Name: recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach at JoVE.com

Biz bu iş ve Leicester Çekirdek Biyoteknoloji Hizmetleri Üniversitesi için kullanılan ifade yapıları hazırlamak için Dr Xiaowen Yang (PROTEX klonlama servisi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BBSRC öğrencilikle tarafından desteklenen, Wellcome Trust Programı ve Kıdemli Araştırmacı hibe WT085408 &amp; WT100237 ve BBSRC RM31G0224 hibe.

NOT: Protokol, bu nedenle reaktif hacimleri ve miktarları orantılı ölçekli gerektiğini ifade herhangi bir ölçek için uygundur. Uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada uygun bir klonlama (Şekil 1) ikinci sınırlama enzimleri seçimine bağlı olarak, bir afinite etiketi dahil veya hariç tutulması sağlayan değiştirilmiş pcDNA 3.1 sentezleme vektörünü kullandık. Aşağıdaki protokol, büyük ölçekli bir transfeksiyon açıklanmaktadır. 1 litrelik silindir şeklinde şişelerde geliştirilmiştir: 1. Büyük Ölçekli Kültür / transfeksiyonu Büyüme ve standart protokollere göre, süspansiyona adapte olmuş HEK293F hücreleri korumak. Tipik olarak 30 ila 100 ml &#39;lik başlangıç ​​kültürleri 250 ml konik bir hücre kültürü şişelerinde büyütülür. <ol><li> Her bir 1 litrelik silindir bir şişe içinde 300 ml lik bir son hacim için 0.5 x 10 6 hücre / ml tohum hücreleri. Not: Silindir şişe en fazla 150 ml &#39;lik bir minimum uyumSüspansiyon kültürünün 300 mi. Büyük ölçekli nakiller için birden fazla şişe kullanmayın. </li><li> Hücreler 1.0 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir yoğunluğa ulaşana kadar 37 ° C&#39;de bir orbital çalkalayıcı bir inkübatör içinde 24 saat 120 rpm&#39;de ve% 5 CO2 inkübe edin (hücreler yaklaşık olarak her 24 saatte bölmeliyiz). </li><li> Filtre ve sterilize edilen 300 ug DNA, toplam Pipet 3 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde 30 ml PBS ve girdap içine (tamamlayıcı şekli). Not: milyon başına transfekte edilmiş hücrelerin DNA 1 ug toplam kullanın. Iki ya da daha fazla plazmidin edilecek ise hücrelere DNA oranı sabit kalır, böylece her bir miktarını azaltmak birlikte-transfekte edilmiştir. </li><li> 1.2 ml 0.5 mg Ekle / 3 saniye boyunca kuvvetlice PBS / DNA çözümü ve vorteks PEI-süzülerek sterilize ml. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> DNA ekleme / PEI karışımı hücrelere - 1 x 10 6 hücre / ml (adım 1.3) de bir yoğunlukta olması gereken. </li><li> Müşterek transfeksiyon sonrasında hücreler inkübeBir başka 37 ° C de 48 saat, 120 rpm&#39;de ve% 5 CO2 boyunca orbital bir gece boyunca kuluçkaya yatırılmaktadırlar. </li><li> 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler -80 ° C&#39;de saklayın pelet Hasat hücre içi proteinlerdir. Not: Alternatif olarak, kültür ortamı üzerinde% 5 CO2 ile değiştirilir ve şişe kapağı kapatılır değilse (CO2), kuluçka makinesi çalkalanarak bir standart kullanır. Atmosfer her bir geçit (normal olarak her 2 gün) ile değiştirilmesi gerekir. </li></ol> Tüm Hücre ekstresi 2. Protein saflaştırma kompleks Bu protokol, FLAG-etiketli proteinleri kullanılarak nükleer komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiştir. <ol><li> Hücre topaklarını içine defrost ~ önceden soğutulmuş lizis tamponu, 40 ml (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5,% 5 gliserol,% 0.3 Triton X-100, proteaz inhibitörleri) kültür bir L başına. </li><li> Yeniden askıya pipetleme ve birkaç kez aşağı pelet (köpük önlemek vorteks yapmak değil). </li&gt; <li> İyice bir cam homojenleştirici kullanılarak hücrelerin yeniden askıya. 3 siklus (15 sn, 15 sn kapalı) için sonikasyon. 4ºC&#39;de 25 dakika boyunca 30.000 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant saklayın. </li><li> Dengeye reçine dengeleme tamponu (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5) ile üç kez yıkanarak kültürün her bir litresi için agaroz reçinesi paketlenmiş bir anti-flag 1.25 ml. </li><li> Bir ya da daha fazla 50 ml santrifüj tüplerine afinite reçinesiyle adım 2.3 bütün hücre ekstresi inkübe yavaşça 4 ° C&#39;de 30-120 dakika için örnek döndürün. </li><li> 4 ° C, ıskarta süpernatan 1 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Önceden soğutulmuş tampon 1 45 ml reçine ile yıkayın (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5,% 5 gliserol,% 0.3 Triton X-100). 1 dakika boyunca 3.000 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> Adımı tekrar 2.7 tuz tamponu kullanılarak düşük tuzlu tampon (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7 ile (300 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5,% 5 gliserol), ardından0,5,% 5 gliserol) TEV yarılması tamponu (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5, 0.5 mM TCEP). NOT: Her yıkama emin olun tamamen artık reçine yeniden askıya ve yeterli kısa, yani olduğunu. </li><li> Reçine 10 ul numune toplamak ve analiz için 2x protein yükleme tamponu (bağlı protein kontrol) 1 hacim içine sulandırmak. Reçineden antikoru serbest önlemek için indirgeyici maddeler kullanmayın. </li><li> Bir 15 ml santrifüj tüpüne önceden soğutulmuş TEV yarılma tamponu ve transfer 8-10 ml reçine yeniden askıya. </li><li> Ekle ~ 40 orijinal kültür bir L başına (1 mg / ml stok) TEV proteaz ug ve birçok kez aşağı ve yukarı pipetlenerek ile iyice karıştırın. </li><li> Protein oksidasyonunu önlemek için% 100 N 2 gazı ile tüp atmosferi değiştirin. </li><li> Yavaşça 4ºC&#39;de O / N döndürmek. </li><li> 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj. Uygun bir molekül ağırlığı kesmesi ile bir ultra santrifüj filtre içine süpernatant aktarın ve konsantre500 ul kadar. </li><li> Konsantre protein, 10 ul numune toplamak ve analiz için 2x protein yükleme tamponu 1 hacim içine sulandırmak. (TEV kontrol sıyırma sıvısı). </li><li> Reçine, 10 ul numune toplayın ve analiz için 2x proteini yükleme tamponu içinde 1 hacim içine seyreltilir. Reçineden büyük miktarlarda antikor serbest önlemek amacıyla indirgeyici maddeler kullanmayın. (Post-TEV reçine kontrol). </li><li> Jel filtrasyon tamponu (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5, 0.5 mM TCEP) ile boyut dışlama kromatografisi kolonu dengelenmesi. </li><li> 0.22 um bir filtre ile filtre proteinini </li><li> Kolona numunenin yükleyin ve fraksiyonlarım toplamak. </li><li> Adım 2.9, 2.15 ve 2.16 ve analiz için bir SDS-PAGE ve Coomassie boyaması, adım 2.19 ikinci jel filtrasyon fraksiyonlardan çalıştırın örnekleri. Not: Bu, hedef proteininin ekspresyonunu doğrulamak için adımlar 2.9, 2.15 ve 2.16 önce jel süzülerek örnekler SDS-PAGE çalıştırmak için tavsiye edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold.">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li><li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+(ethylenimine)+and+its+role+in+gene+delivery.">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li><li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li><li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris.">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li><li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate.">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li><li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates.">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li><li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins.">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li><li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK&#8208;293+Cells:+Application+to+Large&#8208;Scale+Protein+Production.">Transient Gene Expression in Suspension HEK&#8208;293 Cells: Application to Large&#8208;Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu ifade ile, rekombinant proteinleri ve memeli hücrelerinden çoklu bir alt birim kompleksinin saflaştırılması için büyük miktarda (PEI&#39;ler ticari olarak temin edilebilen lipofilik transfeksiyon reaktifleri daha az maliyeti), bir basit ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, son derece saf DNA (260/280 1.8 ila 2.0) PEI ile bir arada kullanıldığında, optimum transfeksiyon ve ekspresyon etkinliği ulaşılabilir. Hücreler serum- ve antibiyotik içermeyen ortam içinde kültür olmalıdır, bu nedenle sıkı bir şekilde steril teknik pahalı ve zaman alıcı enfeksiyonları önlemek için pasaj ve transfekte hücreler için gereklidir. Hücre canlılığı,% 90 ya da daha yüksek olmalıdır ve kültürler 2.5 x 10 6 hücre daha yüksek yoğunlukları ile olmamalıdır / hemen transfeksiyondan önce, bu sayede protein verimini düşürür ml. Başarılı transfeksiyon için, kültürler, sadece tek ya da bölünen hücreleri içermelidir. Kümeler gayretle tarafından kırılmış olabilir30 sn (Şekil 5) için lı vorteksleme 20. Ko-transfeksiyon kullanılan her plazmid oranı incelenmiştir olan kompleks bir karma bilgisine göre kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Bir kez uygun bir ekspresyon kurulabilir, böylece sentezlenmesi verimliliği, ilgilenilen protein için optimize edilebilir. Arıtma istenmeyen proteolitik bozulması riskini azaltmak için her zaman, protein numune soğuk tutmak yapılmalıdır. Genellikle daha düşük çözünürlük ve / veya enzimatik aktivite kaybı ile sonuçlanan, yapısal elemanlar veya belli proteinlerin aktif alanlarının müdahale edebilir yana etiketler ve saflaştırma tamponların seçimi kritiktir. Küçük ölçekli transfeksiyon, büyük protein komplekslerinin saflaştırılması için çeşitli konstruktlarının test edilmesi için özellikle yararlıdır. Bugün, farklı yöntem büyük bir çeşitlilik rekombinant proteinlerin ökariyotik (Tablo 2) ekspresyonu için kullanılabilir. Örneğin, Baculoviböcek hücrelerinde sentezleme rus yaygın olarak yüksek transdüksiyon verimliliği ve diğer viral türler 6 ile karşılaştırıldığında sitotoksisite eksikliğine bağlı olarak kullanılır. Bununla birlikte, virüs verme süreci, zaman alıcıdır ve istikrarsızlık virüs uzun süre saklanmasına izin vermez. Öte yandan, maya ekspresyon sistemleri, yüksek protein verimi 7 sonuçlanan fermentasyon kültürlerde hücre çok yüksek yoğunluklar büyüme ihtimalini sunmaktadır. Ama yine de doğru katlanmayacak ve protein partnerleri ile etkileşim için gereken ökariyotik proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlar tam çeşitli yoksundur. HDAC3, örneğin, eksprese edilir, fakat E&#39;de bükülmemesini coli. 293F hücrelerinde ifade Ancak, onun ortak bastıncısı (SMRT) ve prokaryotik hücrelerde bulunmayan inositol tetrafosfat (IP4) 8, bir molekül ile kompleks aktif enzimin saflaştırılması mümkün. Bu yöntem ayrıca st arındırmak ve kristal çözmek için bize izin verdiHDAC1 üzerindeki etkisi benzer şekilde 9 IP4 aktive edilir nurd kompleksinde mta1 etkileşim kezlerinin. İdeal olarak, biz her zaman onların doğal, fizyolojik bir ortamda ökaryotik proteinleri ifade etmek istiyorum. Biyoreaktörler 10-12, HEK 293, EBNA1-hücreleri kullanan memeli ekspresyon sistemleri de tarif edilen ve proteininin çok yüksek seviyelerini elde edilmiştir, fakat bu kullanımı da karmaşıktır olabilir edilmiştir. Önerilen yöntem, bakteri, maya ve biyoreaktör sistemlerinde tanımlanması için basit ve erişilebilir bir alternatiftir. Ekspresyon yöntem hızlıdır ve silindir şişe, kavanoz bir atmosfer,% 5 CO2 ve standart çalkalanarak kuluçka kullanılan ile değiştirilir, özellikle pahalı ekipman kullanımını gerektirmez. Birden fazla plazmidler ortak transfeksiyonu ve kültürü içinde&gt; 1 mg / L&#39;lik bir verimle en fazla beş proteinlerle de kompleksler saflaştırmak için aşağıdaki protokol kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, sistem kararlı uslu komplekslerinin tanımlanmasını sağlar. Örneğin, exHDAC1 ve Sin3A ikili kompleksinin sıkıştırma protein sınırlı verimlerini verdi, ancak SDS3 ilavesi daha yüksek miktarlarda 5-kat ve bu nedenle uygun yapılar ve kristalize edilmesine yönelik olarak kararlı kompleksler seçimi yapısal biyologdan kılavuzları ile sonuçlanmıştır.

Moleküler hücre biyolojisi hızlı ilerleme ve tıp geliştirilmiş ilaçların sürekli bir ihtiyaç yapısal biyologlar giderek daha karmaşık protein yapılarının bakmak için bir ihtiyaç yarattı. Bu genellikle karmaşık bir katlama ve enzimatik aktivitesini desteklemek için özel bir post-translasyonel modifikasyonlar, moleküler şaperonlar ve ko-faktörlerini de gerektirebilir. Bakteriyel ekspresyon sistemleri kullanılarak elde edilmiştir Protein Data Bank mevcut yapıların büyük çoğunluğu iken, prokaryotes bu değişiklikler çok sayıda yapamazsanız ve birçok temel ökaryot ko-faktörler yoksundur. Bu küçük sinyal molekülleri tarafından yanı sıra nükleer, hücre yüzeyinde ve ayrıntılı katlama makineleri gerektiren salgılanan proteinler aktive edilmiş büyük çok-alt birim komplekslerinin çalışma için bir sorun olabilir. E. bir dizi coli suşları bu sınırlamaların 1 bazılarının üstesinden gelmek için tasarlanmış edilmiştir. M Son yıllarda, ancak, kullanımonlar güvenilir diğer sistemlerde 2 ifade aksi takdirde sorunlu ökaryotik proteinler üretmek çünkü ammalian ifade sistemleri artmaktadır. Bugün kimyasal aracılığında transfeksiyon, viral transdüksiyon arasında değişen çeşitli teknikler vasıtasıyla kararlı ve geçici memeli ifadesi hücre çizgileri elde etmek mümkündür, örneğin elektroporasyon, doğrudan enjeksiyon 3 fiziksel gen transferi. Bu yöntemlerin hepsi avantaj ve dezavantajları kendi seti var ise, bunlardan sadece birkaç ya da çok pahalı ve / veya zaman alıcı olmak yapısal çalışmalar için uygundur. Burada askı büyümüş memeli hücrelerinde yapısal biyoloji, protein kompleksleri ifade etmek için, çok basit, hızlı, ucuz ama son derece etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım (örneğin, 293F Serbest HEK hücreleri) bir insan embriyonik böbrek (HEK) hücre hattının geçici ko-transfeksiyon kullanır. Bu hücreler, HEK 293 mesaf elde edilmiştirII hattı, serumsuz ortam kullanılarak yüksek yoğunluğa (örneğin 293 Antarctica sentezlenmesi ortamı) ulaşan, süspansiyon kültürleri içinde büyümeye adapte edilir. Hücreler, bundan sonra, geçici polietilenimin dallı bir versiyonu (PEI), endositoz 5 konak hücre içine girer, DNA / PEI kompleksleri oluşturarak memeli hücrelerinin 4 arasında geniş bir aralıkta çalışması için rapor edilmiş bir ucuz polimerik bir reaktif kullanılarak transfekte edilir. Bu yöntem büyük ölçekte (30 mi) ve (300 ml kadar) büyük ölçekli deneyler için uygundur ve saflaştırılmıştır protein komplekslerinin yüksek seviyelerde üretebilir. Bu kompleks bir katlama makineleri, ko-faktörler ya da bakteri, maya ve böcek hücreleri tarafından yapılamaz, özellikle post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren protein çalışmaları için yararlıdır. Bu protokolde Sin3A transkripsiyonel represyon kompleksinden üç proteinin merkezi skafoldun ifadesi ve saflaştırılması sunuyoruz. Bu histon oluşmaktadırDeacetylase 1 (HDAC1), Arızalı suskunluğu 3 (SDS3) arasında Supresor ve Switch-bağımsız 3 (Sin3A). Arıtılmış karmaşık ve yüksek verimlilik kristallendirme çalışmalarında kullanılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle HEK 293F cells&amp;nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td><td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>Roller bottles with vented caps</td><td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, 25 kDa, branched</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Make 0.5 mg/ml stocks in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Mammalian expression vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Centrifugal Filter Units</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&amp;nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

Burada HDAC1, SDS3, Sin3A üçlü kompleksin bir 2 L (8 x 250 mi kültür) geçici ko-transfeksiyon ve saflaştırılmasını göstermektedir. HDAC1 üzerindeki etkisi ve SDS3 Sin3A bir HDAC-etkileşim alanı (HID) aracılığıyla Sin3A etkileşime girer. Kültürün litresi başına kompleksi 1 mg a kadar bir tipik saflaştırma ürünleri. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil değiştirilmiş pcDNA 3.1 ekspresyon vektörünün şematik 1.. Plazmid Sin3A amino terminusunda afinite etiketi TEV yarılma sitesini içermeli EcoRV ve EcoRI ile sindirildi. HDAC1 ve SDS3 arasında etiketlenmemiş sürümlerini klonlanması amacıyla, vektör Kpnl ve EcoRI ile sindirildi. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. SDS-PAGE saflaştırma birinci aşamasını gösteren. &quot;Bağlı protein,&quot; şerit afiniteli bir reçine bağlı kompleksini göstermektedir. Sindirme işlemini takiben, TEV, Sin3A-HID üzerinde etiketi mevcut keislir ve jelin ikinci ve üçüncü şerit gösterildiği gibi karmaşık reçineden elüe edilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil protein kompleksi kullanılarak saflaştınldı boyut dışlama kromatografisi 3. kromatogramı. Bu çözelti içinde bir dimer oluşturur, çünkü saf kompleks boşluk hacminde elüt unutmayın. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 3&#39;te gösterilen jel filtrasyon fraksiyonların gösteren Şekil 4, SDS-PAGE. 6 hücre / mL Ready 2.3x10 Şekil 5&#39;de Tripan mavi boyalı HEK 293F transfekte edilebilecek hücreler. Büyük kümeler, yaklaşık 25 saniye boyunca kuvvetli bir girdap tarafından kırılmış olabilir iken, sadece hücreler, tek veya bölünen hücreler olarak mevcut olması gerekmektedir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Olası nedenleri </td><td> Eylem </td></tr><tr><td rowspan="4"> Düşük protein verimi. </td><td> Düşük sayıda hücrelerin transfekte edildi. </td><td> Emin hücre yoğunluğu 1.0 x 10 6 kültüre transfeksiyon reaksiyon karışımının eklemeden önce yaklaşık olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td> Hücreler çok kez pasajlandı olabilir. </td><td> Yaklaşık 90 geçişten sonra Taze stok hücrelerini kullanınyaşları. </td></tr><tr><td> DNA, düşmüş ya da yabancı maddeler, yüksek bir miktarda olabilir. </td><td> Emin plazmid DNA, kullanılmakta olan 1.8 ve 2.0 arasında bir 260/280 oranına sahiptir. Bir agaroz jeli üzerinde çalışan DNA kalitesini değerlendirmek için tavsiye edilir. </td></tr><tr><td> Protein (ler) olarak ifade edilen sabit ya da yeterince çözünür değildir. </td><td> Önce transfections ölçekleme yukarı-küçük ölçekli Farklı yapıları test edin. Emin etiketler ilgilenilen protein (ler) in yapısı ile karışmaz olun. </td></tr><tr><td> Hücreler bulutlu bakmak ve sıradışı renk ve / veya koku var. </td><td> Hücreler, bakteri ya da maya ile enfekte edilir. </td><td> İyi steril teknik her zaman için kullanılmalıdır. Laminer akış davlumbaz buharla dezenfekte eden ve enfeksiyon durumunda, hücre kültür odası UV dezenfekte sorunu içeren yardımcı olur. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hücreler, düşük canlılığı sahiptir. </td><td> Medyada yanlış pH. </td><td> Emin kültürler CO 2% 5-8 yetiştirilen emin olunher zaman. </td></tr><tr><td> Hücreler 3.0x10 6 hücre / ml &#39;den fazla bir yoğunluğa kadar kültürlenmiştir. </td><td> Hücreler, 2.5 x 10 6 hücre / ml hemen önce transfeksiyon ve asla 6 10 x 3,0 Yukarıda sözü edilen hücreler / ml üzerinde yoğunluklara büyümüş olmamalıdır. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Afinite saflaştırma işe yaramadı </td><td> Protein (ler) olarak ifade varlık değildir. </td><td> Yukarıdaki bakın. </td></tr><tr><td> Arıtma koşulları yanlış olabilir. </td><td> (Örneğin, yüksek tuz, düşük tuz, pH). Tampon koşullarını ayarlayın </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sorun Giderme. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistem </td><td> Avantajları </td><td> Dezavantajları </td></tr><tr><td> E.coli </td><td><ul><li> Hızlıifade sistemi </li><li> Yüksek protein verimi </li><li> Ucuz </li><li> Izotopik olarak etiketlenmiş proteinlerin uygun üretimi için uygun </li></ul></td><td><ul><li> Protein katlanması için gerekli olabilir önemli şaperonlar eksikliği </li><li> Birçok post-translasyonel modifikasyonlar eksikliği </li><li> Protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Translasyon sonrası modifikasyonlar çoğunluğu gerçekleştirebilir miyim </li><li> Ucuz </li></ul></td><td><ul><li> Bazı çeviri-sonrası tadilat Lack </li><li> Protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> Böcek hücrelerinde baculovirüs tanım </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilirsiniz &lt;/ Li&gt; <li> Bakulovirüs diğer viral suşlar daha az sitotoksik olan </li></ul></td><td><ul><li> Transdüksiyon virüsü hazırlanması zaman alıcıdır </li><li> Virüs kararlı değildir ve uzun süreler boyunca saklanamaz </li><li> Böcek hücreleri, protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> Memeli sistemleri Biyoreaktörler </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilir </li><li> Protein fonksiyonu ve karmaşık montaj için gerekli tüm kofaktörlere sağlayabilir </li><li> Çok yüksek yoğunluklarda Can Hücre kültürü </li><li> Karmaşık katlama makineleri gerektiren tüm memeli proteinleri ifade edebilir </li><li> Çok yüksek protein verimi </li></ul></td><td><ul><li> Biyoreaktörü kullanmak için uzman personel gerektirir. </li><li> Pahalı ekipman gerekmektedir. </li><li> Optimize ifade koşuls zaman alıcı olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK hücreleri süspansiyon 293F </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilir </li><li> Protein fonksiyonu ve karmaşık montaj için gerekli tüm kofaktörlere sağlayabilir </li><li> Karmaşık katlama makineleri gerektiren tüm memeli proteinleri ifade edebilir </li><li> Hızlı ve sezgisel transfeksiyon protokolü </li><li> Biyoreaktörler ve / veya diğer ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karşılaştırıldığında nispeten pahalı olmayan bir. </li></ul></td><td><ul><li> Bakterilerde ifadesi olarak olsa da uygun fiyatlı, ucuz değil </li></ul></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Avantajları ve ana sentezleme sistemlerinin dezavantajları.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach at JoVE.com

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

53.7K Görüntüleme.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Video: Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Genetik

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Biyomühendislik

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biyoloji

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.