Oksphos ve glikolizin gerçek zamanlı biyoenerjetik profillerinin sorgulanması, RPE sağlığını ve işlevini karakterize etmede kilit bir faktör olarak ortaya çıkmaktadır. Yüksek çözünürlüklü respirometri, normal ve hastalıklı RPE'nin metabolik durumunu karşılaştırmanın etkili bir yolunu sağlar. Bu teknik, oksijen tüketim hızı, OCR ve hücre dışı asitleşme hızı, ECAR ölçümü yoluyla hem oksos hem de glikolizin eşzamanlı olarak araştırılması avantajına sahiptir.
RPE hücreleri metabolik olarak oldukça aktif hücrelerdir ve AMD sırasında dejenere olan ilk hücrelerden biridir. Metabolik ve mitokondriyal fonksiyonlarını anlamak, yeni ilaçların geliştirilmesini mümkün kılar. Başlamak için, insan RPE ortamındaki hücre süspansiyonunun kuyucuğu başına 100 mikrolitre, her bir kuyucukta 100 mikrolitre başına 20.000 hücrelik nihai bir konsantrasyona ekleyin.
Ve dört köşe kuyusunu boş bıraktığınızdan emin olun. Kolaylık ve tutarlılık için çok kanallı bir pipet kullanarak homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için birden çok kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Arka plan düzeltmesi için yalnızca dört boş köşe kuyucuğuna 100 mikrolitre ortam ekleyin.
Kenar etkilerini en aza indirmeye yardımcı olmak için hücre kültürü plakasını bir saat oda sıcaklığında bırakın. Ardından,% 5 karbondioksit 37 santigrat derece ile inkübatöre yerleştirin ve nemlendirin. Gece boyunca inkübasyonun ardından, ortamı değiştirmeden önce morfolojilerini ve pigmentasyon seviyelerini kontrol etmek için hücreleri mikroskop altında inceleyin.
Sonraki muayene günlerinde, hücrelerin karakteristik parke taşı benzeri bir morfoloji ile birleştiğinden ve zamanla pigmentasyon kazandığından emin olun. Testten bir gün önce sensör kartuşunun hidrasyonunu sağlamak için, hizmet plakasının her bir kuyucuğunu 200 mikrolitre deiyonize suyla doldurun ve sensör kartuşunu suya batırılmış olarak hizmet plakasına yerleştirin. Kalibrant çözeltisinin yaklaşık 20 mililitresini, karbondioksit içermeyen 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir fırında gece boyunca saklayın.
Yüksek çözünürlüklü respirometri cihazını açın ve cihazın gece boyunca 37 santigrat derecede stabilize olmasını sağlamak için yazılımı başlatın. Tahlil gününde, tahlili çalıştırmadan en az 45 dakika önce, şebeke plakasındaki suyu, eşit hacimde ısıtılmış kalibrant çözeltisi ile değiştirin. Hazırlanan Mito stres testi tahlil ortamının 25 mililitresini fenol kırmızısı olmadan 37 santigrat dereceye kadar ısıtın ve bir tüp üstü filtre ünitesi kullanarak pH 7.4 ayarlı ortamı vakumlayın.
İnsan RPE ortamını hücre kültürü plakasından çıkarın ve 100 mikrolitre taze hazırlanmış tahlil ortamı ekleyin. Daha sonra hücre kültürü plakasını, tahlile başlamadan önce bir saat boyunca karbondioksit içermeyen 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir fırına yerleştirin. Her sensör kartuşu, test bileşiklerini tahlil sırasında hücre kültürü plakası kuyucuklarına enjekte etmek için kuyu başına dört reaktif dağıtım portuna sahiptir.
İlaç stoklarını kendi tahlil ortamlarında seyrelterek her biri Tenex ilaç çözeltilerinden üç mililitre hazırlayın. Daha sonra, her bir kuyucukta belirtilen nihai ilaç konsantrasyonunu elde etmek için Tenex ilaç stoğunun 20 mikrolitresini Port A'ya, 22 mikrolitresini Port B'ye ve 25 mikrolitresini Port C'ye pipet edin. Daha sonra analiz yazılımında şablonlar sekmesini açın, Mito stres testi'ni seçin ve grup tanımlarını doldurun.
Mito stres testi ilaçları için enjeksiyon stratejisi hakkında ayrıntıları girin. Ardından, kontrol veya tedavi için tahlildeki farklı deney grupları hakkında ayrıntıları girin. Baz tahlil ortamına farklı takviyeler ve bunların spesifik konsantrasyonlarını eklemek için tahlil ortamına ilişkin ayrıntıları girin.
Ve son olarak, hücre türünü ekleyin. İncelenen farklı grupları 96 kuyucuklu plakadaki belirli konumlarına atamak için bir sonraki sekmeye ve ardından Plaka Haritası'na tıklayın. Plaka Haritasını tamamladıktan sonra, varsayılan Mito stres testi protokolü için cihaz protokolünü gözden geçirmek üzere protokol sekmesine tıklayın.
Ardından, tahlili çalıştır'a tıklayın ve kalibrasyon için yardımcı plakadaki kalibrant çözeltisine batırılmış sensör kartuşunu takın. Bu işlem yaklaşık 25 dakika sürer ve her biyosensör, bilinen pH ve oksijen konsantrasyonunun kalibrant çözeltisinde ölçülen sensör çıkışına bağlı olarak bağımsız olarak kalibre edilir. Kalibrasyon tamamlandığında, yardımcı plakayı çıkarın ve hücre kültürü plakasını takın.
Temel ölçümden sonra, cihaz her biri üç dakika olmak üzere üç karıştırma ve ölçüm döngüsünü izleyen her bir kuyucuğa Port A ilaç çözeltisini otomatik olarak enjekte eder. Aynı model, diğer portlardaki her sonraki ilaç enjeksiyonundan sonra ortaya çıkar. Çalışma tamamlandıktan sonra, hücre kültürü plakasını ve sensör kartuşunu çıkarın.
Kalite kontrol amacıyla, artık ilaç kalıntısı olup olmadığını kontrol ederek tüm ilaç portlarının ve sensör kartuşunun enjekte edildiğinden emin olun. Daha sonra, hücrelerin akıcı tek katmanlı olmasını sağlamak için mikroskop altında hücre kültürü mikroplakasındaki hücreleri inceleyin. Daha sonra tahlil ortamını atın ve her bir kuyucukta 60 mikrolitre bir x lizis tamponu ile değiştirin.
Buharlaşmayı önlemek için plakanın kenarlarını parafilme sarın ve BCA testini kullanarak protein içeriğinin ölçülmesinden önce gece boyunca hücre lizisine yardımcı olmak için eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirin. Veri analizi başına, oksijen tüketim oranını veya OCR ve hücre dışı asitleşme oranını veya ECAR değerlerini her bir kuyucuktaki protein mikrogramlarına bölerek tüm verileri normalleştirin. Ardından, veri analizi yazılımını kullanarak Mito stres testi parametrelerini otomatik olarak hesaplamak için Excel makrolarını kullanan Mito stres testi rapor oluşturucusunu dışa aktarın.
Mito stres testi için gösterildiği gibi aynı adımları izleyerek, tablo bir ve tablo ikide gösterildiği gibi farklı olan tahlil ortamı takviyeleri ve ilaç enjeksiyonları hariç, glikolitik stres testi yapılabilir. Cihaz, her çalışma için aynı anda hem OCR hem de ECAR'ı ölçer. Mito stres testi için çevre hesaplamaları OCAR okumalarına dayanırken, glikolitik stres testi için parametre hesaplamaları ECAR okumalarına dayanmaktadır.
İşte birincil insan RPE hücreleri üzerinde Mito stres testinin gerçekleştirilmesinden elde edilen bir OCR eğrisi. Mito gerilme testi parametrelerinin hesaplamaları çubuk grafikler olarak görüntülenir. Benzer şekilde, bu, birincil insan RPE hücreleri üzerinde glikolitik stres testinin yapılmasından oluşturulan ECAR eğrisidir ve hesaplamalar çubuk grafikler olarak gösterilir.
Mito stres testi için port B ilaç enjeksiyonunu optimize etmek için, primer insan RPE hücrelerinde OCR'yi arttırmada iki uncoupling ajanının etkinliği karşılaştırıldı. BAM15'in, FCCP'ye kıyasla BAM15 ile anlamlı derecede yüksek maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesinde görüldüğü gibi, mitokondriyal solunum kapasitesinin arttırılmasında FCCP'den üstün olduğu bulunmuştur. Testi çalıştırmadan bir gün önce sensör kartuşunu nemlendirmeyi hatırlamak önemlidir.
Bu teknik, araştırmacıların RPE hücrelerinin biyoenerjetik profillerini daha iyi karakterize etmelerini ve RPE hücrelerinin farklı patojenik uyaranlara yanıt olarak metabolik esnekliği nasıl sergilediklerini anlamalarını sağlar.
