Name: rna-seq analysis of differential gene expression in electroporated chick embryonic spinal cord
Uploaded: 2014-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.

1. electroporate HH12-13 Tavuk Embriyolar Sinir Tüpler ovo yılında İlgi Construct Bir transfeksiyon tatmin edici seviyelere sahip bireylerin hemen tespit edilmesini sağlamak için, tercihen bir bisistronik transkriptte, bir flüoresan raportör kullanarak ya da araya giren virüs 2a peptit 11 ile ilgi proteinine. NOT: Bu aşamada tipik inkübasyon süresi 37.8 ° C&#39;de yaklaşık 48 saat olduğunu. <ol><li> Bir 18 G x 1 1/2 iğne bağlanmış bir şırınga ile albümini 3 ml çıkardıktan sonra yumurta küçük bir pencere açar. Embriyo görünümünü geliştirmek için, embriyo 1-4 altında steril Ringer çözeltisi içinde 1:50 seyreltilmiş ve Hint mürekkebi az miktarda enjekte edilir. </li><li> Steril Ringer solüsyonu ile embriyo kat ettikten sonra, 2.5 ug nöral tüpün arka ucundan bir DNA doldurur kadar / ul ihtiva eden, 10 mM Tris-HCI, pH 8.2 ve% 0.1 bir gıda boyası (K, D &amp; C) çözelti enjekteBeyin bölgeye kadar. , Dış yan yüz bölgesi boyunca, 4 mm, 1 ile ayrılmış pozisyonlar platin elektrotları (çapı 0,5 mm) elektroporasyona ve bunların 4 ila 100 msn bir aralık ile 5 ila 50 ms arasında bakliyat ve 20 V sunmak. </li><li> Elektroporasyondan sonra, bu aşamada HH23 ulaşana kadar daha fazla 48 saat için manipüle embriyolar inkübe ve flöresanlı bir stereomikroskop altında dış yan yüz bölgesinde transfeksiyon yüksek düzeyde sunulması bireylerin belirlenmesi. Not: Elektroporasyondan sonra inkübasyon süresi Deneyin amacı bağlıdır. Electroporated plazmidler 2 saat sonra 2 anlamlı ifadesi düzeyleri oluşturabilirsiniz. İlgi erken başlangıçlı gen içinde ise Böylece sonrası elektroporasyon Kuluçka süresi azaltılabilir. </li></ol> 2. Hasat Başarıyla Embriyolar Geçiştirilmiş ve Electroporated Omurilik yarıları teşrih NOT: Bu işlem her 10 embriyo ve verimleri 1 2-3 saat sürer-2 Embriyo başına mikrogram toplam RNA. Nöral tüp diseksiyonu ince hareketlerini gerektirir ve bazı antremanları deneysel örnekleri uygulamadan önce gerekli olabilir. <ol><li> RNaz dekontaminasyon solüsyonu ya da 4 saat 12 boyunca 150 ° C&#39;de fırınlanması ile metalik diseksiyon araçları dekontamine ve DEPC ile muamele edilmiş PBS hazırlar. Sadece yeni sertifikalı RNazsız plasticware kullanın. NOT: Hasattan sonra, o diseksiyonu sırasında Rnase bulaşmasını önlemek için standart bakım takip etmek önemlidir. </li><li> Ince kesici bir makas ve bir elenmiş toplama kaşık kullanarak embriyoların hasat. 100 mm Petri kabındaki soğuk DEPC ile muamele edilmiş PBS içinde embriyolar tutun. </li><li> Ince bir cımbız ile, (ön bacak tomurcuk ve arka bacak tomurcuk ön sınırı posterior sınırı arasında) bütün yan bölgeyi kesip ve soğuk DEPC tedavi PBS içeren yeni bir çanak için bu bölümü aktarmak. </li><li> Üç farklı at delmek için iki ince cam iğneler kullanınnöral tüp ve paraksiyel mezoderm arasında embriyonun her dorsolateral tarafında işaret ediyor. </li><li> Merkez perforasyon iki cam iğneler tanıtmak ve yavaş yavaş nöral tüp ön-arka eksen boyunca onlardan birini uzağa taşıyın. İlk hareketlerin ulaştığı değil deliklerden için bu işlemi tekrarlayın. Ince bir cımbız ile müstakil paraksiyel mezoderm çıkarın. </li><li> Yanlara embriyo çevirin nöral tüp ve Notokordun arasında cımbız ipuçları yerleştirin ve iki yapıyı ayırmak için ön-arka eksen boyunca ters yönlerde kaydırın. Not: Bu aynı zamanda mezodermin çoğu hala nöral tüp takılı kaldırmanız gerekir. </li><li> Gerekirse, hafifçe cımbız başka bir çift nöral tüp tutarken bir çift cımbız ile çekerek bağlı kalır mesodermic dokusunun herhangi bir büyük parçaları çıkarın. Bittiğinde, yavaşça kullanılarak soğuk DEPC tedavi PBS içeren başka bir kaba nöral tüp transferiRNazsız cam Pasteur pipet manuel pipet pompasına bağlanmış ve tüm tüpler disseke kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> Ikiye sinir tüpleri bölün. Bunun için, lümeninde cımbız kapalı bir çift keskin ucu takın ve içinden cımbız dışarı taşıyarak çatı plakasını açın. Bundan sonra, cımbız uçları ile taban plakasını keserek yarısını ayırmak. </li><li> Sıralama buz soğukluğunda DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile doldurulmuş bir 1.5 ml&#39;lik tübe floresan bir diseksiyon kapsam ve transfer altında olmayan elektroporasyona yarıları elektroporasyona. Gerekirse, plastik duvarlarına bağlı herhangi bir dokuyu çıkarmak için ve bu tüplerin tortulaşmayı teşvik etmek için hafifçe mikrotüpler hafifçe vurun. </li><li> 3 sn 100 xg&#39;de Spin ve 1 ml mikropipet ile mümkün olduğu kadar PBS gibi çok yavaşça kaldırın. Herhangi bir embriyonik malzeme pipet emilir eğer izlemek için mikrotüpünden parlar bir ışık kaynağına bakarak bu süre yapmak; Bu olursa, yavaş yavaş deşarj ve centrifuga tekrarlayınyon. </li><li> Nöral tüp devre başına RNA ekstraksiyonu için lizis çözeltisinin 70 ul ekleyin ve içerikleri karıştırmak üzere tüp hafifçe vurun. Kuvvetli bir şekilde 5 dakika ve vorteks oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika inkübasyondan sonra, vorteks iki kez daha tekrarlayın. -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bir sonraki aşama için yeterli bir verimi sağlamak için, numune başına en az sekiz nöral tüp yarıyı toplayın. Birkaç elektroporasyon / diseksiyon oturumları nöral tüp yeterli sayıda biriktirmek için gerekiyorsa daha küçük örnekler havuzu. Her durum için çiftleri veya üçlülerdeki için yeterli örnekleri saklamak. </li></ol> 3. Arındırıcı RNA ve Illumina dizinleri için Kütüphaneler hazırlayın <ol><li> -80 ° C&#39;de depolama ile ilgili örnekleri çıkarın ve 15-30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Tamamlanıncaya kadar oda sıcaklığında çözülme devam edin. </li><li> Girdap de ve 5 dakika için oda sıcaklığında bırakın. 1 dakika 15.000 xg&#39;de tekrar karıştırın ve santrifüj çözünmeyen malzeme peletlendi. </li><li> Yeni bir tüpe süpernatant aktarınve toplam RNA izolasyon kiti kullanım talimatlarına uygun olarak RNA ekstraksiyonu geçin. Konsantrasyonunu arttırmak için önerilen minimum hacimde Zehir. NOT: Temiz-up sonra DNaz tedavi RNA-Dizi veri kümelerinde genomik DNA dizilerinin potansiyel kontaminasyonu önlemek için tavsiye edilir. </li><li> Içerikleri karıştırmak ve kalite kontrol analizi için 5 ul nin uzaklaştırılması için boru hafifçe vurun. Kütüphane hazırlanana kadar -80 ° C de, geri kalan örnek Mağaza; Bu örneklerin RNA bozulmasını önlemek için sadece bir kez çözdürülmelidir. </li><li> RNA 6000 Nano kiti kullanarak Bioanalyzer enstrüman saflaştırılmış RNA çalıştırın; RIN değeri en az 7, yukarıda devam etmek gerekir. </li><li> Bir Illumina uyumlu bir RNA-Dizi kütüphane hazırlama kitini kullanarak kütüphaneleri oluşturmak ve tek okur 100 bp oluşturmak için ayarlanmış bir HiSeq aletinin bir şeritte 4 kütüphanelere kadar multipleks. Mümkünse, potansiyel teknik eserler en aza indirmek için aynı vadede tüm örnekleri yer alıyor. NOT: Bu 50 milyon r kadar verim gerekirçoğu genler 13 kapsama almak için fazlasıyla yeterli olduğunu numune başına EADS. </li></ol> 4. Galaxy Kamu Server 10 RNA-Dizi Veri Kümeleri karşılaştırın. NOT: Server depolama alanı sınırlı olduğu ve birçok örnekleri karşılaştırarak deneyler filtreleme adımda oluşturulan ara dosyaların silinmesini isteyebilir. <ol><li> (Galaxy kamu sunucusunda bir kullanıcı hesabı oluşturun <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) ve FTP fastq formatında Illumina veri setlerini yükleyin. </li><li> NGS altında FastqGroomer 14 aracı ile yüklenen dosyaları hazırlayın: QC ve manipülasyon menü; kalite puanları zaten Phred + 33 (Sanger) olarak kodlanmış ise, basitçe her veri kümesi için Öznitelikler altında fastqsanger için dosya türünü değiştirerek bu adımı atlayın. </li><li> QC ve manipülasyon beni: genel NGS altında FastQC aracını kullanarak her veri kümesi kalitesini analiznu. Not: Bu okur uçlarını düzeltmek için kullanılan parametreler için tahminler sağlayacak gibi özel dikkat, baz dizisi kalite başına ve her baz dizilimi içerik için çıkan grafik verilmelidir. </li><li> Trim &#39;3 atmak için okur aracını NGS altında fastq Kalite Giyotin 14 kullanılarak düşük kaliteli veri ile biter: QC ve manipülasyon menü. Sadece 3 &#39;20 altında kalite puanı biter işlemek için aracı ayarlayın. </li><li> Klip aracını kullanarak (okuduğunda adaptör dizilerinin kaldırmak <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> QC ve manipülasyon menüsü: NGS altında). Az kalan 45 bp, giriş kullanılan adaptörün dizisi ile okur atmak ve hem de kısaltıldı olmayan kırkılmış dizileri ihtiva çıkışını seçmek için aracı ayarlayın. Ayrıca, en düşük kaliteli bazlar zaten son adımda çıkarıldı beri bilinmeyen üsleri ile dizileri atmak değil tercih. </li&gt; <li> Aracı Trim dizileri (kullanarak <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> NGS altında): FastQC tarafından algılanan 5 &#39;dizisi önyargı (genellikle 10) kaldırmak için okur QC ve manipülasyon menüsü, ilk üsleri kırpın. NOT: Bu noktada, tekrar FastQC çalıştırın ve veri kümesi kalitesinin düzeldiği olmadığını belirlemek için önceki analizi ile karşılaştırmak için iyi bir fikirdir. </li><li> Download ve Illumina iGenomes gelen UCSC genom tarayıcı için son tavuk genom aksamını paketinden ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) ve tüm genom Fasta biçimi dosyası ve genler açıklama GTF biçimi dosya upload Veri Al menüsü altında araç Dosya Yükle kullanarak Galaxy tarihine. </li><li> Harita altında hizalama TopHat2 15 kullanılarak tavuk genomunun her bir numune için okumaNGS: RNA Analizi menüsü. Tarih bir genomu kullanmayı tercih (adım 4.7 yüklenen Fasta dosyasını seçin). </li><li> RNA Analiz menüsünde: NGS altında Kol Düğmeleri 16 kullanılarak her bir örnek için bir tahmin transcriptome oluşturun. Bir rehber olarak referans notu kullanın (adım 4.7 yüklenen GTF dosyayı seçin) ve seçenekleri açmak (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyadan) Eğilim Düzeltme gerçekleştirin ve çok okumak doğru kullanın seçin. </li><li> RNA Analiz menüsünde: NGS altında Cuffmerge 16 kullanan tüm örnekler için tahmin transcriptomes Birleştirme. (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyasından) ve sekans verileri (adım 4,7 GTF dosyası) referans notu kullanın seçin. </li><li> RNA Analiz menüsünde: NGS altında Cuffdiff 16 kullanılarak her bir örnek için TopHat2 tarafından oluşturulan BAM dosyalarını karşılaştırın. Alan Kopyalarıyla de beni seçinrged transcriptome Cuffmerge tarafından oluşturulan ve seçenekleri (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyadan) Eğilim Düzeltme gerçekleştirin açmak ve çoklu-okuma doğru kullanın. </li><li> Sıralama diferansiyel ifade Filtresi altında araç Sıralama kullanarak sayısal sütun 13 (q değeri) olarak artan tabloları test ve menü sıralayın. Not: Genler / düşük q değerlerinin sunacak deneysel koşullar arasında anlamlı bir diferansiyel ekspresyonu gösteren transkript. </li><li> Kapsama grafikler ile görsel olarak sonuçları kontrol etmek için, öncelikle aracı BEDTools menüsü altında genom kapsama 17 bir BedGraph kullanarak oluşturun bedGraph formatında BAM dosyalarını dönüştürebilirsiniz. Kapsama olmadan bölgelerin bildirimini devre dışı, farklı aralıklarla olarak eklenmiş girişleri tedavi ve tüm gerçekleştirmede karşılaştırılan için sıralama derinliği normalleştirir bir faktör tarafından kapsama ölçek seçin. </li><li> Kullanarak kodaman formatında çıkan bedGraph dosya dönüştürmearacı Peruk / BedGraph-to-kodaman ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) Dönüştür Biçimleri menüsü altında. UCSC genom tarayıcı (özel parça olarak kodaman dosya upload <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> galGal4 montaj için) ve veri kümelerinde kapsama görselleştirmek için ilgilenilen geni arayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).</li><li>Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+approaches+in+the+chick+embryo.">Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo.</a> Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).</li><li>Ghadge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+wild-type+SOD1+and+FALS-linked+mutant+SOD1+cause+neural+cell+death+in+the+chick+embryo+spinal+cord.">Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord.</a> Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).</li><li>Megason, S. G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitogen+gradient+of+dorsal+midline+Wnts+organizes+growth+in+the+CNS.">A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS.</a> Development. 129 (9), 2087-2098 .</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Cloonan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+transcriptome+profiling+via+massive-scale+mRNA+sequencing.">Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing.</a> Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy+Team.+Galaxy:+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible,+reproducible,+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences.">Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).</li><li>Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viral+2A+peptide+for+bicistronic+expression+in+transgenic+mice.">Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice.</a> BMC Biol. 6, 40 (2008).</li><li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning. A laboratory manual. , (1982).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+coverage+and+depth+of+transcriptome+by+RNA-Seq+in+chickens.">Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens.</a> BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Vieceli, F. M., Sim&#245;es-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+chicken+Scratch2+is+expressed+in+a+subset+of+early+postmitotic+neural+progenitors.">The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors.</a> Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo.">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).</li><li>Sim&#245;es-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+novel+players+in+the+cranial+neural+crest+gene+regulatory+network.">Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network.</a> Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada tavuk omuriliğin elektroporasyon sonra etkilerini analiz etmek için yönergeler sağlamak. DNA vektörlerine elektroporasyonu daha sık ilgi konusu bir geni fazla-sentezlemek üzere kullanılmasına rağmen, tek bir gen fonksiyonu yok etme koşulları 19-21 oluşturmak üzere siRNA&#39;lar dominant negatif, quimeric proteinler veya öncülerini kodlayan yapıları kullanabilir. Aslında, gain- ve kayıp fonksiyon-analiz hem kaynaklanan transcriptome profilleri karşılaştırılması farklı şekilde...

Ovo elektroporasyon DNA 1-5 yapıları ile kısmen in vivo embriyonik yapıların transfect için hızlı ve ucuz bir şekilde temsil ettiği için canlı organizmalar üzerinde genetik araştırmalar sık sık bir model olarak tavuk embriyo kullanın. Örneğin pCIG 6 veya 7 PMES gibi, ilgi konusu gen ile birlikte, bir flüoresan raportör ihtiva eden ve bir transkript şifreleyen bisistronik ekspresyon vektörleri, alt analizi için embriyolar işlemeden önce bir stereo mikroskop altında arzu edilen bir bölgede transfeksiyon kalitesinin hızlı doğrulama sağlar. DNA dizilimi son gelişmeler ile, RNA-seg 8,9 kullanılarak RNA örneklerinden dijital tüm transcriptome ifade profillerini elde etmek artık mümkün. Bu yüzden, bunun yerine örneğin, in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve qPCR, cDNA kütüphanelerinin hazırlanması için olduğu gibi paralel olarak sadece birkaç gen ürünlerinin, analizine imkan veren zaman alıcı bir yöntemYüksek verimli sekanslama, tüm transcriptome bilgi sağlayabilir. Her bir genin ekspresyon seviyeleri üzerindeki deneysel etkilerinin gözlenmesi da kullanılan yapı tarafından değiştirilmiş yolları üzerinde güçlü bir anlayış temin edebilmektedir. Bu, kullanılan organizma için bir genomik montaj varsa özellikle kolaydır, böylece civciv embriyo yine uygun bir modeldir. Kullanıcı güvenilir bir genom dizileme merkezine erişimi varsa, ana konu yüksek kaliteli RNA örnekleri elde edilir. Bu çalışma, elde edilen veri setleri in silico analiz için RNA sekansına uygun transfekte sinir tüpleri, hem de alt adımları RNA örnekleri elde etmek için bir yöntemi gösterir. 48 saatlik bir inkübasyon takip HH12-13 de Elektroporasyon işleminden sonra, transfekte edilen gövde omurilik yarısı, ribonükleaz içermeyen koşullarda kesilmiş, hemen yok edilmekte ve daha fazla RNA saflaştırma işlemi ve kütüphane preparatın kadar ultra-düşük donma bozulmaya karşı korunaniyonu temsil etmektedir. Galaxy public server 10 yüksek verim sıralama verilerini analiz etmek için ücretsiz kaynaklara erişim sağlar. Kayıtlı kullanıcılar için sunulan alan miktarı böylece lokal hesaplama altyapısı için ihtiyacı ortadan kaldırarak, küçük deneyler için yeterli. RNA Dizi veri analizi filtreleme, uyum ve gen ekspresyonunun nicelendirilmesi / karşılaştırmayı içermektedir. RNA-Seq veri analizi için genel kurallar olmasına rağmen, filtreleme parametreleri dizileme kalitesine bağlı olacaktır ve ham verilerin kalite kontrol analizinden sonra tespit edilmelidir. Bu protokol almak ve in vivo transfekte tavuk embriyonik omurilik RNA-Dizi profillerini karşılaştırmak için adımları açıklar. Temsili bir sonucu olarak, bir boş vektör ile transfekte edilmiş iki farklı kontrol numunelerinden elde edilen veri setlerinin karşılaştırılması yöntem, yeniden üretilebilir ve farklı olarak Expres tanımlanmasına olanak gerektiğini gösterdiDeney örneklerindeki SED transkript. Bu nedenle, bu yöntemin uygulanması büyük ölçüde tek bir deneyde sonra keşiflerin sayısını artırmak ve böylece müteakip soruşturma için büyük bir veri kümesi sağlamak potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Indian ink</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>3 ml syringe</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D &amp;amp; C Blue 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Food Dye used to visualize DNA injection</td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 7.2 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.225 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.217 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.02 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 800 ml and adjust pH to 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Filter and autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 8 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 1.15 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 800 ml and adjust pH to 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L and filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieved spoon</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase decontamination solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Fine point surgical scissors</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight fine point tweezers</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9&#039;&#039; glass Pasteur pipette</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manual pipette pump</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAlater solution for RNA stabilization</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous total RNA isolation kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Ethanol</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Truseq RNA Sample Preparation Kit v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of differential gene expression in electroporated chick embryonic spinal cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Anlatılan yöntem doğrulamak için, iki kontrol numuneleri, boş vektör PMES 7 ve uç tavuk SCRT2 18 çinko-parmak sahalarını kodlayan SCRT2-ZNF, yapıyı içeren aynı vektör ile transfekte edilmiş embriyolar, bir örnek ile elektropore edildi embriyolardan elde edilmiştir. Her 11-22 ug toplam RNA elde edildi Örnekler 8-12 embriyo havuzlarından elde edilmiştir. Her üç numune, yüksek kaliteli, RNA bu protokol ile elde edilebileceğini gösteriyor, Bioanalyzer cihazı (Şekil 1...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K Görüntüleme.  Universidade de São Paulo. This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Video: RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Genetik

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Gelişim Biyolojisi

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are located in the dorsal spinal cord and send their axons along stereotyped trajectories. Commissural axons initially project ventrally towards and then across the floorplate. After crossing the midline, these axons make a sharp rostral turn and project longitudinally towards the brain. Each of these steps is regulated by the coordinated activities of attractive and repulsive guidance cues. The correct interpretation of these cues is crucial to the guidance of axons along their demarcated pathway. Thus, the physiological contribution of a particular molecule to commissural axon guidance is ideally investigated in the context of the living embryo. Accordingly, gene knockdown in vivo must be precisely controlled in order to carefully distinguish axon guidance activities of genes that may play multiple roles during development.
Here, we describe a method to knockdown gene expression in the chicken neural tube in a cell type-specific, traceable manner. We use novel plasmid vectors3 harboring cell type-specific promoters/enhancers that drive the expression of a fluorescent protein marker, followed directly by a miR30-RNAi transcript4 (located within the 3'-UTR of the cDNA encoding the fluorescent protein) (Figure 1). When electroporated into the developing neural tube, these vectors elicit efficient downregulation of gene expression and express bright fluorescent marker proteins to enable direct tracing of the cells experiencing knockdown3. Mixing different RNAi vectors prior to electroporation allows the simultaneous knockdown of two or more genes in independent regions of the spinal cord. This permits complex cellular and molecular interactions to be examined during development, in a manner that is fast, simple, precise and inexpensive. In combination with DiI tracing of commissural axon trajectories in open-book preparations5, this method is a useful tool for in vivo studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance. In principle, any promoter/enhancer could be used, potentially making the technique more widely applicable for in vivo studies of gene function during development6.
This video first demonstrates how to handle and window eggs, the injection of DNA plasmids into the neural tube and the electroporation procedure. To investigate commissural axon guidance, the spinal cord is removed from the embryo as an open-book preparation, fixed, and injected with DiI to enable axon pathways to be traced. The spinal cord is mounted between coverslips and visualized using confocal microscopy.

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

A method by which gene expression in the neural tube can be downregulated in a cell type-specific, traceable manner is described. We demonstrate how in ovo electroporation of microRNA-based plasmids that elicit spatiotemporally controlled RNA interference can be used to investigate commissural axon guidance in the developing neural tube.

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Nörobilim

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

Biyoloji

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Gelişmekte Olan (Kurbağa) Embriyoda Hücre-Soy Kılavuzlu Kütle Spektrometrisi Proteomikleri

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Kimya

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...