Name: in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

Bu proje Baden-Württemberg, Almanya&#39;nın Avrupa Sosyal Fonları tarafından finanse edildi.

Gerekli olan DNA dizinlerini Kodlama içeren plazmidlerin 1. Büyütme (CDS) <ol><li> Ön oda sıcaklığına getirilmiş ve dönüşüm kiti dahildir SOC ortamında, 37 ° C&#39;de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB agar plakaları. 42 ° C su banyosu dengeye getirin. </li><li> Kimyasal bileşen E bir şişe çözülme buz üzerinde coli. </li><li> Kimyasal bileşen E. şişe içine CDS içeren plazmidin 1-5 ul (100 ng, 10 pg) ekleyin coli ve hafifçe karıştırın. Pipetleme hücreleri karışmaz. Plasmidlerini ekledikten sonra, yavaşça tüp dokunarak karıştırın. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı. </li><li> Isı şok E. çalkalamadan bir su banyosu içinde 42 ° C sıcaklıkta 30 sn için E. coli. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde şişe yerleştirin. </li><li> E. önceden ısıtılmış SOC ortamında 250 ul ekleyin E. coli bakteriyel bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 1 saat süre ile, 300 rpm&#39;de yatay bakteri sallayın. </li><li><html> 100 ul ve önceden ısıtılmış LB agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı 150 ul yay plakalar ters çevirin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Koloniler görünür hale sonra, 100 ug / ml ampisilin ile 5 ml LB ortamı içeren 15 ml&#39;lik bir kültür tüpü içine, her plakadan tek bir koloni inoküle. Kültür late Günlük veya durağan faz içinde yer alana kadar 300 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe. </li><li> Dönüşmüş E. coli, uzun süreli depolama için E. coli, pipeti dondurarak saklamaya uygun viallerin içine% 100 gliserol, 75 ul. Bakteri kültürüne (dondurulmuş bir stoku,% 25 gliserol içeren) 225 ul eklenir, iyice karıştırılır ve -80 ° C &#39;de cryovial saklayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti ile birlikte istenen CDS içeren plazmidler izole edin. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, plazmid konsantrasyonunun belirlenmesi. </li><li> 20 ul alikotları hazırlanması ve uzun bir süre boyunca -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol>Plazmid Ek&#39;lerin BORSASI &quot;&gt; 2. Amplifikasyon ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu Poli T-kuyruk ekleme (PCR) <ol><li> Not: PCR kullanılarak amplifiye edilir, in vitro transkripsiyon (IVT), burada söz konusu CDS EGFP için DNA şablonu elde etmek için. Aynı zamanda, 120 timidinler (T) &#39;in bir poli T-kuyruk T 120 uzantılı bir ters primer kullanılarak inserte eklenmiştir. Böylece, oluşturulan mRNA&#39;lar IVT sonra tanımlanmış bir uzunluğa sahip olan bir poli A kuyruğu elde edilir. </li><li> Tablo 1 &#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR ile bir karışım hazırlayın. </li><li> Iyice reaksiyon karışımı karıştırın. Not: PCR ürünü, 4-5 IVT reaksiyonlarında kullanılabilir. IVT için DNA şablonu miktarını artırmak için, PCR karışımı, toplam hacmi arttırılabilir. Birkaç PCR tüpleri, her biri 100 ul PCR karışımı, PCR ürünü yeterli bir verim elde etmek için kullanılabilir. </li><li> Bir PCR PCR tüpleri yerleştirin ve PCR çevrim protokolü (Tablo 2) kullanılarak PCR çalıştırın. </li><li> P temizleyin20 ul nükleaz içermeyen su kullanılarak DNA üreticinin talimatlarına ve elüte göre olan bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak CR reaksiyonu. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, DNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. Not: Saptanan DNA konsantrasyonu yaklaşık olarak 300 ug / ml&#39;dir. Böylece, beklenen toplam miktarının ~ 6 mg olmalıdır. Diğer proteinler için DNA miktarı CDS uzunluğuna bağlı olarak farklı olabilir, plazmid miktarı PCR, primer tavlama sıcaklığı ve devir sayısı için de kullanılır. </li><li> Uzun bir süre için, -20 ° C&#39;de DNA Freeze veya IVT doğrudan kullanın. </li></ol> 3. Kontrol Adım: PCR Ürünü Kalitesi <ol><li> DNA jel elektroforezi ile PCR ürününün kalitesini kontrol edin. </li><li> Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin. </li><li> Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin. </li><li> , Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat bekleyin. </li><li> Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin. </li><li> 12 ul bir toplam hacimde 2 ul, 6x yükleme tamponu ile 80-10,000 bp&#39;lik bir DNA merdiven 2 ul (200 ng) ve PCR ürünü, 200 ng her karıştırın. </li><li> Dikkatlice agaroz jel kuyu içine DNA örnekleri yükleyin. </li><li> Tampon olarak 1 x TBE kullanarak 1 saat boyunca 100 V&#39;ta agaroz jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> Bir görüntüleme sistemi (Şekil 2) DNA bantları görselleştirmek. </li></ol> 4. in vitro transkripsiyon (IVT) <ol><li> Not: PCR&#39;den sonra plasmit amplifiye edilir ve bir poli T kuyruğu eklenmiştir. IVT sırasında genetik bilgi haliyle RNA&#39;nın DNA&#39;dan transkribe edilmektedir. Oluşturulan mRNA transkript hücrelerde proteinlerin üretilmesi için kullanılır. </li><li> Bir Rnase d çalışma alanı ve pipetler temizleyinecontamination çözeltisi. Reaksiyon RNases karışır sık ​​sık kullanımı, PCR, temiz ve steril çift filtre pipet uçları ve kirlenmeyi en aza indirmek için eldiven değiştirmek. </li><li> Tablo 3&#39;te tarif edildiği gibi NTP / kap benzeri bir karışım hazırlayın. </li><li> Vorteks ile iyice NTP / kap analog karışımı karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün. </li><li> Tablo 4&#39;te tarif edildiği gibi IVT, reaksiyon karışımı bir araya getirin. </li><li> Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyice IVT reaksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra tüpün altındaki karışımın toplanması için kısa bir süre için PCR tüpü santrifüj. </li><li> Termomikser içinde 3 saat 37 ° C&#39;de inkübe edilir. NOT: En uygun kuluçka zamanı ekler ve belirli bir şablon transkripsiyonel etkinliğinin uzunluğuna bağlıdır. Kısa uçlar (nt &lt;500), bir uzun bir enkübasyon süresi avantajlı olabilir. Bir zaman ders deney maksimum verim için optimum inkübasyon süresini belirlemek için yapılabilir. Bu nedenle, exampl için, IVT reaksiyonları kurmake 1, 2, 3, 4, 6 saat, ve gece boyunca kuluçka için ve mRNA miktarının belirlenmesi. EGFP mRNA üretimi için in vitro transkripsiyon kinetiği Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> , Şablon DNA kaldırmak IVT Reaksiyon karışımına DNase 1 ul (2 U / ml) ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 40 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA&#39;nın tasfiye edilir. Not: bulgulanan RNA konsantrasyonu, yaklaşık 1.500 ug / ml arasındadır. Böylece, beklenen toplam miktarı, ~ 120 ug olması gerekir. Diğer proteinler için sentez mRNA miktarı CDS uzunluğu ve IVT için kullanılan PCR ürününün miktarına bağlı olarak değişebilir. </li></ol> Antarktika fosfataz ile saflaştırılmış mRNA 5. Tedavi <ol><li> Not: üretilen mRNA 5 çıkarmak için fosfataz ile işlemden geçirildi &#39;tri-Bağışıklık aktifleşmesi Rig-I tarafından tanınan ve kurşun olabilir fosfatlar. Ayrıca, fosfotaz muamelesine kendinden ligasyon reaksiyonunda yeniden daire haline engeller. </li><li> Saflaştırılmış mRNA solüsyonuna 79 ul 10x Antarktika fosfataz reaksiyon tampon maddesi 9 ul ekleyin. Daha sonra, Antarktika fosfataz (5 U / ul), 2 ul ekleyin ve yavaşça örnek karıştırın. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de, reaksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 50 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA&#39;nın tasfiye edilir. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, modifiye mRNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. Giriş 260 nm / 280 nm&#39;de absorbans, (A 260 / A 280), ≥ 1.8 ve 260 oranı / 230 saflığa işaret eden, 2.0 olduğundan emin olun. NOT: beklenen toplam verim, hangi sufficie olduğunu, yaklaşık 90 ug olmalınt yaklaşık 36 mRNA Transfeksiyonlar için. </li><li> Nükleaz içermeyen su ilave edilerek, 100 ng / ul mRNA konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> -80 ° C&#39;de Transfeksiyonlar ve mağaza için gerekli olan tek kullanımlık kısma modifiye mRNA&#39;nın kısım. Birden fazla donma ve çözülme döngüleri kaçının. Düzgün hazırlanmış ve mRNA yıllardır istikrarlı saklanır. Çalışma sırasında, her zaman buz üzerinde modifiye mRNA tutun. </li></ol> 6. Kontrol Aşama: Sentezlenen Modifiye mRNA&#39;nın Kalitesi <ol><li> RNA, jel elektroforezi ile modifiye mRNA&#39;nın kalitesini kontrol edin. </li><li> Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin. </li><li> Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin. </li><li> Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel soli oluncaya kadar yaklaşık 1 saat beklemekasitleştirildi. </li><li> Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin. </li><li> 0.5-10 kb RNA merdiveni 3 ul (3 ug) ve mRNA, 10 uL bir toplam hacimde 7 ul yükleme tamponu ile değiştirilen her sentezlenir 200 ng karıştırın. Yükleme tamponu kompozisyonu, Tablo 5&#39;te tarif edilmektedir. </li><li> 10 dakika süreyle 70 ° C de merdiven ve mRNA örnekleri, denatüre. </li><li> Dikkatle merdiveni ve% 1 agaroz jel üzerinde mRNA örnekleri yükleyin. </li><li> Tampon olarak 1x TBE kullanılarak 1 saat boyunca 100 V elektroforezi gerçekleştirin. </li><li> Bir jel dokümantasyon sistemi (Şekil 4) kullanılarak UV transilluminator ve fotoğraf üzerinde merdiven ve mRNA bantları görselleştirmek. </li></ol> 7. Transfeksiyonu için Hücrelerin Hazırlanması <ol><li> 12 gözlü plakanın her bir kuyucuğu Levha 2 x 10 5 hücreleri (HEK293 hücreleri) içerir. </li><li> Bir hücre kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri. Not: transfeksiyon gününde, hücreler REAC olmalıdır% 80-90 hed. </li></ol> 8. Hücre mRNA Transfeksiyon gerçekleştirme <ol><li> Modifiye edilmiş mRNA çözülme. </li><li> Transfeksiyon için lipoplexes oluşturur. </li><li> Modifiye edilmiş mRNA, 25 ul (2.5 ug) ve 12-çukurlu bir levhanın bir kuyu transfeksiyonu için transfeksiyon karışımı oluşturmak üzere, serum ortamı, indirgenmiş 473 ul Opti-MEM (Minimal Essential Medium) katyonik lipit transfeksiyon reaktifı 2 ul ekleyin. Transfekte edilecek kuyu sayısı uygun hacimleri Scale. Negatif bir kontrol olarak, mRNA olmadan bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. </li><li> Pipetleme tarafından yavaşça karıştırınız. Transfeksiyon için lipoplexes oluşturmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında transfeksiyon karışımı inkübe edin. NOT: transfeksiyon karışımı hiçbir antibiyotikler içerir. Böylece, hücrelerin kullanımı sırasında kısırlık sağlamak için özen gösterin. </li><li> 500 ul DPBS hücreleri yıkayın / kuyu. </li><li> 12-iyi bir pla iyi biri transfeksiyon karışımı ul 500 eklete. </li><li> 37 ° C de 4 saat ve% 5 CO2 için hücreleri inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon karışımı aspire ve hücrelerin 1 ml tam hücre kültür ortamına ilave edin. </li><li> Hücre kuluçka makinesi içinde 24 saat boyunca kuluçkaya bırakılır. </li><li> Floresan mikroskobik yapın bir floresan mikroskobu (Şekil 5) kullanılarak analiz eder. Not: eGFP dışında mRNA, mRNA kodlayıcı ile transfeksiyon ile üretilen hücrelerde başka proteinlerin ekspresyonunu incelemek için hücreler, lamelleri yetiştirilebilir. Daha sonra transfeksiyon gerçekleştirilebilir ve hücreler, uygun antikorlar ile boyanmış ve fluoresan mikroskobu ile analiz edilebilir. </li></ol> Hücrelerde eGFP İfade 9. Akış Sitometrik Analizleri <ol><li> Kaynaklardan gelen hücre kültürü ortamı çıkarın ve (kalsiyum ve magnezyum içermeyen), 1 ml DPBS ile her bir yıkama. Hücre kültür plakalarının yüzeyinden hücreleri ayırmak için oyuk başına 500 ul tripsin / EDTA ilave edin. Daha sonra, 500 eklemekul TNS başına iyi tripsin inaktive. </li><li> Oda sıcaklığında, 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca müstakil hücreleri santrifüjleyin. Sadece pelet bırakarak süpernatantı. 150 ul hücre sabitleme çözeltisi hücre pelletini ve tüp sitometri akışı içine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> EGFP ifade eden hücrelerin yüzdesini ve Coğrafi İfade (floresan yoğunluğunun geometrik ortalama) (Şekil 6) kullanılarak floresans yoğunluğu analiz edin. </li></ol> Over Time Protein İfade 10. Ölçümü <ol><li> Ayrıca 8. adımda tarif edildiği gibi, bir 12-yuvalı plakanın 3 gözleri içindeki hücreler mRNA transfeksiyonu yapın mRNA ilavesi olmadan transfeksiyon karışımı ile HEK293 hücrelerinde 3 kuyu inkübe edin. </li><li> EGFP 1, 2 ekspresyonunu ölçmek ve Transfeksiyondan 3 gün sonra, proteinin (Şekil 7) süresini değerlendirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+&amp;#34;gene+therapy&amp;#34;.">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &amp;#34;gene therapy&amp;#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li><li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+an+Optimized+Wilms&amp;#34;+Tumor+1+(WT1)+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo.">Design of an Optimized Wilms&amp;#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).</li><li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized,+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection.">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors.">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li><li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation.">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery &amp; development. 10, 523-532 (2007).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency.">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li><li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression.">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

MRNA, tedavi rejeneratif tıpta, hastalıkların ve aşı tedavisi alanında büyük bir potansiyele sahiptir. Bu video, hücrelerdeki protein ifadesinin endüksiyonu için bir stabilize edilmiş, modifiye mRNA&#39;nın üretmektedirler. Bu protokol kullanılarak, istenen diğer mRNA oluşturulabilir. Modifiye edilmiş mRNA in vitro sentez hedef proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için arzu edilen mRNA ile hücrelerin transfeksiyonu sağlar. Ekzojen olarak teslim mRNA tamamen indirgendi kadar Böylece, ...

Hücrelerde, haberci RNA transkripsiyon (mRNA) ve istenen mRNA&#39;nın proteinlere aşağıdaki çeviri hücrelerin düzgün işleyişini sağlamak. Kalıtsal veya sonradan kazanılmış genetik bozukluklar proteinlerin yetersiz ve işlevsiz sentezine yol ve şiddetli hastalıklara neden olabilir. Bu nedenle, eksik ya da kusurlu protein üretimini uyarmak için yeni bir tedavi yaklaşımı hücreler içine mRNA, değiştirilmiş sentetik eksojen dağıtım, istenilen protein için kodları. Böylece, hücreler normal olarak üretemez ya da doğal olarak ihtiyaç olan fonksiyonel proteinleri sentezlenmesi için tetiklenir. Bu yaklaşım kullanılarak, genetik bozukluklar mRNA&#39;nın katılmasıyla çözülebildiğini bozuk veya eksik protein 1 kodlar. MRNA, tedavi aynı zamanda tümör hücrelerinin ya da patojen uyarıcılar tarafından ifade edilen proteini antijenleri ile sentezlemek için aşılama için kullanılabilir. Böylece, konak bağışıklık sistemi tümör hücrelerini etkili bir şekilde ortadan kaldıracak ya INFE önlemek için etkinleştirilebilirseksiyonlar 2,3. Bundan başka, son yıllarda, mRNA, başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretmek için kullanıldı. Bu amaçla, fibroblastlar yeniden programlama için sentezleme 4-6 faktörleri uyarılması için ve rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahip iPSCs bunları dönüştürmek için mRNA ile transfekte edilmiştir. Daha önce, bilinen mRNA kullanımı, düşük stabilite ve güçlü immünojenite ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, geleneksel bir mRNA klinik uygulamalar ile sınırlı kalmıştır. Bununla birlikte, Kariko ve arkadaşları tarafından mRNA molekülü içinde 5-metilsitidin ve pseudouridine ile sitidin ve üridin yerine biyolojik sıvılar içinde kararlı mRNA moleküllerini hale getirilir ve önemli ölçüde artık tadil edilmiş mRNA&#39;ların klinik uygulanabilirliği karşılaştırın immün aktivasyonu, 7-10, azaltmıştır. Sentetik olarak üretilen tadil edilmiş mRNA&#39;ların kullanarak, istenen gen transkript geçici olarak in vivo 11 teslim edilebilirya da in vitro protein ifadesini uyarmak için. İlave edilen mRNA, hücre nakil mekanizması tarafından fizyolojik koşullar altında çevrilmiştir. Nedeniyle Viral gene terapi vektörleri göre konakçı hücre genomuna entegrasyon eksikliği, onkojenez riski 12,13 önlenir. Böylece, modifiye sentetik mRNA kullanılarak tedavi gelecekte daha iyi klinik kabul alırsınız. Burada, modifiye mRNA üretiminde (Şekil 1) mRNA ile hücreler ve transfekte hücrelerde protein ifade değerlendirilmesi, transfeksiyon için detaylı bir protokol açıklar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&amp;nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td></tr><tr><td>HEK-293 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, 12-well&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask (75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml conical tubes&amp;nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 &amp;micro;l: 022491202; 100 &amp;micro;l: 022491237; 1,000 &amp;micro;l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Plasmid amplification and purification&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Dissolve 25 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>LB agar (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Dissolve 40 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>Ampicillin Ready Made Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;mRNA production&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Methyl-CTP</td></tr><tr><td>Pseudouridine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&amp;acute;-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;acute;)ppp(5&amp;acute;)G RNA cap structure analog&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&amp;micro;l&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&amp;micro;l (from MEGAscript T7 Kit)</td></tr><tr><td>Antarctic phosphatase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap solution&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Cationic lipid transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Gel electrophoresis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x in water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flow cytometry analyses&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Forward Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;-TTGGACCCTCGTAC&lt;br /&gt;AGAAGCTAATACG-3&amp;acute;</td></tr><tr><td>Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;- T&lt;sub&gt;120&lt;/sub&gt;-CTTCCTACT&lt;br /&gt;CAGGCTTTATTCAA&lt;br /&gt;AGACCA-3&amp;acute;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (5%) and O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (20%)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CASY cell counter&amp;nbsp;</td><td>Sch&amp;auml;rfe System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile workbench&amp;nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial incubator&amp;nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Analytic Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus for electrophoresis&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel documentation system&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan System&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase-contrast microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

İstenilen hücrelerinde protein sentezinin endüksiyonu için sentetik mesajcı RNA (mRNA) kodlama eksojen dağıtım rejeneratif tıpta, temel hücre biyolojisi, hastalıkların tedavisi ve hücrelerin yeniden programlanmasının alanlarında büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, akış sitometrisi ile indüklenmiş protein ekspresyonu azaltılmış immün aktivasyon potansiyeli ve stabilitesi arttırılmış üretilen mRNA kalite kontrolü, hücrelerin transfeksiyonu mRNA ile ve test modifiye mRNA&#39;nın üretimi için aşamalı protokolde bir adım tarif eder. EGFP mRNA ile tek bir transfeksiyon sonrasında 3 güne kadar, transfekte edilmiş HEK293 hücreleri eGFP üretir. Bu video makalede, EGFP mRNA sentezi bir örnek olarak tarif edilmektedir. Bununla birlikte, bu prosedür, diğer arzu edilen mRNA&#39;nın üretilmesi için uygulanabilir. MRNA, modifiye edilmiş sentetik kullanarak hücreleri geçici olarak normalde eksprese olmaz arzu edilen proteinleri eksprese etmek için uyarılan edilebilir.

EGFP CD içeren pcDNA 3.3 plasmidi kullanılarak, tadil edilmiş eGFP mRNA sentezi (Şekil 1) kurulmuştur. PCR ile uç amplifikasyon ve poli T-atık sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluktaki temiz bir bant (Şekil 2) tespit edilir. MRNA (Şekil 3) verimi IVT zaman Artırılmış artırılması. IVT sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluğunda bir açık mRNA bandı üretilecek EGFP mRNA&#39;nın uzunluğu (Şekil 4) tekabül edecek şekilde tespit edilmiştir. <...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder.

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA&#39;nın Değiştirilmiş

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

24.9K Görüntüleme.  University Hospital Tuebingen.  Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder. 

Video: In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genetik

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Gelişim Biyolojisi

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic applications, including a novel class of vaccines, protein replacement therapies, and immune therapies. Among delivery vectors, lipid nanoparticles are found to be safer and more effective in delivering RNA molecules (e.g., siRNA, miRNA, mRNA) and a few products are already in clinical use. To demonstrate lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery, we present an optimized protocol for the synthesis of functional me1&#936;-UTP modified eGFP mRNA, the preparation of cationic liposomes, the electrostatic complex formation of mRNA with cationic liposomes, and the evaluation of transfection efficiencies in mammalian cells. The results demonstrate that these modifications efficiently improved the stability of mRNA when delivered with cationic liposomes and increased the eGFP mRNA translation efficiency and stability in mammalian cells. This protocol can be used to synthesize the desired mRNA and transfect with cationic liposomes for target gene expression in mammalian cells.

The protocol presents in vitro transcription (IVT) of chemically modified mRNA, cationic liposome preparation, and functional analysis of liposome enabled mRNA transfections in mammalian cells.

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic ...

Biyokimya

<meta charset="utf8"></head><body>Mikro Bölmeli Sentetik Hücreler için CFPS Protokolleri

Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for the core machinery of the Central Dogma, standing as an optimal chassis for the integration and assembly of diverse artificial cellular mimicry systems. Despite its frequent use in the fabrication of synthetic cells, establishing a tailored and robust CFPS system for a specific application remains a nontrivial challenge. In this methods paper, we present a comprehensive protocol for the CFPS system, routinely employed in constructing synthetic cells. This protocol encompasses key stages in the preparation of the CFPS system, including the cell extract, template preparation, and routine expression optimization utilizing a fluorescent reporter protein. Additionally, we show representative results by encapsulating the CFPS system within various micro-compartments, such as monolayer droplets, double-emulsion vesicles, and chambers situated atop supported lipid bilayers. Finally, we elucidate the critical steps and conditions necessary for the successful assembly of these CFPS systems in distinct environments. We expect that our approach will facilitate the establishment of good working practices among various laboratories within the continuously expanding synthetic cell community, thereby accelerating progress in the field of synthetic cell development.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Sentetik Hücre Yapısı için CFPS Sistemlerini Optimize Etme

This protocol describes the Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system used in constructing synthetic cells. It outlines key stages with representative results in different micro-compartments. The protocol aims to establish best practices for diverse laboratories in the synthetic cell community, advancing progress in synthetic cell development.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Biyomühendislik

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Biyoloji

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. Efficient and safe delivery systems must be included in the mRNA vaccines due to the fragile properties of mRNA. A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) gene delivery system is specifically designed for the pulmonary delivery of nucleic acids and displays promising capabilities in mediating successful mRNA transfection. Here, an improved method for preparing PP-sNp is described to elaborate on how the PP-sNp&#160;encapsulates Metridia luciferase (MetLuc) mRNA and successfully transfects cultured cells. MetLuc-mRNA is obtained by an in vitro transcription process from a linear DNA template. A PP-sNp&#160;is produced by mixing synthetic peptide/poloxamine with mRNA solution using a microfluidic mixer, allowing for the self-assembly of PP-sNp. The charge of PP-sNp&#160;is subsequently evaluated by measuring the zeta potential. Meanwhile, the polydispersity and hydrodynamic size of PP-sNp&#160;nanoparticles are measured using dynamic light scattering. The mRNA/PP-sNp nanoparticles are transfected into cultured cells, and supernatants from the cell culture are assayed for luciferase activity. The representative results demonstrate their capacity for in vitro transfection. This protocol may shed light on developing next-generation mRNA vaccine delivery systems.

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) is developed using a microfluidic mixing device to encapsulate and deliver in vitro transcribed messenger RNA. The described mRNA/PP-sNp could efficiently transfect cultured cells in vitro.

Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA'nın Değiştirilmiş

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu