Biz Astrosit kültürlerin cömert temini için Dr Stephen Robinson ve Ms Hanya Czerwińska (Monash Üniversitesi) müteşekkiriz.

1.. Kültür Hücreleri Hücre içi askorbat belirleyin <ol><li> Hücre kültürü ve hasat <ol><li> Standart kültür prosedürler 19-21,32,38 kullanılarak süspansiyon (örneğin insan eritrolösemi, K562) veya yapışık hücreleri (primer astrositlere) büyür. Not: hücreler, askorbat içeren askorbat ya da askorbat veya DHA ile 33,39 gibi kültür hücreleri yük sağlamak. </li></ol></li><li> Bir askorbat içeren hücresel özü oluşturun <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanmış ve süspansiyon buz gibi soğuk hücre Permeabilization Tamponu [CPB 450 ul ile yapışan hücreler bir uygun sayıda inkübe et; PBS içinde% 0.1 (ağ / hac) bir saponin; 4 ° C]. Not: deneysel olarak son kullanıcı tarafından (aşağıya bakınız) deneyinin lineer aralığında bir absorbans değeri elde etmek için gerekli olan hücre sayısını belirler. Not: doku ekstreleri de (daha fazla bilgi için Tartışma) kullanılabilir. </li><li> Agita10 dakika boyunca buz üzerinde te ayrıntılı hücreleri hücre liziz sağlamak. </li><li> Soğutulmuş bir mikrosantrifüj (4 ° C) 5 dakika için 16,000 x g&#39;de ham lizat santrifüj ile hücre artıklarının çıkarılması ile berraklaştırılmış askorbat ihtiva eden hücre içi özü oluşturun. </li><li> Her bir numune dikkatli bir şekilde 4 x 100 ul alikotları kaldırmak ve tek ya da 25 ul / oyuk 45.5 U PBS (&quot;AO-&quot;), 25 ul / ya da ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek / ml PBS (&quot;+ AO&quot;) L-askorbat oksidaz-(AO) stok çözeltisi. Not: Bu (aşağıya bakınız) standartlarının hazırlanması paralel olarak yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Askorbat standart eğri yapı (her bir deney için yeniden inşa edilmesi gerekir) <ol><li> Buz soğukluğunda PBS içinde 10 mM askorbik asit, bir stok çözelti hazırlayın. Not: spektrofotometrik olarak 1 olan bir kuartz küvet kullanılarak askorbatın konsantrasyonu doğrulama265 nm&#39;de (yok olma katsayısı = 14.5 mM -1 cm-1) 40 cm yol uzunluğu. </li><li> Dikkatle 0 ve 20 mcM arasında askorbat standartların bir dizi hazırlamak. </li><li> Adım 1.2.4 paralel olarak, dikkatli bir şekilde, her bir standart 4 x 100 ul alikotları çıkarın ve PBS (&quot;AO-&quot;) ya da 25 ul / yuva ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek PBS AO (&quot;+ AO&quot;) 45.5 U / ml stok solüsyonu. Not: Yukarıdaki askorbat standartların 100 ul askorbat 0-2 nmol içerir. Lütfen dikkat, AO amacı azalma ferricyanide olmayan askorbat redüktantların katkı için kontrol etmektir. </li></ol></li><li> Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 1: seçici askorbat kaldırmak ve kantitatif ferrisiyanit ile askorbat okside <ol><li> Orbital folyo ile plaka kaplama ile karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 550 rpm&#39;de 96 oyuklu plaka karıştırın. Not: Tüvey DHA&#39;ya &quot;+ AO&quot; kuyularda tüm askorbat okside gerekir. &quot;-AO&quot; kuyuları etkilenmemiş olmalıdır. </li><li> Tüm oyuklara PBS içinde (burada &quot;ferrisiyanür&quot; olarak anılacaktır) 3.5 mM potasyum ferrisiyanür 50 ul ekle. Nihai [ferrisiyanür] = 1 mM. Not: a multipipettor kullanın. </li><li> Orbital karanlıkta başka bir 5 dakika için oda sıcaklığında 550 rpm plaka karıştırın. Not: Bu adım okside askorbat 1 molekülü başına azaltılmış ferrisiyanit 2 molekülünün bir birleşme oranında askorbat ile ferrosiyanür için ferrisiyanür azalmaya neden olmalıdır. </li><li> Hemen% 50 (v / v) asetik asit ve% 30 (a / h) trikloroasetik asit (TCA) ihtiva eden bir yeni inşa çözeltisi 25 ul ekle. Not: a multipipettor kullanın. </li></ol></li><li> Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 2: quantitate Ferrosiyanat miktarı 37 oluşmuş <ol><li> E ferrosiyanür belirlenmesi çözüm 37 100 ul ekleyiniyi ach. Not: bir çalışma çözeltisi kullanımdan hemen önce yapılmalıdır: 3 M Na-asetat (pH 6.0) içinde 2 ml; Buzlu asetik asit (~ 17.4 M asetik asit), 0.5 mi; 0.2 M sitrik asit ve 2 mi; 0.1 M asetik asit içinde 3.3 mM FeCl3 2 mi; 30 mM ferene-S 1 ml. Bu çalışma çözeltinin son hacmi 7.5 ml olmalıdır. </li><li> Orbital oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 550 rpm&#39;de karanlıkta plaka karıştırın. </li><li> 593 nm&#39;de kuyuların absorbans değerleri oku (örneğin Fe (II) (ferene-S) 3 kompleksin absorbans maksimum). </li><li> (Adım 1.3 &#39;her bir örnek için -&#39; AO &#39;kuyuları ve daha sonra askorbat standart eğriden interpolating ilk olarak karşılık gelen&#39; + AO &#39;kuyular için bir 593 nm değerleri çıkarılarak milyon hücre başına nmol askorbat gibi hücre içi askorbat miktarını hesaplayın .) Standart eğri oluştururken, ascorb miktarına karşı her bir standart için, bu &quot;fark değeri&quot; arsaOyuk başına yedi. </li></ol></li></ol> Kültür Hücreler Askorbat efflux-2. Belirlenmesi <ol><li> Hücre kültürü ve hasat <ol><li> (Adım 1.1) yukarıdaki gibi süspansiyon veya yapışık hücreleri büyümek. Not: En iyi sonuçlar için süspansiyon ve yapışık hücreleri ile 24-iyi bir plat formatında aşağıda tahlil yürütmek. </li><li> Süspanse süspansiyon hücreleri ya da ya da, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın, önceden ısıtılmış HEPES tamponlu salin çözeltisi 400 ul, yapışkan hücreler kaplamak ve 5 mM D-glukoz içeren, kuyularda (HBS / D, pH 7.3, 37 ° C) Bir 24-yuvalı plaka. Incelenecek her bir 24-çukurlu plaka üzerinde belirli bir hücre içermeyen çukurlara HBS / D aynı hacim. Not: ikinci (aşağıya bakınız) temel reaksiyon için hücre içermeyen kontroller olarak hizmet edecektir. </li></ol></li></ol> 3.. Çıkış Askorbat miktarı belirleyin <ol><li> Aşağıdaki stok çözeltileri önceden hazırlıklı olmalıdır: 120U / ml AO HBS / D (taze hazırlandı); 2.4 mM Ferene-S HBS / D; 120 uM FeCl3 ve HBS / D (daha fazla konsantre stok çözümleri hemen hazırlamak) 600 mcM Na-sitrat. </li><li> Ferrireduction reaksiyonu (her son hacim 600 ul olmalıdır) başlatmak için, daha önce HBS / D 400 ul ihtiva eden tek tek oyuklara reaktiflerin aşağıdaki miktarlar ekleyin: <ol><li> , Üç kopya halinde kuyu eşleştirilmiş için AO (120 U / ml) ya da HBS / D 50 ul ekle. Nihai AO konsantrasyon 10 U / ml olmalıdır. Not: Etiket olarak kuyu eşleştirilmiş &quot;- AO&quot; ve &quot;+ AO&quot;. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca hafif bir orbital karıştırma ile plakaları karıştırın </li><li> Tüm oyuklara 2.4 mM ferene-S 50 ul ekle. Nihai ferene-S konsantrasyonu, 200 uM olmalıdır. 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, yukarıdaki gibi plakaları karıştırın </li><li> Taze hazırlanmış 120 uM ferrik sitrat 50 ul ekle. Nihai demir ve sitrat konsantrasyonları 10 mcM demir ve 50 mM sitrat olmalıdır. İyice karıştırın. </li></ol&gt; </li><li> Üç üçlü kontrol kaplan olarak, üstte uzanan orta aspire ve% 0.1 saponin içeren 600 ul HBS / D ekleyin. Not: Bu (aşağıya bakınız) paralel olarak yapılacak bir laktat dehidrojenaz (LDH) salım deneyi için &quot;% 100 hücre liziz&quot; kontrol grubu olarak hizmet edecektir. </li><li> 37 ° C&#39;de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe </li><li> Askorbat-akış deneyinde sonunda, hızlı bir şekilde her bir oyuğa 500 ul aspire ve uygun bir şekilde, bir 24-çukurlu plaka gözenekleri içinde etiketli ekleyin. Not: süspansiyon hücreleri için, ilk olarak 4 ° C&#39;de santrifüj ile Hücreleri çıkarmak </li><li> 96 oyuklu bir plakaya süpernatan 300 ul hacimde ilave edin ve daha sonra 593 nm&#39;de okundu. </li></ol> Hücre dışı Askorbat 4. Belirlenmesi <ol><li> 593 nm&#39;de kuyuların absorbans değerleri okuyun. </li><li> Hücre içi askorbat tayini için tarif edildiği gibi mg protein başına (ya da milyon hücre başına) nmol askorbat gibi hücre dışı askorbat miktarını hesaplayınAdım 1.5.4 &#39;te. Not: askorbat serbest hücre içi askorbat ile sınırlı değildir, böylece son kullanıcının koşullarını optimize etmek gerekir. </li></ol> LDH Release 5. Belirlenmesi <ol><li> Her bir numunenin hücre dışı çözeltinin geri kalan 200 ul hücre liziz boyutunu belirlemek için bir LDH salma tahlili 32,41 yaparlar. Not: toplam salınabilir LDH% olarak hesaplamak. % 0.1 saponin ile muamele edilmiştir örneklerinden ayrılabilir LDH belirler. </li></ol>

<ol>
	<li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albert+Szent-Gy&#246;rgyi:+vitamin+C+identification.">Albert Szent-Gy&#246;rgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li><li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin.">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li><li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+(factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2)+on+ascorbate+and+other+reducing+agents.">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li><li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells.">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li><li>Asard, H., et al., Banerjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Redox Biochemistry. , 22-37 (2007).</li><li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+vascular+bed:+Importance+of+vitamin.">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid.">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li><li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals.">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li><li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans.">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase,+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man.">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li><li>Challem, J. J., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses,+ascorbate,+mutations,+in+the+evolution+of+Homo+sapiens.">Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens.</a> Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase,+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis.">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li><li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. i. t. a. m. i. n. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=recycling+and+degradation+in+mammals.">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes.">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li><li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vitamin+C+transport.">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li><li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants:+lipid+peroxidation,+a-tocopherol,+and+ascorbate.">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li><li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane.">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li><li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism.">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells).">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes:+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+(DMT1)+plus+an+independent+route+for+ferric+iron.">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li><li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism.">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li><li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease:+uptake,+storage,+transport,+and+molecular+mechanisms+of+action.">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+in+the+brain.">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li><li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+function+in+the+brain:+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2.">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li><li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vitamin+as+neuromodulator:+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission.">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li><li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+view+at+C.">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li><li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid:+Chemistry,+biology+and+the+treatment+of+cancer.">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li><li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes.">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells:+response+to+glutamate+toxicity.">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain.">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutamate+aspartate+transporter+(GLAST)+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes.">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux.">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li><li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume-sensitive+organic+osmolyte/anion+channels+in+cancer:+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies.">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li><li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids.">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li><li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader.">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation.">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Na+/H++exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane.">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li><li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate.">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li><li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances.">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li><li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay.">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors.">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li><li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes.">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li><li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol.">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li><li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide.">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, kültürlenmiş hücrelerde hücre içi ve hücre dışı bölmelerden türetilen askorbat tayini için iki hızlı, spesifik ve nispeten hassas mikro kolorimetrik tahlilleri mevcut. Tahliller, standart laboratuar ekipmanları ve reaktifler erişim tamamlanabilir. Deney için gerekli olan sadece orta derecede pahalı reaktif L-askorbat doğru analit özgüllük yüksek derecede kazandırmaktadır olarak önemlidir AO vardır. Tahliller, ya da süspansiyon hücreleri (örne?...

1928 1934 1 yayımlanan gazetelerde askorbik asit (C vitamini), ve uzun aranan Albert Szent-Györgyi tarafından &quot;anti-iskorbüt hastalığı faktörü&quot;, ve diğerleri olarak kimlik kimyasal doğanın keşfi tarihinin önemli olaylar vardı biyokimyası. Nitekim, bu keşifler, Szent-Györgyi 1937 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandıktan. Hayvan ve bitki fizyolojisi askorbat rolleri giderek genişleyen paketi, yanı sıra insan sağlığını katkıda aktif bilimsel konular olmaya devam soruşturma ve tartışma. L-askorbat bol miktarda fizyolojik bir indirgeme ürünü olan ve memeli sistemlerde enzim kofaktörü ve kollajen hidroksilasyon, karnitin ve norepinefrin biyosentezinin, tirosin metabolizma ve peptid hormonu amidasyonu 2 içeren çok iyi tanımlanmış bir enzimatik reaksiyonlar katkıda bulunur. Intriguingly, montaj evidence askorbat gibi hidroksilasyon ile ilgili prolil ve asparaginil hidroksilazları gibi diğer demir bağımlı dioxygenases, uyarıcı ve hipoksiyayla tetiklenebilen faktörleri (HIFs) 1α ve 3 2α hedeflenmesine bir rol oynadığını göstermektedir. Yeni bir rapor, askorbat, nükleer hidroksilazları, Jumonji C (JmjC) etki proteinlerinin teşvik etmedeki aktivitesi ile kromatin demetilasyonunu etki yoluyla T-hücresi olgunlaşmasında bir rol oynadığını göstermektedir; son olarak adı geçen tam aktivitesi 4 askorbat için gerekli gibi görünmektedir. Gerçekten de, askorbat ve bu tür enzimlerin uyarılması HIF ve kollajen hidroksilazları ve askorbat ile uyarılmaya benzer bir mekanizma ile meydana geldiği görülmüştür. Diğer klasik etkileri arasında, askorbat, suda çözünür zincir açan kök sürükleyici 5 gibi hücresel antioksidasyon ve plazma membranının geri dönüşüm önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır α-tokoferol w, 6 α-tokoferoksil radikalin indirgenmesi ile (vitamin E)hich membran lipid peroksidasyonu 7 karşı korunması önemlidir. En memeliler D-glikozdan, askorbat de novo hepatik sentezinin sahip olmasına rağmen Önemli bir şekilde, yüksek primatlar, kobay ve bazı bitler vitamin 8 besin kaynağa bağlıdır. Bu gulo geninin inaktivasyonu nedeniyle, etkilenmemiş memelilerde en orthologues 9-13 oksidaz enzim,-γ-lakton gulono kodlar. Bu enzim, glukoz 13 ila askorbat biyosentezindeki son reaksiyon için gereklidir. Insanlarda bağırsak lümeninden taşıyıcı aracılı emme sonra, askorbat olarak dolaşım sistemiyle vücutta dağıtılır. Vitamin tipik haliyle (konsantrasyonlar tipik olarak geçerli olan plazma konsantrasyonu ile benzer olan eritrositlerin istisna ile) hücre milimolar konsantrasyonlarda mikromolar ve konsantre onun indirgenmiş formu bulunursaEn çok hücre dışı akışkanlar içinde 14,15 entrations (örneğin, 50-200 uM). Fizyolojik koşullar altında, genellikle askorbat askorbil serbest radikali tersine çevrilebilir bir elektron oksitlenme geçirmektedir (AFR, aynı zamanda ya da monodehydroascorbate semidehydroascorbate olarak da bilinir). AFR geri askorbat için hızla bir elektron enzimatik azalma yokluğunda, nispeten kararlı bir radikal 16 iken, iki AFRS bir askorbat ve bir dehydroascorbate (DHA) 9,13,17 için dismutate daha fazla olabilir. Hücresinin iç içinde, askorbat, DHA iki elektron oksidasyon ürünü, hızlı bir şekilde ve glutation-NAD (P) H-bağımlı enzimatik ve enzimatik olmayan reaksiyonları 13 geri askorbat indirgenebilir. Bu klasik demir metabolizması askorbat tek önemli rolü olmayan heme demir 18 diyet emilimini teşvik etmek olduğunu kabul ederken, biz ve diğerleri kanıt s sağladıtrongly bu askorbat düşündüren bu metal metabolizmasında büyük ölçüde genişletilmiş bir rol oynar. İlk olarak, askorbat-dolu hücreler tarafından salınır askorbat hücreleri 19,20 ile transferrine bağlanan demir alımını modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır ve çok son kanıtlar askorbat da transferrin bağlı demir alımını modüle olduğunu gösterir gibi görünmektedir hücreleri 21 ile, ve ikinci bir ana fizyolojik demir alım yol 22 karşılık gelir. Askorbat memelilerde 23,24 normal merkezi sinir sistemi fonksiyonu için gereklidir. Birlikte adrenal korteks, hipofiz bezi, timus, retina ve korpus luteum ile, beyin diğer vücut dokularında 23,25-27 askorbat göreli yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Buna ek olarak, 28,29 ve nöron astrosit-benzeri hücreler glutamata 30 hem de maruz ascorbat hücre dışı alanı, içine askorbat salınmasını tetiklemek için bilinire glutamat kaynaklı nöronal disfonksiyon 31 karşısında nöronların korunması için düşünülmektedir. Astrositlerden glutamat kaynaklı askorbat serbest mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, son zamanlarda astrocyte glutamat ve aspartat taşıyıcı (Glast tarafından glutamat alımı nedeniyle şişlik hücrenin katılımını gösteren kanıt sağladı, aynı zamanda bilinen uyarıcı amino asit taşıyıcı izoformdur 1 [EAAT1 ] insanlarda) ve bu askorbat 32 gibi küçük organik anyonları geçiren hacim duyarlıdır osmolite ve anyon kanalları (VSOACs) bunun sonucunda aktivasyonu. VSOAC oluşumunda rol plazma membran borularının 33,34 moleküler kimlikleri tespit edilmesi gerekmektedir. Birçok deneyler, spektrofotometrik fluorometrik tahliller ve kromatografik 35,36 dahil biyolojik numunelerde askorbat tayini için geliştirilmiş olmasına rağmen, seçicilik, hassasiyet, interferenc çok değişkenlik mevcutturkimyasal madde, etkili lineer aralığı ve son nokta analitin stabilite, e. Ayrıca, tahlil seçimini de etkileyecektir diğer önemli faktörleri hız, kullanım kolaylığı ve bu gibi bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) aygıtı nispeten özel ekipmanlara erişimi. Burada kültürlenmiş hücrelerde hücre içi askorbat belirlenmesi yanı sıra, kültürlenmiş hücrelerden askorbat-efflux tayini için ayrı bir tahlili için basit ve son derece spesifik mikro kolorimetrik deneyi mevcut. İkinci tahlil nedeniyle sodyum-bağımlı askorbat nakliyecilere (SVCTs) tarafından yayımlanan askorbat hızla yeniden alım hücrelerden askorbat serbest ardı sorunu aşmak için amaçlamaktadır. Bu yöntemlerin her ikisi de önceki yayınlarda 19,20,32,37,38 bazı ortaya çıkmış olsa da, bu el yazması talimatları ve etkin yürütülmesi için kurallar açık bir kümesi sağlar.

<table><tbody><tr><td>Nunc 96-well flat-bottom plates</td><td>Thermo</td><td>269620</td><td>Any flat-bottom 96-well plate can be used</td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td></tr><tr><td>Refrigerated bench-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Swing-bucket</td></tr><tr><td>Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td></tr><tr><td>General-purpose buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;, pH 7.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.8 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;, pH 7.3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Highest purity preparations should be obtained</td></tr><tr><td>Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30790</td><td>Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbate oxidase (AO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide (FIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989</td><td>Trihydrate</td></tr><tr><td>Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&amp;prime;,5&amp;prime;&amp;prime;-disulfonic acid disodium salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>Sodium L-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Prepare a 0.1% stock solution</td></tr><tr><td>Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate (pH 6.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M citric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.3 mM FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 0.1 M acetic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AO (120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.4 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.12 mM FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 0.6 mM sodium-citrate</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

C Vitamini (askorbat) sadece son yıllarda ışık gelmiş birçoğu hücre metabolizmasında çok sayıda önemli rol oynar. Beyin askorbat homeostasis için çok önemli gibi görünen bir ilişki - Örneğin, beynin içinde, askorbat nöronlar ve komşu astrositlerden arasında askorbat bisiklet içeren bir nöroprotektif ve nöromodülatör şekilde davranır. Ayrıca, ortaya çıkan deliller güçlü askorbat klasik tanınır daha hücresel ve sistemik demir metabolizmasını düzenleyen bir ölçüde genişletilmiş bir role sahip olduğunu göstermektedir. Normal ve kuralsız hücresel ve organizma fizyolojisi askorbat ayrılmaz rolünün artan tanınması son derece pahalı uzman ekipman için gerek olmadan çalıştırılabilir orta verimlilik ve yüksek hassasiyetli analitik teknikleri bir dizi gerektirir. Burada, orta performans için açık talimatlar, bo tayini için özel ve nispeten pahalı olmayan mikro deneyi sağlarHücre kültüründe th içi ve hücre dışı askorbat.

Kültür Süspansiyon hücreleri içinde hücre içi Askorbat belirlenmesi İlk deneyde (Şekil 1) &#39;de, hücre içi askorbat, önceden yayınlanmış bir prosedüre göre 37 Ferrosiyanat son derece hassas saptaması kullanılarak, ferrosiyanür için ferrisiyanür (örneğin AO duyarlı) indirgeme askorbat-özgü ardından, tespit edilir. Askorbat tespiti ferrosiyanür ile demir ferrik demire indirgenmesi, ardından ferrosiyanür için ferrisiyanür asko...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells at JoVE.com

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Askorbat sadece son yıllarda ışık gelmiş, birçoğu hücre metabolizmasında çok önemli rol oynar. Burada, orta hacmi, hücre kültürü içinde hem de hücre içi ve hücre dışı askorbat belirlenmesi için özel ve pahalı olmayan bir mikro-tahlili tarif eder.

Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Görüntüleme.  University of Sydney.  Askorbat sadece son yıllarda ışık gelmiş, birçoğu hücre metabolizmasında çok önemli rol oynar. Burada, orta hacmi, hücre kültürü içinde hem de hücre içi ve hücre dışı askorbat belirlenmesi için özel ve pahalı olmayan bir mikro-tahlili tarif eder. 

Video: A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Biyokimya

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Biyoloji

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). Since RPE are highly metabolically-active cells, alterations in their metabolic status reflect changes in their health and function. High-resolution respirometry allows for real-time kinetic analysis of the two major bioenergetic pathways, glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), through quantification of the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), respectively. The following is an optimized protocol for conducting high-resolution respirometry on primary human retinal pigment epithelial cells (H-RPE). This protocol provides a detailed description of the steps involved in producing bioenergetic profiles of RPE to define their basal and maximal OXPHOS and glycolytic capacities. Exposing H-RPE to different drug injections targeting the mitochondrial and glycolytic machinery results in defined bioenergetic profiles, from which key metabolic parameters can be calculated. This protocol highlights the enhanced response of BAM15 as an uncoupling agent compared to carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) to induce the maximal respiration capacity in RPE. This protocol can be utilized to study the bioenergetic status of RPE under different disease conditions and test the efficacy of novel drugs in restoring the basal metabolic status of RPE.

The metabolic status of human retinal pigment epithelial cells (H-RPE) reflects their health and function. Presented here is an optimized protocol for examining the real-time metabolic flux of H-RPE using high-resolution respirometry.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

Source: Hlozkova K. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/58426">Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Source: Hlozkova K. et al. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

Lösemi

İn vitro teknikler ve analizler

Caco-2 Cell Bioassay: An In Vitro Method for Measuring Iron Bioavailability in Complex Food Sources

Source: Glahn, R. P. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63859">The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates an in vitro technique to assess iron bioavailability in complex food sources. The technique combines the simulation of human digestion along with iron uptake by differentiated Caco-2 cells. Intracellular ferritin formation acts as a marker for cellular iron uptake.

Caco-2 Hücre Biyo-Testi: Karmaşık Gıda Kaynaklarında Demir Biyoyararlanımını Ölçmek için İn Vitro Bir Yöntem

Source: Glahn, R. P. The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability. J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates an in vitro ...