Name: immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria
Uploaded: 2014-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria at JoVE.com

Biz sitometresi akış erişimi için Laurie Destroismaisons ve üstün teknik destek için Sarah PEYRARD ve Dr.Alexandre Prat teşekkür ederiz. Biz de hazırlıkları miyelin kaldırılması ile ilgili yaptığı katkılarından dolayı Dr Timothy Miller kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Nöromusküler Araştırma Ortaklığı, Yenilik için Kanada Vakfı, Kanada ALS Derneği, ALS Araştırma Frick Vakfı, CHUM Vakfı ve Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV) olan Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Hem CVV ve NA olan Araştırma Âlimler Fonds de la Recherche en Santé du Québec ve CIHR Yeni Müfettişler. SP Kanada ALS Derneği&#39;nin Tim Noël Öğrencilik tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışmada kullanılan hayvanların Kanada tarafından belirtildiği gibi ulusal standartlar aşağıdaki Hayvanları Koruma Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM) Kurumsal Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol (N08001CVsr) sıkı göre tedavi edildi Hayvan Bakım Konseyi (ccac). Bu protokolü (Tablo 1) gerçekleştirmek için gerekli tüm reaktifleri hazırlayın. Ekipman, malzeme ve tedarikçi ile ilgili diğer tüm detayları Malzeme Listesi bulunabilir. <img alt="Tablo 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> Tablo 1. Tampon bileşimler. Sıçan Omurilik 1. Koleksiyonu <ol><li> Derinden% 4 isofloran ile sıçan (Sprague Dawley) uyuşturan. Th sıkıştığı üzerine refleksi eksikliği ile anestezi doğrulayıne forepaw. Giyotin ile dekapitasyon yoluyla sıçan öldürülür. Ötenazi Bu yöntem omuriliği deforme olabilir başkaları üzerinde tercih edilir. </li><li> Omurga ortaya çıkarmak için arka cilt kesin. Sadece leğen kemiği üzerinde kemik makası ile omuriliğe kesin. Vertebral kolonun açılmasını gözünüzde canlandırın. </li><li> Vertebral kolona, ​​Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile doldurulmuş bir 200 ul pipet ucu (alev biraz üzerinde eriyen yoluyla bağlanmış) ile, bir 10 ml şırınga yerleştirin. </li><li> Pistonun basınç orta tatbik edilmek sureti ile omurilik yıkayın. </li><li> Herhangi bir kan, omurilik mevcut ise, bir sonraki aşamaya geçmeden önce PBS ile yıkayın. NOT: Bu yöntem aynı zamanda beyin ve karaciğer için valide edilmiştir. Bu dokular dahil olmak üzere, durumunda, yarısı kurban sıçandan beyin ve omurilik ağırlıkça eşit bir karaciğer parçası toplar. Diğer tüm adımlar aynıdır kalır. </li></ol> Omurilik Mit 2. izolasyonuochondria (Vande Velde ve ark uyarlanmıştır. 4) <ol><li> 5 hacim (~ 3.25 mi) Homojenleştirme tamponu (HB) ile 5 ml&#39;lik bir cam homojenizatör içinde, bütün dokunulmamış omurilik yeri ve toplayın. İzole mitokondri optimal kurtarma için, buz veya soğuk odada tüm adımları uygulayın. Doku hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar, elle yaklaşık sekiz vuruşları doku homojenize. İki (2 mi) ve üç (1.7 mi) mikrosantrifüj tüplerinde Homojenat yerleştirin. Bir tezgah üstü mikrosantrfuj, 4 ° C&#39;de 10 dakika 1,300 x g santrifüj. </li><li> 5 ml&#39;lik bir ultrasantrifüjdeki tüpüne süpernatant ve yer kurtarın. Pelet içeren mikrosantrifüj tüp 750 ul (~ 0.5 hacimler) HB ekleyin ve hafifçe pelletini. Tekrar santrifüj ve yeniden süspansiyona iki kez daha yineleyin. Havuz yukarıdaki ile aynı 5 ml&#39;lik bir ultra santrifüj tüpüne tüm üst sıvıları (S1a ve S1 B). Bu adım, küçük enkaz kaldırmak için hizmet vermektedir. </li><li> Santrifüj S1 sallanan bir kova çürüklüğü ile donatılmış bir ultrasantrifüjdeki kullanılarak toplandıya da 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Sitosolik parçacık, (Western blot analizi için örneğin) ilgi ise daha sonraki işlemler için bir süpernatan (S2) muhafaza edilmelidir. 4 mi HB + 50 mM KCI pelet (P2) ham mitokondriyal fraksiyonu, yeniden süspanse edin. Bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C&#39;de 15 dakika 17,000 x g santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça 800 ul HB pelet (P3) tekrar süspansiyon. Not: Mitokondri herhangi bir özel olmayan mitokondriyal ilişkili kirleri çıkarmak HB ile + 50 mM KCI ile yıkanmıştır. </li><li> Yeni 5 ml&#39;lik bir ultra santrifüj tüp içinde, süspansiyon haline getirilen tanelere, (P3) tam olarak 800 ul ekleyin. </li><li> Bu tüp, böylece% 12 iyodiksanol bir nihai konsantrasyonu yaratırken, iyodiksanol (yoğunluk gradyan ortamı) 200 ul ilave edin. Yavaşça ancak iyice P1000 ile pipetleme yoluyla tüpün içindekiler karıştırılır. İlk iyodiksanol eklenmesi ve daha sonra tekrar askıda topak (P3) iyice karışmasını kolaylaştırmak için tercih edilir. Bir Ult yılında santrifüj4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de bir sallanan kepçeli rotor ile donatılmıştır racentrifuge. </li><li> Not: Karaciğer miyelin içermeyen ve sadece karaciğer işlenirken, bu nedenle, bu adım gerekli değildir. Karaciğer MSS mitokondri ile eş zamanlı olarak, işlenmekte olan, ancak eşit tüm dokularını tedavi etmek için önerilmektedir. </li><li> Tüpün üst miyelin tabakasını aspire ve dikkatli bir şekilde çıkarın ve süpernatantı atın. Pelet gevşek olabilir. 4 ml HB pelletini. Tekrar santrifüj 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de. Süpernatantı atın ve 4 ml HB pelletini. Santrifüj tekrarlayın ve süpernatant kaldırmak. </li><li> 100-200 ul HB nihai pelet (P7) tekrar ve bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp transfer. Bu örnek izole mitokondri içerir. </li><li> Protein miktar tayini geçin. Mitokondri pahalı ne yeterli çözülmesini sağlamak için örnekler ve% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) standart eğri seyreltinng protein ölçümü. </li></ol> Akış Sitometrinin için İzole Mitokondri 3. ile immün <ol><li> Her boyama karışımı test edilebilmesi için, pipet 1,7 ml mikrosantrifüj tüp içine izole mitokondri 25 mcg. Her deneyde bir boyanmamış örnek sayılabilir; ve her bir antikor için, uygun izotip kontrolü için bir örnek eklemeyi unutmayın. </li><li> Bir tezgah üstü mikrosantrifüj 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve 4 ° C (bloke etme adımı) &#39;de 15 dakika boyunca% 10-yağ asitsiz BSA ile takviye edilmiş 50 ul mitokondri tamponu (Tampon E) olarak izole mitokondri tekrar süspansiyon. Not: etiketleme sırasında, 4 ° C&#39;de bir buzdolabı içinde inkubasyon gerçekleştirmek. </li><li> Tüpüne birincil antikor (tavşan anti-Mfn2, ml başına 20 ug) ilave edildi ve 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. NOT: titrasyonu ile ampirik olarak her antikor optimal konsantrasyonunu belirleyin. Nedeniyle konsantrasyon ve / veya p değişkenliğeurity, aynı üreticinin aynı antikorun farklı partiler, farklı sonuçlara yol açabilir; Dolayısıyla antikor titrasyonu her yeni lot için gereklidir. </li><li> Bağlanmamış birinci antikorları yıkayın: Santrifüj 17,000 x g&#39;de 2 dakika süre ile 4 ° C &#39;de. Süpernatantı ve yavaşça 200 ul M Tampon pelletini. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı ve 50 ul M Tampon pelletini. </li><li> Tüpüne ikincil antikoru (Eşek anti-tavşan IgG Fikoeritrin (PE), ml başına 0.5 ug) ilave edilir ve ışıksız bir ortamda 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe örnekleri. </li><li> Bağlanmamış ikinci antikorları yıkayın: Santrifüj 17,000 x g&#39;de 2 dakika süre ile 4 ° C &#39;de. Süpernatantı ve 200 ul M Tampon pelletini. 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı ve 500 ul M Tampon pelletini. </li><li> Olaylar aslında mitokondri içinde emin olmak için, bir ile leke izole mitokondriışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca mitokondri özel floresan boya. Diğer fonksiyonel parametreler (mitokondriyal transmembran potansiyeli veya süperoksit üretimi) boyama isteniyorsa, değilse, edinimi için 5. adıma 4. adıma geçin. NOT: Bu ikincil antikor emisyon spektrumu fonksiyonel boyaların olduğu ile uyumlu olduğunu doğrulamak için önemlidir. (: Örnek 650 nm / Em 660 nm APC), örneğin, tetrametilrodamin metil ester (TMRM) FITC ve zar potansiyeline benzer spektral özelliklere sahip ticari bir boya ile mitokondriyal saflık doğrulanması durumunda, uygun bir ikincil antikor alofikosiyanin olacaktır. Tazminatlar kontrolleri ekleyin, yani bir örnek immunolabeled veya uygulanabilir olduğunda tek bir floroforla ile boyandı. </li><li> Sitometresiyle yükleme akışı için uygun bir tüp aktarın. (. Küçük örneklem büyüklüğü bir mikro tüp ml&#39;lik bir tüp akış sitometresini 3 içine yerleştirilir kolaylaştırmak için) buz üzerinde örnekleri tutun ve hemen devamedinimi için akış sitometresi. </li></ol> 4. Assaying Mitokondriyal Transmemebran Potansiyeli ve Sitometrisi ile Mitokondriyal süperoksit Üretimi <ol><li> Izole edilmiş mitokondri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca aşama 3.8 ile 100 nM TMRM (Örnek 548 nm / Em 574 nm): 5 ile lekeleme ile bir dokunulmamış zar potansiyeline sahip olduğundan emin olun. Örnekler ve popülasyonlar, TMRM (1-30 nM) &#39;nin alt / olmayan söndürme konsantrasyonlarının kullanımı arasındaki zar potansiyeli Karşılaştırma için, 6 daha uygun olabilir. <ol><li> TMRM boyama, 100 uM karbonil siyanit m-kloro fenil hidrazin (CCCP) varlığında 100 nM TMRM boyanan izole mitokondri, mitokondri depolarize bir mitokondriyal uncoupler için bir kontrol olarak. Boyanın daha düşük konsantrasyonlar kullanıldığı takdirde mitokondri depolarize için gerekli CCCP konsantrasyonu daha az olabilir. </li></ol></li><li> İzole mitokondri st tarafından mitokondriyal süperoksit üretmek doğrulayınışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, aynı zamanda adım 3.8 değerinde, uygun bir mitokondriyal süperoksit gösterge 7, geri kalan. <ol><li> Mitokondriyal süperoksit üretimi, 10 uM Antimycin A, mitokondriyal süperoksit üretimini artıracak solunum zinciri kompleksi III bir inhibitörün mevcudiyetinde boya ile leke izole mitokondri için bir kontrol olarak. </li></ol></li></ol> Sitometrisi ile kondriyayı İzole immunolabeled 5. Toplama ve Analiz <ol><li> Enstrüman kurmak: doğrusal geçiş gerilimleri izole mitokondri ve set gerilimlerin analizi kolaylaştırmak için log modu için (FSC: 450; SSC: 250). Olaylar FSC-A (alan) modu yanı sıra FSC-W (genişlik) ve FSC-H (yükseklik) toplanan emin olun, ikilileri (dışlamak mümkün yani, aynı zamanda dedektör geçen iki olay, ) analizi sonrası veri toplama. Olayların Set sayısı 100,000 ile tahsil edilecek. Tazminat kontrolleri EdinmeVarsa. </li><li> Veri toplama: veri toplama önce numune vorteks kaçının. Bunun yerine hafifçe tüp dokunarak karıştırın. Başlangıçta gating sırasında düşük bir basınçta olay toplamak. Toplam nüfus Kapısı. , Buna göre histogramlarının gerilimler ayarlayın genellikle boyanmamış numunenin tepe ikinci on (10 2) karşılık gelir. Kapılar kurulmuş, ve örnekler işleniyor sonra, basıncı yüksek geçirilebilir. </li><li> Analiz: FSC-W FSC karşı komplo tarafından ikilileri gözünüzde canlandırın. Singletlerini ve ikilileri tanımlayın. Singletlerin üzerinde Kapısı. Mitokondriyal-selektif boya ile pozitif boyandı olaylar kapılayarak mitokondriyal nüfusu seçin. </li><li> Izotop kontrolden plan etiketleme belirleyin. Izotip kontrol örneği kullanarak, Mfn2 antikor için pozitif popülasyon mitokondriyal etiketleme yüzdesini belirlemek. </li></ol>

<ol>
	<li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration.">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li><li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes:+from+animalcules+to+quantum+dots.">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+five+dimensions:+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria.">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li><li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine.">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li><li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission.">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li><li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy.">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li><li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu mitokondri normal fizyoloji ve hastalık hem de kilit oyuncular olduğu giderek açıktır. Imünoblotting, belli bir durumda mitokondri içinde veya mitokondriyal yüzeyinde tüm nüfusun ortalama bu yöntem raporlar bulundu hangi proteinlerdir çıkarabilirler. Bu yöntem mitokondriyal alt popülasyonlarının veya altkümelerin göreceli bolluk hakkında bilgi elde edemez. O olmuştur iken daha önce tüm mitokondri eşit, alan giderek bir hücre içinde bu mitokondri kabulüdür oluşturulan morfolojisi ve / veya...

Mitokondri, yüksek enerji talebinin sitelerine taşınan ve fizyolojik uyaranlara 1 hızla yanıt olan, fizyon ve füzyon birden fazla tur geçmesi son derece dinamik organellerdir. Giderek farklı dokularda olduğu mitokondri kabul edildiğinden, hatta farklı hücre bölmeleri, yeni yöntemler bu farklı mitokondriyal alt kümelerini tanımlamak için gerekli olan, farklı fonksiyonel profilleri var. Mikroskopi bireysel mitokondri görselleştirilebilir sağlayan bir aracı ve bağışıklık 2 ile belirlenebilir veya mitokondrilerde bir proteinin varlığını içerir. Bununla birlikte, bu yöntem ile kantitatif analiz, emek yoğun ve ölümsüzleştirilmiş veya primer hücre çizgileri kullanılarak deneyler için daha uygundur. Dokusundan türetilen bireysel mitokondri çalışması çok daha zordur ve çok yöntem ile aynı zamanda mitokondriyal değerlendirmeleri mevcuttur alt gruplarının kolay tanımlama için izin vermezmitokondriyal fonksiyon 3 tirme. Bu engel, akış sitometrisi ile kemirgen dokulardan izole edildi ve daha sonra analiz mitokondri immunolabel için yeni bir metot gidermek amacıyla geliştirilmiştir. Bu, hızlı bir şekilde saptanması ve mikroskobik inceleme ile karşılaştırıldığında mitokondriyal dış membran, lokalize proteinler ölçülmesini sağlar, daha az emek yoğun ve tek bir numunede bulunan mitokondri binlerce analiz edilmesini sağlar. Bu deney, mitokondri de yapısal olarak mevcut olduğu düşünülmektedir mitokondriyal dış zar proteinlerinin &#39;nin ve nispi miktarını izlemek için uygulanabilir, mitokondriyal yüzeyine proteinler işe ya da patolojik koşulların mitokondrilere mislocalized proteinlerin tespiti. Ayrıca, geleneksel floresan gösterge boyaların kuruluş farklı mitokondriyal mitokondriyal fonksiyonun bazı yönlerinin aynı anda değerlendirilmesini sağlarsubpopülasyonunun.

<table><tbody><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code 400</td><td>Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Kontes Glass Co.&amp;nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Transparent, thin walled&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 rotor and buckets&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Iodixanol, density gradient medium</td></tr><tr><td>Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Must be fatty acid free for mitochondria</td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research&amp;nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>For sample acquisition by flow cytometry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &amp;micro;M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II flow cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Software used for analysis</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td></tr></tbody></table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

Yöntem algılamak ve hayvansal dokular mitokondriyal fizyolojisi ve patofizyolojisi çalışma için hayati olan mitokondriyal dış membran proteini bileşenleri izlemek için. Bu protokol kemirgen dokusundan izole mitokondri immunolabeled ve flow sitometri ile analiz edilir bir yöntem açıklanır. Mitokondri kemirgen omurilik izole edildi ve miyelin, sinir dokusundan hazırlanan mitokondriyal parçaların büyük bir kirletici maddeyi bertaraf edilmesi için hızlı bir zenginleştirme adımına tabi tutulurlar. İzole mitokondri daha sonra tercih edilen bir antikoru ve bir floresan konjuge sekonder antikor ile etiketlenir. Akış sitometrisi ile analiz, algılama ve imüno-işaretli protein miktarının ölçülmesi ile takip mitokondriyal belirli bir boya ile boyanması ile mitokondriyal preparatların saflığı göreli doğrular. Bu teknik, numune başına mitokondri yüzbinlerce analizine izin veren, hızlı ölçülebilir ve yüksek verimli olduğunu. Bu yeni p değerlendirmek için geçerlidirNormal fizyolojik şartlar altında mitokondrial yüzeyinde roteinler gibi patoloji sırasında bu organele mislocalized olabilir proteinleri. Önemli olarak, bu yöntem, alt-popülasyonlarının mitokondriyal bazı etkinlikler rapor floresan göstergesi boyalar ile birleştirilebilir ve merkezi sinir sistemi (beyin ve omurilik) yanı sıra karaciğer, mitokondri için mümkün olduğunu edilebilir.

Sıçan omurilik türetilen mitokondri Mitofusin2 (Mfn2), mitokondri 8 dış membran füzyon rol oynayan bir protein hedefli bir antikor ile imüno edilebilir. Bir Mfn2 spesifik antikor ve bir floresan konjuge sekonder antikor ile izole edilmesini ve ardından etiketleme, mitokondri akış sitometrisi (Şekil 1) tarafından işlenir. Veri toplama sonra, numuneler ilk olarak, bir nokta arsa (Şekil 2A) ilgili toplanan tüm olayları görselleştirerek, analiz yazılımı akı?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria at JoVE.com

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Görüntüleme.  Université de Montréal, CRCHUM.  Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir. 

Video: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Biyokimya

Mitokondriyal Temas Bölgelerinin İzolasyonu

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Yazar Spotlight: Mitokondriyal İletişim Sitelerinin ve Mimari İçgörülerin Ortaya Çıkarılması 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Tıp

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Biyoloji

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, mitochondrial respiratory chain (MRC) complexes, and mitochondrial DNA (mtDNA) copy number often feature in these processes. Human brain organoids derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) recapitulate the brain&#39;s three-dimensional (3D) cytoarchitectural arrangement and offer the possibility to study disease mechanisms and screen new therapeutics in a complex human system. Here, we report a unique flow cytometry-based approach to measure multiple mitochondrial parameters in iPSC-derived cortical organoids. This report details a protocol for generating cortical brain organoids from iPSCs, single-cell dissociation of generated organoids, fixation, staining, and subsequent flow cytometric analysis to assess multiple mitochondrial parameters. Double staining with antibodies against the MRC complex subunit NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) or mitochondrial transcription factor A (TFAM) together with voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC 1) permits assessment of the amount of these proteins per mitochondrion. Since the quantity of TFAM corresponds to the amount of mtDNA, it provides an indirect estimation of the number of mtDNA copies per mitochondrial content. This entire procedure can be completed within a span of 2-3 h. Crucially, it allows for the concurrent quantification of multiple mitochondrial parameters, including both total and specific levels relative to the mitochondrial mass.

This protocol reports a unique method of using a streaming cytometer and multiple antibodies for simultaneous assessment of multiple mitochondrial functional parameters, including changes in mitochondrial volume, amounts of the mitochondrial respiratory chain (MRC) complex subunits, and mitochondrial DNA (mtDNA) replication.

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, ...

Nörobilim

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri