Name: dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

Biz video çekimi için hazırlanıyor ona yardım için ve tekniği göstermek için Amy Chen teşekkür ederim. ENIGMA tarafından yürütülen bu çalışma: Genler ve Moleküler Meclisleri (http://enigma.lbl.gov) ile Ekosistemler ve Ağlar Entegre, Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı Bilimsel Odak Alanı Programı, Bilim, Biyolojik Ofisi Ofisi tarafından desteklenen Sözleşme No: DE-AC02-05CH11231 altında ABD Enerji Bakanlığı Çevre Araştırma,.

Not: Aşağıdaki protokol bakterinin Desulfovibrio vulgaris Hildenborough gelen RR DVU3023 gen hedefleri belirlenmesi için hazırlanmıştır. Bu ilgi çekici başka bir kopyalama düzenleyicisi adapte edilebilir. 1.. Klon ve Purify RR <ol><li> RR geni, D., bilhassa da DVU3023, Clone vulgaris Hildenborough bir Escherichia coli sentezleme vektörü içine gen C-terminal His-etiketli ve ifade bir T7 promoterinin kontrolü altında olacak şekilde seçilir. Not: Birkaç klonlama yöntemleri kullanılabilir ve araştırmacı tarafından belirlenir. Alternatif afinite etiketleri de kullanılabilmektedir. </li><li> Sentezleme E içine inşa Transform E. coli BL21 (DE3) ekspresyon suşu. </li><li> 37 ° C &#39;de ekspresyon suşu BL21 1 L büyümek Mid-log fazında, protein ekspresyonunu başlatmak için 0.5 mM IPTG ekleyin. 24 saat boyunca, oda sıcaklığında büyümesi devam edin. </li><li> 10 mil boyunca 5.000 xg&#39;de Santrifüj hücreleri4 ° C de, n Liziz tamponu içerisinde yeniden süspanse hücreler (20 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol, 1 mg / ml lizozim, 1 x benzonaz nükleaz). 4 ° C&#39;de bir Fransız presi kullanılarak Hücreleri, </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin lisatı 0.45 um&#39;lik bir şırınga filtresi kullanılarak filtre. </li><li> Yıkama tamponu, 10 ml (20 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol) ile bir FPLC alet üzerinde bir 1 ml Ni Sepharose sütun yıkayın. </li><li> Kolon üzerinde lizat yerleştirin. Yıkama tamponu, 20 ml ile kolondan yıkanır. </li><li> % 0-100 elüsyon tamponu gradyanı (20 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) ile Elute DVU3023. </li><li> Bir tuz giderme kolonu üzerinde taşınan fraksiyonların yük ve tuz giderici tampon (20 mM sodyum fosfat pH 7.4, 100 mM NaCl) ile yıkayın. </li><li> Protein konsantre yüksek molekül ağırlıklı bir kesim santrifüj filtre Santrifüj protein örneği. -20 ° C &#39;de% 50 ve saklamak proteine ​​0.1 mM DTT ve gliserol ekleyin Not: Saflaştırma yöntemleri üzerinde çalışma yapılan her protein için ayrı ayrı optimize edilmesi gerekir. </li></ol> 2.. Elektroforetik mobilite kayma deneyiyle (EMSA) kullanarak RR için Gen Hedef belirleme <ol><li> PCR D kullanılarak, aday hedef gen DVU3025 400 bp bölgesi üst akışında yükseltmek vulgaris Hildenborough şablon olarak genomik DNA, ve bir ileri primer ve etiketlenmemiş bir ters 5&#39;-biotin-etiketli primer. Not: Genellikle RR kendi gen / operonunun yukarı bölgeleri bağlamak, ya da proksimale kodlanan genleri düzenleyen olabilir: Aday hedef geni seçmek için ipuçları. RR diğer türlerde ortologlarını varsa, mahallede korunmuş genlerin arayın. Alternatif yöntemler, kendileri sigma54 bağımlıdır RR için regulon tahminler (örn. RegPrecise 5) veya tahmin sigma54 bağımlı promotörler 6 göre tercih aday genleri içerir. </li><li> 400 b kesilmiş, bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünü çalıştırınp boyutlu ürün, ve bir jel ekstraksiyon kiti temizlemek kullanarak DNA arındırmak. </li><li> 10 mM Tris HCI, pH 7.5, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 1 mM DTT,% 25 gliserol ve 1 ug / ml poli dI.dC (non içinde biotinilat edilmiş DNA alt tabakası 100 fmol ile DVU3023 protein (0.5 pmol) karıştırın 20 ul bir toplam hacimde spesifik rakip DNA). Ayrıca, bir kontrol olarak herhangi bir proteini olmayan bir reaksiyon kurmak. 20 dakika için tezgah üzerinde oda sıcaklığında reaksiyonları inkübe edin. </li><li> Not: Bu listede ve diğer reaksiyon bileşenleri, ilgi konusu RR bağlı olarak ilave edilebilir standart koşullardır. Aktivasyon isteniyorsa, reaksiyonun (genellikle RR aktivasyon olmadan in vitro olarak DNA bağlama doyurmaya) 50 mM asetil fosfat ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca 100 V&#39;de 0.5x TBE tampon maddesi içinde bir prekast% poliakrilamid mini 6-0.5x TBE jel ön çalıştırın. G üzerine bağlanma reaksiyonları ve reaksiyon yükü 18 ul 5x yükleme tamponu içinde 5 ul (% 0.1 bromofenol mavisi,% 0.1 iksilen siyanol, 1 x TBE içinde% 30 gliserol) eklemeEl. 2 saat için 100 V çalıştırın. Not: jel çoğunluğu tamponu ile izole edilecek şekilde çalışan tampon ile elektroforez sistemi, dış tampon bölmeyi doldurmak için, protein-DNA kompleksleri ayrılmasına yol açabilir aşırı ısınmasını önlemek için. Alternatif olarak, jel, 4 ° C &#39;de çalıştırılabilir </li><li> Jelin boyutu yüklü bir naylon zar kesim ve en az on dakika süre ile 0.5x TBE içinde ıslatın. Kaset jel çıkarın. Jelin kapalı bir sırtlar kesme ve 0.5x TBE içinde ıslatılmış iki kalın filtre kağıtları arasında jel ve membran sandviç ve yarı-kuru bir lekeleme aparatı içine yerleştirin ve 30 dakika için 20 V çalıştırın. </li><li> Ticari bir UV ışık çapraz bağlayıcı enstrümanın içindeki zarı yerleştirin ve 3 dakika için zaman ayarlayın. Not: Zar, şimdi bir sonraki aşamaya geçmeden önce birkaç gün boyunca, oda sıcaklığında, kuru saklanabilir. </li><li> Bir streptavidin-yaban turpu peroxida kullanan bir ticari olarak temin edilebilir kimyasal parlak saptama kiti kullanınüreticinin talimatlarına uygun olarak leke geliştirmek se eşlenik. </li><li> Görüntü bir bilgisayar kullanarak leke bir CCD donanımlı kamera bağladım ve RR test edilen DNA bağlar olduğunu gösterir RR, varlığında DNA substrat hareketlilik bir değişim arayın. Not: protein-DNA kaymasının spesifikliği, reaksiyonda ortadan kaldırmak ya da görülen değişim azaltmalıdır etiketsiz rakip DNA, bir fazlalığı içerecek şekilde test edilebilir. </li></ol> 3.. Genomik DNA-protein bağlama sonra Hedef Zenginleştirme doğrulayın <ol><li> Genomik DNA-protein bağlanma reaksiyonu <ol><li> Arasında 2 sn boşluk, 1 saniye 9 düşük genlik darbelerle bir mikrotip kullanarak bir 1.5 ml mikrofüj tüpüne (konsantrasyonları 100-200 ng / ml &#39;da) 100 ul genomik DNA sonikasyonu ile 500 bp bir ortalama boyuta kesme genomik DNA Her. Not: borunun kenarlarına DNA splatters, her 3 darbe sonra içerik aşağı spin edin. Kullanılan tam koşullarKullanılan alet sonikatör ile değişecektir. Kesilmiş DNA fragmanları, 100-1000 bp arasında değişebilir, ancak ortalama boyutu 400-600 bp içinde olmalıdır. Çok fazla kesme daha az sağlam bağlanma sitelerinin neden olabilir, ve çok fazla veya çok az kesme ya da alt baş tüm genom amplifikasyonu adımları sırasında kütüphane hazırlanmasını etkileyecektir. </li><li> 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 50 mM KCI, 5 mM MgCl2,% 25 gliserol, ve 50 mM fosfat içinde asetil RR proteinin (DVU3023 0.5 pmol) ile kesilmiş genomik DNA 2-3 ug karıştırın. 30 dakika boyunca 25 ° C &#39;de reaksiyonlar inkübe edin. Giriş DNA olarak 1.5 ml tüp ve etiket oluşturmak için bu tepkimeye transferi 10 ul. Not: Asetil fosfat in vitro protein fosforilasyonu ile aktif hale getirmek için ilave edilir. Fosforilasyon bağlayıcı DNA uyarır, ancak birçok RR, aynı zamanda aktivasyon 7 olmadan in vitro olarak DNA bağlama. Reaksiyona ilave protein miktarı, protein prep aktivitesine bağlıdır. EMSA tercih için kullanılabilecektirBu miktar imize. </li></ol></li><li> Affinity proteine ​​bağlı DNA saflaştırılması <ol><li> Bir 0.6 ml mikrofüj tüpe Ni-NTA agaroz reçinesine 30 ul ekle. Altındaki reçineyi toplamak için, 1 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ve supernatant çıkarın. 100, yıkama tamponu (10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 5 mM MgCI2, 50 mM KCI,% 25 gliserol) içinde ul, fiske tüp karıştırmak ve 2 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ekleyin. Süpernatantı. </li><li> Yıkanan Ni-NTA reçinesine bağlanma reaksiyonunun kalan 90 ul ekleyin ve 30 dakika için bir döner sallayıcı içinde inkübe edilir. </li><li> 2 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant (bağlanmamış DNA) çıkarın. , Yıkama tamponu içinde 100 ul içerikleri karıştırmak için tüp fiske ve 2 dakika boyunca 100 x g &#39;de santrifüj. Süpernatantı. Iki kez daha yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Reçineye elüsyon tampon maddesi 35 ul (20 mM sodyum fosfat tamponu, pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) ilave edilir ve vorteks ile karıştırın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgah üzerinde inkübe. 2 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj. Proteine ​​bağlı DNA bölümü olarak, yeni bir 1.5 ml tüp ve etikete süpernatantı aktarın. </li><li> Ayrıca giriş DNA&#39;ya elüsyon tamponu 35 ul ekle. </li><li> Giriş ve bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak protein-bağlı DNA fraksiyonları arındırın. </li></ol></li><li> Tüm genom giriş ve protein-bağlı DNA örnekleri yükseltmek. <ol><li> PCR tüpleri giriş ve ayrılması için protein-bağlı DNA 10 ul ekle. Parçalanma 10x tampon 1 ul, Kütüphane Preparasyon 2 ul tampon maddesi ve her bir örnek için Kütüphane Stabilizasyon çözeltinin 1 ul ekleyin. Vorteks ile iyice karıştırın. 2 dakika, ve buz üzerinde soğuk boyunca 95 ° C &#39;de bir PCR ısı. Not: DNA başlangıç ​​miktarı amplifikasyon önyargı tanıtan önlemek amacıyla, en az 10 ng olmalıdır. </li><li> Kütüphane Preparasyon enzim 1 ul ekle pipetleme ile karıştırın ve 16 ° C/20 dk &#39;da termal döngüleyici içinde 24 ° C/20 dk, 20 dk, 75 ° C / 5 dk için 37 ° C de inkübe4 ° C de, uzun süreli </li><li> Her bir tüpe, 47.5 ul su, 10x büyütme ana karışımı 7.5 ul ve polimeraz 5 ul ekle. 94 ° C/15 saniye 20 döngü, 65 ° C / 5 dk, ardından 95 ° C / 3 dakika, ve de iyi bir ısı karıştırın. 4 ° C&#39;de tutun reaksiyonlar </li><li> Bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak büyütülmüş DNA numuneleri arındırmak ve DNA konsantrasyonu spektrofotometrik olarak ölçülür. </li></ol></li><li> QPCR kullanılarak protein-bağlı DNA hedef zenginleştirme doğrulama <ol><li> Design QPCR primerler, her serbestçe primer dizayn yazılımı kullanılarak EMSA tarafından doğrulanmış bir hedef genin (DVU3025) akış yukarı bölgesi 200 bp amplifiye etmek. </li><li> Her bir primer seti ile her bir DNA şablon için üçlü QPCR tepkiler kurmak. Her bir primer seti için bir master karışımı hazırlayın. 1x ana karışım 2 x SYBR Green QPCR karışımı 10 ul, 18 ul bir toplam için her bir primerin su ve 0.5 uM içerir. 96 çukurlu bir PCR levha başına ana karışımı kısım 18 ul. </li><li> Zaman dilüe olabilmee yükseltilir ve 5 ng saflaştırılmış giriş ve protein-bağlı DNA numuneleri / su ile ul ve DNA şablon olarak kullanmak. Oyuklara DNA şablonu 2 ul ekle. </li><li> , Ultra net QPCR sızdırmazlık film ile plaka Seal 200 xg / 1 dak bir santrifüj plaka aşağı spin. Bir gerçek zamanlı QPCR makinesine tabak koyun. Döngü ilgili QPCR yazılımı kullanılarak, aşağıdaki gibi: 95 ° C / 1 dakika, ve 95 ° C/10 saniye 40 döngü, 59 ° C/15 saniye, 70 ° C/35 saniye. </li><li> Ayrıca, ilgisiz bir genle (negatif kontrol) yukarı bölgelerini çoğaltmak için primerler ile üç nüsha QPCR tepkileri ayarlamak. </li><li> Giriş DNA bu protein-bağlı DNA&#39;nın C T değeri çıkarılarak ΔC T hesaplayın. 2 ΔC T gibi protein-bağlı DNA, hedef genin kat zenginleştirme hesaplayın. Not: Hedef yukarı bölgesi, giriş DNA vs protein-bağlı DNA&#39;nın in zenginleştirilmiştir, bu bağlanma reaksiyonları ve afinite saflaştırma succ olduğunu göstermektediressful. 4. adıma devam edin. Hedef yukarı akış bölgesinin zenginleştirme gözlenmemiştir ise, proteinin farklı bir miktarı ile bağlanma reaksiyonları (adım 3.1) tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 4. DNA Etiketleme ve Dizi Hibridizasyon <ol><li> Cy5 ile Cy3 ve Zenginleştirilmiş DNA ile Label Input DNA OT: Cy3 ve Cy5 boyalar ışığa duyarlıdır ve bakım minimumda ışık maruz kalmasını sağlamak için alınmalıdır. <ol><li> 40 ul ile karıştırın 1 mg DNA 9-mers Cy3/Cy5-labeled ve su ile 80 ul ses seviyesini ayarlamak. </li><li> Isı (bir PCR), karanlıkta, 10 dakika boyunca 98 ° C&#39;de denatüre. 2 dakika boyunca buz üzerinde hızlı soğuk. </li><li> Iyice karıştırın, her bir reaksiyon için, 5 mM dNTPs ve 8 ul su, ve (karanlıkta, 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe - 2 ul Klenow polimeraz (50.000 U / ml 3&#39;-5&#39;-ekzo) ekleme a PCR). </li><li> 0.5 M. reaksiyonu ve NaCl çözeltisi durdurmak için 50 mM EDTA ekleyin </li><li> 1.5 ml tüpler devam transfer örnekleri10 dakika için 12,000 xg&#39;de 0.9 izopropanol hacmi, 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir ve santrifüj Aining. Topak Cy5-etiketli DNA için Cy3-etiketli DNA ve mavi için pembe olmalıdır. </li><li> 2 dakika için 12,000 xg&#39;de% 80 etanol (500 ul) ve santrifüj ile pelet yıkayın. Karanlıkta 5-10 dakika boyunca hava kuru peletler. Not: granüller, -20 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> 25 ul su içinde süspanse edin pelet. Spektrofotometrik DNA konsantrasyonu ölçün. </li><li> Havuz birlikte 6 ug karanlıkta düşük ateşte bir santrifüj içinde bir 1.5 ml tüp ve vakum kuru olarak Cy3 ve Cy5-etiketli DNA (bu saydam ise, santrifüj kapağını kapak) her biri. Not: Topaklar hibridizasyon için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Mikrodizi hibridizasyon <ol><li> C kullanmak ve 42 ° sıcaklığını ayarlamak için önce 3-4 saat üzerinde melezleme Sistemi açın </li><li> 1x çözelti, 11.8 ul 2x Hybridi içeren bir hibridizasyon solüsyonu ana karışımı hazırlayınyon tamponu, 4.7 ul hibridizasyon Bileşen A ve 0.5 ul hizalama oligo. </li><li> 5 ul su içinde yeniden süspanse pelet. Örnek bu karışımı 13 ul ekle. 15 saniye vorteksleyin, 5 dakika boyunca, kuru banyosu içinde 95 ° C de inkübe edilir. Yükleme için hazır olana kadar, hibridizasyon sisteminde 42 ° C &#39;de örnekleri tutun. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak, mikrodizi kızaklı karıştırıcı düzeneği hazırlayın. </li><li> Hibridizasyon sistemi içinde karıştırıcı kaymalı düzeneğini. Doldurma portuna yük örnek 16 ul, bir yapıştırıcı film ile bağlantı noktaları mühür sistemde yapılan karıştırma açmak ve 42 ° C&#39;de 16-20 saat boyunca hibridize </li><li> Su içinde 10x ticari olarak temin edilebilen tamponlar seyreltilerek 1x yıkama tamponları I (250 mi), II (50 mi) ve III (50 mi) Hazırlama ve her 1 mM DTT ekleyin. Sıcak Tampon Ben 42 ° C. </li><li> , Sıcak Tampon I. Peel kapalı karıştırıcı içeren bir çanak içinde bir sökme aracı haline mikser-slayt, yer ve slayt şiddetle sh iseelle sökme aracı aking. </li><li> Yıkama tamponu I, 50 ml ile bir kap içine koyun ve slayt el ile 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> Aktarım 50 ml yıkama tamponu II ile ikinci bir kaba slayt ve elle 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> Aktarım 50 ml yıkama tamponu III ile üçüncü bir kap içine kayar, ve el ile 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> Çabuk bir kağıt havlu üzerine slayt kenarlarını kurulayın ve bir slayt rafa yerleştirin. Slayt kuruması 2 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. , Slayt halinde içinde yerleştirin folyo ile sarın ve bir desikatörde saklayın. </li></ol></li><li> Array taranıyor <ol><li> Cihazın talimatlarına uygun mikrodizi tarayıcı içindeki slayt yerleştirin. </li><li> 532 nm = Cy3 ve 635 nm = Cy5&#39;in olarak dalga boylarını ayarlamak için bir tarayıcı yazılımı kullanın ve 350 ile 400 arasında ilk photomultiplier kazanır. </li><li> Slaytta dizisini bulmak için slayt önizleme. Tarama için dizi bölgeyi seçin. </li&gt; <li> Dizi Tarama ve dizi özellikleri çoğunlukla sarı olduğu photomultiplier ayarları gibi ayarlayın. Histogram kırmızı ve yeşil üst üste eğrileri ya da mümkün olduğunca birbirine yakın olarak göstermelidir. Eğrileri doymuşluktaki 10 -5 normalize sayıları yukarıda bitmeli. </li><li> Ayrı ayrı hem de 532 ve 635 nm görüntüleri kaydedin. </li></ol></li><li> Array Veri Analizi <ol><li> Bir dizi analiz yazılımı içine görüntüleri aktarmak. Yazılımı kullanılarak, (Cy3 ve Cy5 görüntüler için) Her dizi için iki çift raporları (. Çifti) oluşturun. Çift dosyaları kullanarak ölçekli log 2 oranı dosyaları oluşturun. 500 bp kayan bir pencere kullanarak zirveleri aramak için oturum 2 oranı dosyaları kullanın. Gen hedeflerin yukan bölgelerine zirve lokuslar haritada. </li><li> Pozitif hedef (EMSA kullanılarak belirlenir ve bu örnekte qPCR, DVU3025 tarafından teyit) üst doruklarına içinde görünür olmadığını kontrol edin. Not: pozitif hedef üst isabet arasında değilse, bunun mümkün olduğunu consi altında RRvergi oranlarını düşürmek birkaç gen hedefleri olan ve DAP-fiş çoğaltmak yapılabilir ve tekrarlanmış için ortak bir tepe noktaları hedef listesi oluşturmak için de kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 5.. Binding Site Motif Tahmin ve Doğrulama <ol><li> DAP-çip analizi ile oluşturulan gibi üst gen hedefleri için yukarı bölgelerinde (400 bp) için dizileri almak. Motifleri tahmin Online (meme.nbcr.net) Mikroplar ile bu dizilere mem uygulayın. Not: sigma54 bağımlı düzenleyicileri olarak Enhancer bağlanma proteinleri başlangıç ​​sitesinin yukarı birkaç yüz baz çifti bağlanabilir. Diğer transkripsiyonel düzenleyici için, bu gibi bir 200 bp kısa bir bölgenin üst yeterli olacaktır. </li><li> Tasarım ve üst ucunda ya da üzerinde 10 bazlar ile çevrili öngörülen bağlanma yerinin motifi içeren alt sicim DNA oligomerleri. Biyotinilat top iplikçik 5 &#39;sipariş. </li><li> 10 mM Tris HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl in 1:1.5 oranında üst ve alt kordon oligos karıştırınPCR tüplerine 20 ul toplam reaksiyon hacmi. Isı 25 ° C&#39;ye kadar yavaş soğutma ve ardından bir termal döngüleyici içinde 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;ye kadar On misli seyreltilir ve EMSA için vahşi tipli dsDNA alt-tabaka olarak kullanmak. </li><li> , Yukarıdaki ile aynı adımları kullanarak değiştirilmiş alt tabakalar hazırlanır, ancak tasarım oligomerler bağlanma motifinin korunmuş tabanlarında 4-6 ikameleri taşımak için. </li><li> RR ve vahşi tip ya da değiştirilmiş substratlar ile bağlama reaksiyonları kurmak ve aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi EMSA ile incelemek. </li><li> Not: RR alt-tabakanın, ancak, yabani tip olmayan değiştirilmiş bir bağlar durumunda tahmin motif doğrulanır. </li></ol> İlgili Diğer Bakteriyel Türlerin Motif 6.. Korunması <ol><li> DVU3023 arasında ortologlarını içeren ilgi genomalara seçin. NCBI sitesinden genomları için dizi ve açıklama dosyası edinin. </li><li> Bir Poz oluşturmak için DAP-çip hedeflerinden motif dizileri kullanacak komut yazmak için Perl gibi bir programlama dili kullanınTV&#39;nizi yerleştirmeden ağırlıklı matris ve diğer sıralı genomları mevcut benzer motifler puan matris kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RegPrecise+web+services+interface:+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics.">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li><li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+sigma(N)-dependent+promoters+in+bacterial+genomes.">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li><li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium.">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99 (2011).</li><li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WebLogo:+a+sequence+logo+generator.">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li><li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts.">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li><li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Burada açıklanan DAP çipli bir yöntemi başarılı bir şekilde temsil eden bir sonucu olarak burada gösterilen bir Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 birkaç RR için gen hedef belirlemek için kullanılmıştır. RR DVU3023 için, bir aday gen hedef seçerek kolay oldu. DVU3025 RR geninin hemen alt baş tarafında bulunur, ve RR ve hedef genlerin çeşitli Desulfovibrio türlerinde muhafaza edilir, ve buna ek olarak DVU3025 öngörülen sigma54 bağımlı promoteri bulunmaktadır....

Hayatta kalmak ve gelişmek için bakterilerin yetenek ki algılarlar ve kendi ortamlarında tedirginlikler cevap verebilecek kadar iyi kritik bir şekilde bağlıdır, ve bu da onların sinyal iletimi sistemlerine bağlıdır. Sinyalizasyon sistemleri bir bakteri kodlar sayısı onun &quot;mikrobiyal IQ&quot; adı olmuştur ve çevresinin değişkenliği ve çoklu sinyallerini algılayan kabiliyeti ve ince ayar onun tepki 1 hem de bir göstergesi olabilir. İki bileşenli sinyal iletim sistemleri (ASR) bakteriler tarafından kullanılan en yaygın sinyal sistemleri de vardır ve bunlar, harici sinyali algılar ve bir efektör yanıt düzenleyici (RR) 2 fosforilasyon yoluyla ileten bir histidin kinaz (HK) oluşur. RR bir çıkış alanlarının çeşitliliği ve böylece farklı efektör modları olabilir, ancak en yaygın tepki alanı 1 bağlayıcı bir DNA aracılığıyla transkripsiyon düzenlemedir. Algılanan sinyaller ve vaz ilgili fonksiyonlarıntestis kanseri yaşayanlarının t çoğunluğu hala bilinmiyor. Böyle chip yonga gibi in vivo yöntemler rutin olarak transkripsiyon faktörleri 3 genomik bağlanma sitelerinin belirlenmesi için kullanılır, ancak aktive etme koşulları veya sinyaller bilinmektedir, bunlar sadece bakteriyel iki bileşenli sistem RR için kullanılabilir. Genellikle bir TCS etkinleştirmek çevre ipuçları kendi gen hedefleri belirlemek daha zordur. In vitro mikro-dayalı tahlil, burada açıklanan etkili ve hızlı bir şekilde gen hedefleri tespit etmek ve testis kanseri yaşayanlarının fonksiyonları tahmin etmek için de kullanılabilir. Bu deney, RR fosforile ve bu nedenle asetil fosfat gibi 4 küçük molekül vericiler kullanılarak in vitro aktive edilebilir gerçeğinden yararlanır. Bu yöntemde, DNA-afiniteyle saflaştırılmış yonga (Şekil 1) için DAP-chip adlı, ilgi konusu gen RR E&#39;de bir His-tag ile klonlanır coli ve daha sonra saf hale etiketli protein bi bırakılırnd kesilmiş genomik DNA için. Protein-bağlı DNA, daha sonra afinite saflaştırma ile zenginleştirilmiştir, zenginleştirilmiş ve giriş DNA çoğaltılır, floresan bir araya toplanmış ve özel ilgilenilen organizmadan (Şekil 1) için yapılan bir fayans dizisine hibridize etiketli. Mikrodizi deneyler eserler tabidir ve bu nedenle ek adımlar tahlili optimize etmek için kullanılır. Böyle bir adım (Şekil 2 iş akışını bakınız) elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) kullanarak çalışma kapsamında RR için bir hedef belirlemek için teşebbüs etmektir. Sonra, genomik DNA ve DAP adımları bağlanma ardından, protein-bağlı olduğu ve bu nedenle giriş DNA için uygun bağlama koşulları teyit pozitif hedef giriş fraksiyonuna göre protein-bağlı fraksiyon içinde zenginleştirilmiş olup olmadığını görmek için qPCR incelenir RR (Şekil 2). Dizi Hibritlemeden sonra, veri genomik lokus gösteren yüksek yoğunluğu sinyalinin tepe noktaları bulmak için analiz edilmektedir burada protein hreklam bağlı. Fonksiyonlar elde gen hedeflere göre RR için tahmin edilebilir. Hedef genomik loci sonra deneysel EMSA (Şekil 2) kullanılarak doğrulanır bağlanma sitesi motifleri, tahmin etmek için kullanılır. RR için fonksiyonel tahminler ve gen hedefleri sonra yakından benzer bağlama motifleri için olanlar genomları (Şekil 2) tarayarak orthologous RR&#39;lerle kodlamak ilgili türlerinde uzatılabilir. DAP-çip yöntemi daha önce yok oldu, bir TCS için bilgi hazinesi sağlayabilir. Yöntem, aynı zamanda, protein saflaştırılabilir ve DNA bağlanma şartları tespit edilebilir, herhangi bir kopyalama düzenleyicisi için kullanılır ve bir genom sekansı ile çıkar organizma için uygun olabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. DNA-afiniteyle saflaştırılmış yonga (DAP-chip) stratejisi 7. Ilgilenilen organizmadan RR geni, bir E bir karboksi-terminal His-tag ile klonlanır Coli suşu. Saflaştırılmış His-etiketli protein asetil fosfat ile birlikte fosforilasyon ile aktive edilir ve kesilmiş genomik DNA ile karıştırılır. Geri kalanı Ni-NTA reçinesi kullanılarak afinite saflaştırma işlemine tabi tutulur ise, bağlama reaksiyonunun bir alikosu, giriş DNA olarak kaydedilir. Giriş ve RR-bağlı DNA büyütülmüş bütün genom, ve sırasıyla Cy3 ve Cy5 etiketli. Etiketlenmiş DNA bir araya toplanmış ve daha sonra gen hedeflerini belirlemek için analiz edilir bir döşeme tadını hibridize edilir. Şekil değiştirilmiş ve Creative Commons License 7&#39;den kullanılarak yeniden basıldı. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Iş akışı Şekil 2.. Özeti. Herhangi arıtılmış etiketlendi Protei içinn Emsa kullanarak bir hedef belirleyerek başlar. (WGA) ile zenginleştirilmiş ve giriş amplifiye DNA, genomik DNA ve DNA afiniteli saflaşır (DAP) ve tam genom bağlamak için protein izin verin. Bir gen hedef biliniyorsa, bilinen bir hedef proteine ​​bağlı fraksiyonunda zenginleştirilmiş olmasını sağlamak için qPCR kullanın. Hiçbir hedef belirlenebilir olsaydı, DNA etiketleme ve dizi melezleme doğrudan geçin. QPCR zenginleştirme gözlenen olamazdı, o bağlayıcı protein-gDNA ve farklı protein miktarları kullanılarak DAP-WGA adımları tekrarlayın. Zirveleri bulmak ve genlerin hedef bunları eşleştirmek için dizi analizi kullanın. Bağlanma yeri motifleri tahmin etmek için, hedef genlerin yukarı bölgelerini kullanarak. Deneysel EMSA kullanarak motifleri doğrulayın. Çalışma altında RR ortologları kodlayan, ilgili türlerin genom taraması için motifi kullanarak ve aynı zamanda bu türlerin hedef genleri tahmin. Elde edilen gen hedeflere bağlı olarak, RR ve ortologlar fizyolojik işlevi tahmin edilebilir. Şekil değiştirilmiş ve yaratıcı c kullanarak yeniden basıldıommons 7&#39;den lisans.

<table><tbody><tr><td>HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (FPLC instrument)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalting column</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel extraction kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>Alternately, you can pour your own gel.</td></tr><tr><td>Nylon membrane</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker Model XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose resin</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td><td>For quantitation of DNA</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td></tr><tr><td>PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96-well clear low profile PCR microplate</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>Any real time PCR system may be used</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>Any PCR clean up kit may be used</td></tr><tr><td>Cy3/Cy5-labeled nonamers</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3&#039;-5&#039; exo&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization system</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used.</td></tr><tr><td>Custom printed microarrays and mixers</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A microarray scanner</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>This model has been replaced by superior ones</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro microarray software</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

Böyle chip çip gibi in vivo yöntemlerde transkripsiyon faktörleri için küresel gen hedefleri tespit etmek için kullanılan iyi bilinen tekniklerdir. Bununla birlikte, aktivasyon koşulları karakterize edilmemiş bakteriyel, iki bileşenli düzenleyici bir sistem keşfetmek kısıtlı kullanımı vardır. Benzersiz sinyallerin varlığında kullanıldığı zaman bu tür sistemler sadece transkripsiyonunu düzenler. Bu sinyaller genellikle bilinmediği için, bu video makalede tarif edilen in vitro mikro-dizi göre yöntem gen hedefleri ve tepki düzenleyicileri için birleştirme bölgelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu DNA-afiniteyle saflaştırılmış yongalı yöntem Sıralı bir genomu olan, herhangi bir organizmanın herhangi bir saflaştırılmış kontrolü için kullanılabilmektedir. Protokol arıtıldı etiketli protein özel bir fayans dizisine DNA&#39;nın melezleşme ve floresan etiketleme ve ardından protein-bağlı DNA, kesilmiş genomik DNA&#39;ya bağlanan ve daha sonra afinite saflaştırılması için izin içerir. Öz dirençli için tahlil optimize etmek için kullanılabilir olan adımlarıc düzenleyiciler de tarif edilmektedir. Dizi veri analizi ile üretilmiştir Tepeler daha sonra, deneysel olarak doğrulanmış bağlanma yeri motifleri, tahmin etmek için kullanılır. Motif tahminler daha yakından ilgili türlerinde ortolog yanıt düzenleyici gen hedeflerini belirlemek için kullanılabilir. Böylece, bu genin tespiti ve hedef sitesi motifleri bağlanması ve bu nedenle, çevresel bir bakteri Desulfovibrio vulgaris Hildenborough bir sigma54 bağımlı tepki regülatör DVU3023 fonksiyonunu tahmin bu yöntemin uygulanabilirliğini göstermektedir.

Yukarıdaki yöntem Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 bakteri indirgeme modeli sülfat RR küresel gen hedeflerini belirlemek için uygulanmıştır. Bu organizma algılar ve tepki olası sinyallerin çeşitli belirten üzerinde 70 RR tarafından temsil testis kanseri yaşayanlarının büyük bir numarası vardır. In vivo bu sinyalizasyon sistemlerinin fonksiyonları üzerine analizleri kendi sinyallerine beri gerçekleştirmek zor ve böylece aktive koşulları bilinmemektedir. Burad...

Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

16.7K Görüntüleme.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır. 

Video: DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Kanser Araştırmaları

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Genetik

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Biyomühendislik

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Biyokimya

<meta charset="utf8"></head><body>Diskrimatif RNA ve DNA Analizi için Hassas DNA Nanomakineleri

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: DNA Nanosensörlerindeki Gelişmeler - Moleküler Algılamada Hassasiyet ve Seçicilik Zorluklarının Ele Alınması

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Kromatin İmmünenasyon ve Yüksek İş Kelejisi Kullanarak Salmonella Biyofilmde CsgD Düzenleyici Hedeflerin Keşfedilmesi (ChIP-seq)

Dijital Çizgi-kodlama Platform'u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler