop Kurma <ol><li> N 2 silindir vanasını açın ve hava masa yüzen ve seviye sağlamak için kolları ayarlayın. </li><li> Bu sırayla bilgisayar, kontrolör ve fiber optik ışık açın. </li><li> AFM / LFM moduna tarayıcıyı ayarlayın ve AFM başının üzerinde kamera ortalamak. </li><li> Açık yazılım. Seç deneme kategori &quot;Nanomekanik Özellikleri&quot;, deney grubu altında &quot;Niceliksel Nanomekanik Haritalama&quot; ve deney altındaki &quot;Sıvı içinde PeakForce QNM&quot;. Yük Deney ve ardından Kur&#39;u tıklatın. </li><li> Sahnenin yüzeyini görmek için Z objektif kullanarak kamerayı odaklanın. / Aşağı kaba kadar kullanılması piezos yaklaşık 1 mm AFM kafası açıklığı yüzeyinin altına sahne taşımak. </li></ol> Mika Yüzey 2. Hazırlık <ol><li> Temiz bir örnek desteği disk (15 mm çapında, 0.8 mm kalınlıkta) bir yüzü üzerine bir yapışkan basın. Mika V-4 itinyapıştırıcı üzerine sınıf disk (25 x 25 x 26 mm) sıkıca bağlı kadar. </li><li> Tamamen hava kabarcıkları ile yapıştırılır sağlanması mika üzerine şeffaf bir bantla bir parça sürün. Eşit bir şekilde tutunmaya bir taraftan mika kapalı bandını çıkarın. Mika düz sigortalamak için gerekirse tekrarlayın. </li><li> Grip, destek diski, dairesel cımbız (Disk tutucular) bir çift ile temiz mika yan, ve tarayıcı üzerine yerleştirin. Mika AFM kafa deliğin seviyesinin altında olması gerekir. </li></ol> 3. Sıvı Hücre Montaj ve Mika Yüzey Görüntüleme <ol><li> Sıvı hücre, O-ring, şırınga adaptörü, hortum adaptörü, ve% 100 etanol fırlatma hortumu durulayın. DI suyla akışkan hücre durulayın. Tüm parçaları hava tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Temiz sıvı hücre üzerindeki portuna hortum adaptörü itin. Yavaşça yassı başlı cımbız kullanarak sıvı hücre merkezi girinti içine O-ring basın. </li><li> Prob tutucu klip üzerinde hafifçe yayı basın ve Groov uzak çevirmekBahşiş için e. </li><li> Yassı başlı cımbız ile uzak ucundan uzun sonuna probu kavrayın. Hücrenin merkezine bakan ucu ile oluk içine sonda yerleştirin. Yayı itin ve (Şekil 1B) tespit etmek için sonda üzerinde tutma klibi ayarlayın. </li><li> Tam olarak (Şekil 1C) geri çekilir sağlamak için AFM kelepçeyi edin. </li><li> Sıvısı hücre, O-ring yerleştirin ve mika numune üstüne aşağı bakacak sınayın. Sıvısı hücre AFM Çıtçıt üzerine dinlenmeye bırakın. Sahnede sıvı hücreyi dengelemek için kelepçe indirin. Görsel muayene sıkıca destek disk ve sıvı hücre arasındaki sıkıştırılmış O-ring gösterene kadar mikroskop aşağı düğmesine basın. </li><li> Monitörü izlerken, ekranın üzerindeki sıvı hücrenin üst görselleştirmek için kaba ayar düğmesini odaklanır. </li><li> X / Y ayar düğmeleri ve Z objektif kullanarak ucu açık bir görüntü kalmayıncaya kadar mikroskop taşıyın. Ucu app olacakbir metalik, altın üçgen gibi kulak. Mikroskop altındaki piezo kolu ile numune yüzeyine yakın ucu hareket ettirin. Ucunun yansıması odaklanın. Onun yansıması ilişki içinde gerçek konsol takip edin. Bu aşamada, yakından uyumlu, ancak tamamen üst üste olmasına izin verilmemelidir. </li><li> 1 ml steril bir şırınga şırınga adaptörü takın. Şırınga adaptör için çıkarma hortumun bir ucunu ve tampon çözeltisi kap içindeki hortumun diğer ucuna yerleştirin. Tamamen şırınga pistonu uzatmak. </li><li> Sıvı hücre üzerinde hortum adaptörü hortumunu takın. Sıvı tamamen merkezi odasını doldurana kadar pistonu hafifçe bastırın. Hava kabarcıkları vardır sigortalamak için hücreyi kontrol edin. Mikroskop üzerine sıvı hücreden dışarı dökülüp hiçbir sıvı olduğunu görmek için kontrol edin. Yükseltilmiş bir katı destek üzerinde şırınga. </li><li> Ekranda lazeri (dağınık kırmızı nokta) bulmak için kamera beslemesini ve X / Y çeviri düğmeleri kullanın. Lazer cam hareketini kullanarak,ent kontrol düğmeleri, ucuna lazer taşıyın. </li><li> (6 - değeri = 4) mikroskop görüntülenen toplam sinyali en üst düzeye kadar ince lazer ve ayna kontrolleri ayarlayın. </li><li> (± 0.1) mümkün olduğunca sıfıra yakın mikroskop görüntülenen dikey ve yatay deplasmanlar düşürmek için sol arka tarafında düğmeleri ve tarama kafasının sol üst tarafında kullanarak kadranda diyot açısını ayarlayın. </li><li> Yazılımında, satın alma seçenekleri seçin. Asgari seçin yüksekliği (iz ve Muvazzaf), pik kuvveti hata ve deformasyon at. Diğer seçenekler bağımlı kullanıcı ve deneye tarafından istenen belirli bilgilere dayanarak uygun olabilir. </li><li> Her edinim pencerede RT Plane Fit &quot;satırını&quot; seçeneğini seçin. Yüksekliği pencerelerde OT Düzlem Fit &quot;hiçbiri&quot; seçeneğini seçin. Zaten bitmiş değilse X ve Y, sıfıra ofset ve tarama açısı ayarlayın. </li><li> 1 Hz, 256 hat başına numune, ScanAsyst oto kontrol için tarama hızını ayarlamakbirey ve kapalı olarak ScanAsyst otomatik Z sınırı. 500 nm Z sınırı değiştirebilirsiniz. 1 um tarama boyutunu ayarlayın. </li><li> Meşgul tıklayın. Bu noktada, uç yüzeyi yaklaşır. Ucu yaklaşırken, ekranın sol alt köşesinde Z piezo voltaj değişimini gözlemlemek. Ucu aralığının dışına çıkarsa, ucu ve yeniden bir yaklaşım çekilme. Bu başarısız olursa, ucu başarılı bir yaklaşım olması için değiştirilmesi gerekebilir. Ucu devreye girdikten sonra, satırları bir görüntü oluşturacaktır edinim pencerelerin her görünmeye başlayacak. </li><li> 1 x 1 mikron de mika fotoğraf çekmek ve mika yüzey temiz ve düz olmasını sağlamak için yavaş yavaş yakınlaştırın. Göründükleri gibi görüntüleri kaydetmek için sürekli yakalama tıklayın. Büyüt ve istediğiniz gibi yüzeyi etrafında hareket ettirin. </li></ol> 4. Protein Biriktirme ve Görüntüleme için Numune Hazırlama <ol><li> Saflaştırılmış protein örneği 38 Edinme ve buz üzerinde tutmak. Bir Dondurucuda ise, üzerinde örnek çözülme5 dakika boyunca buz. </li><li> / Ml buzdolabında kullanarak görüntüleme tampon çözeltisi 0.0010 mg protein sulandırmak. Burada kullanılan görüntü tamponu 15 mM Tris-HCI (pH = 8.0), 150 mM NaCI ve 15 mM MgCI2 olduğunu. </li><li> 4 odacığı (100 x 15 mm) buzdolabında görüntüleme tampon solüsyonu ile Petri doldurun. Solüsyonun en azından her biri 5 mi oda doldurun. Yavaşça mikropipetöre sabit şekilde bağlı olan ucu ile seyreltilmiş protein çözeltisi karıştırılır. </li><li> Hazırlanmamış mika yüzeyine seyreltilmiş protein çözeltisinin 200 ul uygulayın. 30 saniye sonra, dairesel cımbız (Disk tutucular) ile protein / mika yüzey pick up. Bench için örnek paralel tutun. </li><li> Örnek tutarken örnek Petri kabı havza paralel olmasını sağlama hemen petri kabının (adım 4.2) birinci kadran içinde bulunan tampon çözeltisi içinde örnek bırakın. 1 saniye sonra, örnek çıkarın. </li><li> Havzasına örnek paralel tutmaya devamPetri kabı, kalan üç çeyrek daire için adımı 4.5 tekrarlayın. </li><li> Aşırı nem emmek ve mikroskop sahneye diski aktarmak için kuru tozsuz bir bez üzerine diski yerleştirin. Bezle gerçek yüzeyine dokunmayın. Örnek kurumasına izin vermeyin. </li><li> 3.16 - Tekrar 3.6 adımları. </li></ol> Mika 5. Görüntüleme Proteinler <ol><li> Ekranın sol tarafında onay parametreleri kutusuna tıklayın. Bahar boyutu ve uç yarıçapı ucu kullanılan dayalı ayarlanması gerekir. </li><li> Meşgul tıklayın. Benzer şekilde, mika görüntüleme işlemi (aşama 3.17) için, uç yaklaşırken z piezo pencere izleyin. </li><li> Izleyen en az iki geçiş için görüntü Tarayıcıyı aynı alanı izin verin. Toplanan her görüntüyü kurtarmak için sürekli yakalama tıklayın. </li><li> Yeni bir bölgeye tarayıcıyı hareket ve / veya istediğiniz gibi görüntü boyutunu değiştirmek. </li><li> Otomatik yazılım ayarlama bittikten sonratarama parametreleri belirli bir görüntü boyutu için, yazılımı kapatın. </li><li> Elle ince ayar için görüntünün odağını tarama hızı, z sınırı, satır sayısını, ve gerilimini ayarlamak. Görüntü çok odak dışı olursa, özgün başlangıç ​​konumunu geri geri yazılım açın. Bir protein yakınlaştırma sırasında bir görüntünün çözünürlüğünü artırmak için, tarama hızı azaltmak ve orantılı hatlarının sayısını artırmak. </li><li> Deneyden sonra,% 100 etanol ile sıvı haznesini temizlemek DI H2O ile yıkayın Sıvı hücre tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Ham veri görüntüleri işlemek için veri yazılımını açın. İlk olarak, düzleştirmek ikonuna tıklayarak görüntüyü düzleştirmek. Sipariş inci Zero seçin ve yürütmek tıklayın. Görüntüye bağlı olarak, uygun bir şekilde uygun düzlem düz görüntü elde etmek için gerekli olabilir. Bu durumda, düzlem uyum simgesini seçin ve imleci kullanarak görüntünün düz bir alanda bir uçak çizin. Yürütmek tıklayın. Gerektiği kadar tekrarlayın </li><li> Selvb kesit sekme proteinin boyutların ölçülmesi. Imleç ile bir çizgi analiz edilmesi molekülü veya alan üzerinde hareket çizin. Birden fazla alanlar için tekrarlayın ve yazılım bir bindirme oluşturur. Resmi veya diğer yazılım ve çizim programlarına uyumlu bir formatta resim oluşturmak için kullanılan verileri. </li></ol>

<ol>
	<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscope.">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-Resolution+Microscopy+in+Water+Science.">Atomic-Resolution Microscopy in Water Science.</a> 232, 211-213 (1986).</li><li>Nikiforov, M. P., Darling, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+Quantitative+Conductivity+and+Mechanical+Properties+Measurements+of+Organic+Photovoltaic+Materials+using+AFM.">Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM.</a> J. Vis. Exp. 71, (2013).</li><li>Bahatyrova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Native+Architechure+of+a+Photosynthetic+Membrane.">The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane.</a> Nature. 430, 1058-1061 (2004).</li><li>Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Studies+of+Native+Photosynthetic+Membranes.">Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes.</a> Biochem. 48, 3679-3698 (2009).</li><li>Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+visualization+and+characterization+of+Myxococcus+xanthus+cells+with+atomic+force+microscopy.">Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).</li><li>Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Protein-Protein+Interactions+in+Real-Time.">Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time.</a> Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).</li><li>Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Biological+Surface+Science,+Challenges+and+Recent+Advances.">Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances.</a> ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).</li><li>Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Mechanical+Properties+of+Living+Cells+Using+Atomic+Force+Microscopy.">Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (76), (2013).</li><li>Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Recombinant+DNA+and+Protein+Complexes+Using+Atomic+Force+Microscopy.">Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), (2011).</li><li>Poggi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe+Microscopy.">Scanning Probe Microscopy.</a> Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).</li><li>Rico, F., Su, C., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Mapping+of+Single+Membrane+Proteins+at+Submolecular+Resolution.">Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution.</a> Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).</li><li>Foster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+State+of+Microscopy+for+2012.">The State of Microscopy for 2012.</a> Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).</li><li>Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+Forces+in+High-Resolution+Imaging+of+Soft+Matter+in+Liquid.">Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid.</a> ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).</li><li>Kaemmer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Bruker&#8217;s+ScanAsyst+and+PeakForce+Tapping+AFM+Technology.">Introduction to Bruker&#8217;s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology.</a> , (2011).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+imaging+of+biological+systems+by+force-distance+curve-based+AFM.">Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM.</a> Nature Methods. 10, 847-854 (2013).</li><li>Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+high-resolution+imaging+of+native+proteins+by+force-distance+curve&#8211;based+AFM.">Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve&#8211;based AFM.</a> Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).</li><li>Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+Chemical+Groups+while+Imaging+Single+Native+Proteins+by+High-Resolution+Atomic+Force+Microscopy.">Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy.</a> Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).</li><li>Berquanda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+of+Living+Cells.">Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells.</a> Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).</li><li>Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyphosate-induced+Stiffening+of+HaCaT+Keratinocytes,+a+Peak+Force+Tapping+Study+on+Living+Cells.">Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells.</a> J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).</li><li>Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Mechanical+Heterogeneity+of+the+Erythrocyte+Membrane+Reveals+Hallmarks+of+Membrane+Stability.">Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability.</a> ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).</li><li>Tobias, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe+Microscopy+of+Bacterial+Red-Light.">Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light.</a> Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).</li><li>Sorenson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Structure+of+a+Unique+Bacterial+Red+Light+Photoreceptor+as+Revealed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy.</a> Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).</li><li>Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+phytochrome:+a+picture+is+worth+a+thousand+spectra.">The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra.</a> Plant Cell. 18, 4-14 (2006).</li><li>Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+classes+of+red/far-red+photochemistry+within+the+phytochrome+superfamily.">Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).</li><li>Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformational+changes+of+Agrobacterium+phytochrome+Agp1+during+chromophore+assembly+and+photoconversion.">Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion.</a> Biochem. 46, 4164-4176 (2007).</li><li>Noack, S., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+modulation+of+histidine-kinase+activity+in+bacterial+phytochromes+monitored+by+size+exclusion+chromatography,+crosslinking,+and+limited+proteolysis.">Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis.</a> Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).</li><li>Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+structure+and+signaling+mechanisms.">Phytochrome structure and signaling mechanisms.</a> Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).</li><li>Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophytochromes+Are+Photochromic+Histidine+Kinases+Using+a+Biliverdin+Chromophore.">Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore.</a> Nature. 414, 776-779 (2001).</li><li>Takala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+amplification+and+transduction+in+phytochrome+photosensors.">Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors.</a> Nature. 509, 245-248 (2014).</li><li>Filonov, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Near-Infared+Fluorescent+Protein+for+in+vivo+Imaging.">Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging.</a> Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).</li><li>Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Origin+of+Fluorescence+in+Bacteriophytochrome+Infrared+Fluorescent+Proteins.">On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins.</a> J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).</li><li>Lehtivuori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Properties+of+the+Chromophore-Binding+Domain+of+Bacteriophytochrome+from+Deinococcus+radiodurans.">Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans.</a> J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).</li><li>Toh, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Reactions+of+Bacteriophytochrome+Observed+with+Ultrafast+Mid-Infrared+Spectroscopy.">Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).</li><li>Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

There are no competing financial interests or conflicts of interest.

AFM fizyolojik ilgili koşullarda proteinler ve diğer biyolojik makromoleküllerin görüntüleme tamamen yetenekli bir tarama prob mikroskop yöntemidir. X-ışını kristalografisi ve NMR ile karşılaştırıldığında, AFM biri sınırlama aynı çözünürlüğü, özellikle yanal çözünürlük elde etmek için onun yeteneksizliği. Herhangi bir yüzey üzerinde bir molekül analiz etmek için kullanıldığında, AFM veriler incelendiğinde, molekülün görüntü yüzeyinin etki ve sonda da göz önüne alın...

Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 1986 yılında buluşun (Şekil 1) bu yana yüzeyleri, ince filmlerin ve tek moleküllerin yapısal ve mekanik özelliklerin belirlenmesi için çok önemli bir araç haline gelmiştir. 1-3 sıvı hücreyi kullanarak, bu yöntemin fizyolojik olarak ilgili olan bir ortamda biyolojik makromoleküllerin çalışmaları ve hatta canlı hücrelerde özellikle faydalı olur. AFM geleneksel iletişim modu AFM, çünkü yumuşak bir malzeme veya yüzeyine gevşek bağlı molekülleri görüntülenmesinde kullanılmıştır 4-10 dokunulduğunda mod nedeniyle tipik olarak uygun değildir yanal kuvvetlerin neden zarar dirsek tarafından numune üzerinde uygulanan. 11 dokunulduğunda mod AFM ölçüde ucu aralıklı yüzeyine dokunmayın etmektense sürekli temas ederek bu güçleri azaltır. Bu modda, konsol veya yüzeye normal olarak rezonans frekansına yakın bir döndürülür. Benzer AFM modu başvurma, topografya analxy (uzaklık) bir fonksiyonu olarak z-piezo hareketini taslak haline getirilmesi suretiyle yzed. Konsol dinamikleri ya da rezonans yanında oldukça kararsız olabilir; Bu nedenle, bir &quot;kararlı durum&quot; durumun dışına otomatikleştirmek için çok zorlu. Özellikle, bu dinamikleri örnek özellikleri ve tarama çevre hem de bağlıdır. Sert bir (er) yüzeyine adsorbe edilmiş yumuşak bir molekül için, molekül için bir iyi ayarlanmış geri besleme döngüsü yüzeyi geri besleme dalgalanmasına yol açabilir. Fazla akışkan Operasyonu konsolun ayarlama zorlaştırmaktadır. Sıcaklık veya sıvı düzeylerindeki değişiklikler set noktası, kazançlar ve diğer görüntüleme parametrelerin sürekli ayarlaması gerekir. Bu ayarlamalar, çok zaman tüketici ve kullanıcılar için zor olma eğilimindedir. Tepe Kuvvetleri Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM), mod AFM dokunarak gibi, aralıklı örnek (Şekil 2) başvurarak yanal etkileşimleri önler. 12-15 &lt;/ Sup&gt; Ancak, PF-QNM olmayan rezonans modu ve dokunarak modu AFM çok daha düşük frekanslarda çalışır. Bu çekme modu AFM, sıvı varlığında şiddetlenir özellikle de ayarlama zorlukları ortadan kaldırır. PF-QNM ile, görsel temas her noktada bir kuvvet yanıt eğrisi alınarak toplanır. ScanAsyst yazılım ilavesi ile, tarama parametrelerinin 15 ayar otomatik olabilir ve yüksek çözünürlüklü görüntü bile deneyimsiz kullanıcılar tarafından birkaç dakika içinde elde. Kullanıcı AFM daha aşina olduktan sonra, otomatik parametrelerden herhangi veya tüm görüntü kalitesi elle ince ayar yapmak için deneye izin herhangi bir zamanda devre dışı bırakılmış olabilir. Kuruluşundan bu yana, PF-QNM. Altmoleküler düzeyinde bakteriorodopsin, bir membran proteini ve diğer yerli proteinleri Haritayı uygulanmıştır bakteriyorodopsin için 16-18 protein esneklik ve X-ray kristalografik yapıları arasında doğrudan bir ilişki vardır. 12 PF -QNM yüksek çözünürlüklü canlı hücreler araştırmak için kullanılmıştır. Hücre bütünlüğü ve fonksiyonu için kritik olan eritrosit membran içerisindeki yapı ve mekanik arasındaki 19,20 Dahası, PF-QNM veri açıklığa kavuşturmaktadır önemli bağlantılar. 21 Biz 22 bacteriophytochromes (BphPs) denilen kırmızı ışık fotoreseptör yapısını incelemek için AFM, 23 de dahil olmak üzere, tarama prob mikroskobu (SPM) yöntemlerini kullanmışlardır. 24,25 Onlar kovalent bir sinyal-efektör modülüne böyle bağlantılı bir ışık algılama modülü oluşur histidin kinaz (HK) gibi. 26 ışık algılama modülü genellikle yapısal değişikliklere sinyal-efektör modülü ulaşan ve tüm protein küresel bir dönüşüm yol açan bir dizi, bir fotonun emilimi üzerine yapısal dönüşüme uğrar bir bilin kromofor içeren . Bu dönüşüm dayanarak 24,27-29, iki farklı ışık emici ler vardırBphPs, kırmızı ve uzak-kırmızı ışık emici devletin öngörmesi, Pr ve PFR olarak belirtilir. Pr en BphPs için, termal olarak kararlı, karanlığa adapte edilmiş halidir. Pr / Pfr Fotoçevrim moleküler temeli bütünüyle bağlı olarak, bu proteinlerin sınırlı yapısal bilgisine anlaşılamamıştır 28. D. Bir yapının haricinde radiodurans bu proteinlerin 30 bütün yayınlamış X-ışını kristalografik yapısı, karanlığa adapte edilmiş halde ve efektör yoksundur. Daha sonra, dokunulmamış BphPs etkin Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) ile araştırılmıştır için çok büyük olan ve X-ışını kristalografisi için (özellikle ışık uyarlanmış halde) da bütün halinde kristalize etmek oldukça zordur. BphPs yakın kızılötesi floresan protein belirteçleri olarak tasarlanmış edilmiştir (IFP) &#39;ın., Bu proteinlerin 31 Yapısal karakterizasyon etkili IFP tasarım yardım daha fazla olabilir. 32-36 Bu makalenin odak için bir prosedür sunmaktırPF-QNM yoluyla sıvı hücre AFM kullanılarak BphPs görüntüleme. Bir yöntem olup, fotosentetik bakteri R&#39;nin bacteriophytochrome RpBphP3, (P3) ışık adapte devlet çalışmalarla ortaya konmuştur palustris. Burada sunulan AFM prosedür proteinlerin görüntüleme için uygun ve basit bir yaklaşım hem de diğer biyolojik makro moleküller olduğunu. Bu yöntemle, tek tek moleküllerin yapısal detayları bir üst düzey bilim ders laboratuvar oturumu benzer zaman, kısa bir süre içinde tahsil edilebilir. Kesitlerini ölçmek ve daha boyutlu analiz tamamlayarak, deneysel veri yararlı hesaplama modelleri ile mukayese edilebilir. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimode 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Tapping Mode Fluid Cell</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grade</td><td>SPI supplies</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Sample support disk</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>micropipettors</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Prepared according to cited references</td></tr><tr><td>Nanoscope software</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM Disc Gripper</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td><td>Schrodinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM), bir yüzeyin bir güç yanıtı araştırmak için bir konsol bağlı bir piramit şeklinde bir uca kullanır. Ucunun çökme görüntü topografisine dönüştürülebilen bir lazer ve bölümlere ayrılmış detektör tarafından ~ 10 pN ölçülebilir. Genlik modülasyonu veya &quot;dokunarak modu&quot; AFM bir görüntü üretmek için rezonans frekansında titreşen ise yüzeyi ile aralıklı temas probu içerir. Bir sıvı hücre ile birlikte kullanılan, dokunarak modu AFM gibi fizyolojik ilgili koşullarda proteinler gibi biyolojik makromoleküllerin görüntüleme sağlar. Dokunulduğunda mod AFM probu ve deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir tarama parametreleri çok sayıda sık ayarlamaları manuel ayar gerektirir. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için, bu ayarlamalar çok zaman tüketir. PeakForce Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM) bir kuvvet yanıtlayanların ölçerek bir görüntü oluştururnumune ile temas her noktada için tek başlarına eğrisi. ScanAsyst yazılım ile, PF-QNM otomatik olabilir. Bu yazılım otomatik olarak belirli bir örnek için ayar noktası, sürücü frekansı, tarama hızı, kazanç, ve diğer önemli tarama parametreleri ayarlar. Sadece bu süreç kırılgan sondaları ve örnekleri hem koruyor, önemli ölçüde yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için gerekli süreyi azaltır. PF-QNM sıvı AFM görüntüleme için uyumludur; Bu nedenle, biyolojik olarak ilgili malzemeleri görüntülenmesi için geniş bir uygulama alanına sahiptir. Bu çalışmada sunulan yöntem, fotosentez R. gelen bir bakteriyel kırmızı ışık fotoreseptör, RpBphP3 (P3) görüntüler elde PF-QNM uygulanmasını açıklar onun ışık adapte devlet palustris. Bu yöntem kullanılarak, bireysel protein P3 dimerleri ve dimerlerin agrega bir görüntüleme tampon varlığında bir mika yüzeye gözlenmiştir. Uygun yüzey ayarlamalar ve / veya çözelti konsantrasyonu Bu yöntemle,genel olarak diğer ilgili biyolojik makromoleküller ve yumuşak malzemeler için uygulanabilir.

Hafif uyarlanmış halde bir fotoreseptör protein, P3, temsili AFM görsel, Şekil 3 ve 4&#39;te sunulmaktadır. Bir taze kırılmış mika alt-tabaka (Şekil 3A) protein adsorpsiyonu için uygun, düz bir yüzeydir. Bir negatif kontrol olarak, temiz mika bir görüntü toplama çeşitli nedenlerle önemlidir. İlk olarak, sıvı hücre temiz temin edilmiş olup, önceki deneylerden elde edilen herhangi bir kalıntı malzemeler yüzey kirletecektir. İkinci olarak, bu ...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping at JoVE.com

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Engineering

11.7K Görüntüleme.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

Video: Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biyokimya

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Biyomühendislik

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Gelişim Biyolojisi

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...