Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı NSF-IOS hibe # 1144391 için SHB tarafından desteklenmiştir.

1. Bitkiler hazırlanması <ol><li> Arabidopsis tohum doğrudan toprağa veya MS plakalar üzerinde çimlenmiş olabilir. 12 saat fotoperiyodun (22 ° C gün, 15 ° C gece 14) ile büyüme odalarında dört ila altı hafta için bitkiler büyümek. Su bitkileri bir kez haftada iki kez. Sulama için alt tepsi kullanın, üstten değil su bitkileri yok, tepsiler yeniden sulama önce kurumasını bekleyin. Bitkilerin hasat sırasında bol sıvı olduğundan emin olun. </li></ol> 2. Çözümler ve Yemekleri hazırlanması <ol><li> K 2-EDTA çözeltisi: buzdolabında tutulabilir bir 100 mM K 2-EDTA çözeltisi stok solüsyonu, olun. Toplama gününde, 4:59 (bir kısım EDTA solüsyonu, dört kısım su), 20 mM K 2-EDTA çözeltisi elde etmek için çözeltinin. </li><li> Yarım K 2-EDTA çözeltisi 20 mM ile bir cam veya Petri kabı (çapı 7-15 cm) doldurun. Eğer farklı tedaviler (ex için örnekler toplamabol kontrolü ve tuz stresli bitkiler veya farklı genotipleri), her tedavi için ayrı yemekler hazırlamak. </li><li> 20 mM K 2-EDTA çözeltisi, 1.4 ml 1.7 ml&#39;lik tepkime tüpleri, istenilen sayıda doldurun. 1.4 ml reaksiyon tüpleri eşit sayıda doldurun deiyonize veya Millipore su otoklava. </li><li> Üzerinde bitki ayarlamak için bankta kağıt havlu koyun; yeni bir jilet almak ve eldiven koymak. </li></ol> 3. Floem eksudata toplanması (Şekil 1&#39;de Akış Şeması in tasvir) <ol><li> Hasat rozet rozet ortasına yaprak sapı yakın dibinde jilet ile kesme yılına kadar dört ila altı haftalık-eski bitkilerden bırakır. </li><li> Hemen 2-EDTA K 20 mM içeren yemekler yaprakları yerleştirin. Yaprak sapı, kesilen ucu (Şekil 2) çözüm altında olduğundan emin olun. </li><li> Bir kez 15 yaprak hafifçe birbirine bu t üzerine yaprak yığını, (yaklaşık 3-4 bitkiler) toplanmıştırHat kesme sapı birbirleri ile hizalanır. Sapı (yaklaşık 1 mm) tabanına yeniden kesim ve hemen K 2-EDTA solüsyonu, 20 mM ile reaksiyon tüpleri içine bir yaprak aktarın. Onlar biraz sıvamış ise yaprakları kolay uyum. Bu hücrelerin hasar ve, böylece, yaprak hücre içeriğinin toplanması yol açar neden olabilir bu yana en yaprakları sıkma kaçının. </li><li> Daha fazla malzeme gerekiyorsa, nazikçe bir ıslak kağıt havlu ile örnekleri kapsayacak. Eğer farklı tedaviler veya genotip örnekler toplanması için yemekler yeni bir dizi kullanın. </li><li> Sonra, tüm numuneler, karanlıkta ya da ışık sıvılarını toplamak, reaksiyon tüpleri konumlandırılmıştır. </li><li> Karanlık, çizgi ıslak kağıt havlu ile büyük bir sığ çanak katta toplanması için. Yaprak dolu tepki çanak tüpleri ve ıslak kağıt havlu ile kapak ya ile rafa yerleştirin veya havalandırma için yarıklar ile bir siyah plastik geri koymak. Bir kabine tüm kurulum veya karanlık bir odada yer. </li><li> Işığında toplama, ıslak kağıt havlu ile net bir pleksiglas kabın dibine satır. Kapta yaprak dolu reaksiyon tüpleri ile raf yerleştirin ve kapatın. </li><li> 1 saat sonra, kaldır konteyner ve reaksiyon tüpleri yavaşça bırakır ve tüm EDTA kaldırmak için, distile deiyonize veya Millipore su ile iyice yıkayın. Bu adım, üç amaca hizmet eder: (1) bu hücrelere hasar minimize etmek için EDTA kaldırır (2), SDS-PAGE ve kromatografi ile EDTA müdahaleyi ortadan kaldıran, ve (3) kesme biriken / zarar veren herhangi bir bileşik kaldırır hücreler. Hemen otoklava su içeren hazırlanan reaksiyon tüpleri içine aktarmak ve eksuda toplanması için nemlendirilmiş toplama kapları dönmek. Eksüda RNA ekstraksiyonu için kullanılması gerekmektedir, bu noktada, RNaz inhibitörü ekleyin. İsteğe bağlı: protein analizi istendiği takdirde proteinaz inhibitörü ilave edilebilir. </li><li> Amaçlanan toplama süre sonra, çekin ve Akıntıyard yaprakları ve kullanım için sıvı N 2 floem eksuda dondurma. Uzun süre depolama gerekiyorsa, -80 örnekleri ve mağaza ° C lyophilize </li><li> Arabidopsis durumunda, metabolitler önce 1 saat boyunca dışkılarının toplandıktan sonra tespit edilebilir. Daha az oranda mevcut bileşenlerin analizi planlanan Ancak, 5-8 saat için toplama tavsiye edilir. Perilla gibi büyük tesisler için, uzun toplama saatleri (8 saat) önerilir. 15 yapraklardan toplanmıştır eksüda bir mRNA&#39;nın çıkarılması için SDS-PAGE jel (proteinler), GC-MS (şeker ve metabolitler) üzerinde tek bir şerit için genellikle yeterlidir. Lipid analizi için 2-3 örneklerin havuzu (30-45 yapraklarından eksüda) tavsiye edilir ve daha net sonuçlara yol açar. </li></ol> 4. Sonraki Analizi (Video için Biz sadece 4.4 göster) <ol><li> Protein analizi için, 15 ul su ve 30 ul LÄMMLI tampon tekrar süspansiyon örnek, 95 ısı ° C 5 dakika, hızlı bir şekilde herhangi p aşağı doğru döndürünrecipitates ve SDS-PAGE jel (45 ul yükleme cepler) üzerine tüm örnek yükleyin. Protein bolluk çok düşük olduğu için örnekleri Kolloidal Coomassie veya diğer hassas lekeleri ile boyanmış olmalıdır. </li><li> Şeker ve küçük metabolit analizi için, literatürde 14&#39;te tarif edildiği gibi kuru numune ajanlar Türevlendirme ekleyin. </li><li> mRNA RT-PCR, mikroarray veya RNA-Sıra analizi kullanılarak analiz edilebilir. </li><li> Lipit analizi için hemen havuzu 2-3 örnekleri ve kloroform karşı bölüm aşağıdaki gibidir: Bir çeker ocak içinde metanol (1:1) ile: 4 dk için her bir örnek için Metanol, bir kaç saniye boyunca girdap ve santrifüj: eşit Kloroform miktarı eklemek 400 x g. Teflon kapağı ve üst faz ile tekrar bölümü üç kez daha bir cam tüp içinde alt (organik) faz toplayın. N2 akışı altında bir araya getirilen organik fazlar kurutun ve (İnce tabaka kromatografisi daha fazla analiz için göndermek TLC 14, 37; sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi: MC-MS 14). </li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Floem eksuda EDTA-kolaylaştırdı toplama, çok basit az ekipman ihtiyacı ve birçok bitki için geçerlidir. Genel olarak, bu yöntem, daha fazla türe floem eksüda analiz yeteneği uzanır. Eksuda seyreltilmiş olmasına rağmen, malzeme büyük miktarda büyütmek için birçok farklı örnekleri toplamak ya da birçok bitkilerden kolaydır. Bu da çok düşük bolca ve aksi takdirde göz ardı edilebilir eden yeni bileşiklerin saptanması için izin verir. Bu yöntem, birden fazla bitki türleri için kullanılan ve bu yazının listelenen olanlar için tarif olarak çalışıyor olabilir. Yeni tür incelenmiştir ise, değişiklik gerekebilir iki yönü kullanılan yaprak ve eksuda sırasında sayısıdır. Çoğu durumda, bir 5-8 saat eksudasyon uygun olmalıdır. Yeni bitki türleri için bu yöntemin kullanımını doğrulamak için, eksüda protokolü parçası 4 N tarif edildiği gibi toplanır ve sonraki analiz bir veya daha fazla olması gerekireeds yapılacak. Gözlenen sinyal yoğunluğuna bağlı olarak, toplama hacmi büyütülüyor gerekebilir. Eski floem eksuda daha az bol olduğundan Genel olarak, lipid ve protein analizi şeker ve metaboliti analizi daha fazla malzeme gerektirir. EDTA kolaylaştırılan akıntı tahsilat kesilmiş yüzeyler yanı sıra, EDTA, potansiyel olarak zararlı etkisi içerir için, birkaç nokta dikkat edilmesi gerekir: (1) EDTA ile bir saat inkübe edildikten sonra, yaprak sapı iyice yıkanması gerekir. Bu yaralı hücreleri, hücrelerin zarar verebilir ya da çıkarma engelleyebilir EDTA kendisi, elde edilen herhangi bir bileşik kaldırır. (2) Pozitif ve negatif kontroller elde edilen veriler floem sap elde sağlamak için dahil edilmesi gereken değil, yaralı hücrelerinden (aşağıdaki kritik adımlar bakınız). (3) Floem sap eksuda toplama sırasında aktif olabilir çeşitli enzimler, içermiyor. Bu nedenle, bazı durumlarda, bunun için toplamak için yararlı olabilirZaman r farklı miktarlarda. Yöntem, su içine sızma dahil yana (4), bileşiklerin mutlak değerlendirilmesi mümkün değildir. Kritik adımda: (. Ref 14) uygun kontrol herhangi bir hücrelerin yanı sıra kullanım zarar vermez için numune taşıma sırasında bu yöntemin başarılı kullanımı için önemli dikkatli kullanılmasıdır. Bir uygun kontrol EDTA ile önceden tedavi olmadan floem dışkılarının topluluğudur. Bu durumda floem kendisi mühür ve hiçbir eksuda toplanabilir. Yaralı hücreleri gelen herhangi bir tehlike bileşikler burada algılanır. İkinci bir kontrol eksüda şekerlerin analizi olacaktır. Arabidopsis, sukroz 1:04 ve 1:08 (ürün 8, 14) arasında bulunan sakaroz oranına sahip fruktoz, floem SAP içinde baskın metaboliti olmalıdır. RNA ekstraksiyonu için, bir RNaz inhibitörü kullanılması gereklidir. Daha önce describ Buna ek olarak, bir pozitif kontroled floem-lokalize mRNA (UBC9: Ubiquitin bağlayıcı enzim 9, At4g27960, 8, 14) ve örneğin bir negatif kontrol bir kloroplast mRNA (Rubisco LSU) tavsiye edilir. Eksuda aktif enzimler içerdiğinden, bir süre ders toplama zaman farklılıklar sadece nedeniyle değil floem profilinde emin değişiklik yapmak için tavsiye edilir. Bazı durumlarda, proteinaz inhibitörleri, kullanmak yararlı olabilir. Ancak, araştırmacılar toplanan eksuda konsantre ve eklenen bileşikler büyük ölçüde konsantre olacağını olacağını, akılda tutmak gerekir. Protokol içinde ikinci bir kritik adım EDTA altında yaprak sapı en recutting olduğunu. Bu adım ikili bir amaca hizmet eder: Yeni böylece floem sap serbest akışını sağlayan fişler oluşumunu önlerken İlk olarak, herhangi bir kapalı elek plakaları kaldırır. İkincisi, kesim sırasında oluşan ksilem içinde kavitasyon kabarcık kaldırır ve böylece ksilem taşıma için izin verir. İkinci kesim büyüklüğü bağlıdırkullanılan bitkiler ile ilgili. Büyük sapı ile tesislerde bu Arabidopsis gibi bitkilerde ilk kesim, yukarıda birkaç milimetre (en fazla 1 cm) olmalı, 1-2 mm yeterlidir. Bu yöntemin kullanımı, gelişim veya biyomedikal etkileri sinyal olabilir floem sızıntıdaki yeni bileşiklerin keşfine yol açabilir. Bu floem erişim eksikliği nedeniyle bitki bilimi içinde az çalışılmış bir alan oldu uzun mesafe lipid sinyal, de derinlemesine bakmak daha yol açtı.

Bitkiler olumsuz koşullar kaçmak için hareket edemez. Sonuç olarak, onlar, çevresel streslere tespit etmek için mekanizmalar geliştirmek ortaya çıkarmak ve bitki boyunca ilgili sinyal iletimi, uygun geliştirme ayarlamak zorunda kaldı. İki taşıma sistemleri su, besin ve diğer (sinyal) bileşiklerin dağıtımı için var. İlk ksilem değil, genellikle su taşır ve mineraller bitki boyunca kökleri tarafından alınır hangi. İkinci floem olduğunu. Floem görüşünü RNA için basit asimile taşıma sistemi bir kanal değişti, protein, virüs, lipidler ve diğer küçük moleküller. Bu önemli bir rol oynar asimile ve besin taşıma, biyotik ve abiyotik stres yanıt, hem de bitki büyüme ve gelişme gibi. Şimdi bitki 18 &quot;bilgi otoyolu&quot; olarak adlandırılır. Floem parankimi, hem de özel arkadaşı CE: floem çeşitli hücre tipleri oluşurlls ve elek elemanları. Elek elemanı uzun mesafe hareketin sitesidir. Engelsiz uzunlamasına akışı için izin vermek için, elek elemanlarının yanı çekirdekleri gibi birçok organeller eksik ve iyi sınırlı bir öteleme makine 21, 33 içeren düşünülmektedir. Bu hücreleridir proteinler ve floem akışında seyahat eden diğer bileşikler, sentez olduğu düşünülmektedir. Bu bileşikler daha sonra plasmodesmata ile elek elemanı içine taşınır ve uzun mesafe sinyalleri 4,16 olarak işlev görebilir. Bileşiklerin birkaç grup floem sıvılarını bulunabilir: <ul><li> Şeker genellikle fotosentez ürünlerdir ve depolama için bitkinin diğer kısımlarına &quot;enerji taşıyan&quot; molekülleri olarak ya da yapı taşları olarak taşınmaktadır. Ancak, onlar da antifriz veya bileşikler sinyal olarak işlev görebilir. </li><li> Proteinler de floem eksüda bulunabilir. Bu metabolik enzimler arasında, ancak aynı zamanda fonksiyon sinyalizasyon var. Bir exampgelişimsel bir sinyal olarak hizmet veren bir protein le çiçeklenme indüksiyon yanı sıra bitkilerde mevsimsel yaprak kesilme sinyalleri Çiçekli odağı T proteindir. 6 </li><li> Nükleik asitler mRNA, küçük ve mikro RNA&#39;lar ve viral RNA&#39;lar şeklinde floem sızıntıdaki bulunmaktadır. Bunlar büyük ölçüde sinyal 27, 28, 39 dahil olmak görünür. Aynı zamanda, rRNA ve hemen hemen tüm amino asitler için tRNA&#39;lar kabakgiller 42 floem sap gözlenmiştir. Bunlar seçmeli olarak elek boru sistemine aktarılması gibi görünmektedir. TRNA&#39;lar translasyonel cihaz için bir amino asit aktarma yeteneği için gerekli değişiklikler göstermektedir. Ancak, oldukça yapıldı katılan, daha da bu süreçte inhibe ederler. Alternatif olarak, bu sitokinin bir kaynağı olarak hizmet ya da bitkinin 42 metabolik durumu sinyal olabilir. </li><li> Yağ asitleri, oxylipins ve diğer lipidler de floem eksüda 3, 13, 14, 23 olarak tespit edilmiştir. JasmoNIC asit, patojen enfeksiyonu 22, 29, 31, 32 ile ilgili tepkinin bir parçası olarak, floem aracılığıyla bir oxylipin hareket eder. En floem lipidlerin rolü henüz belirsiz olduğundan, bazıları muhtemelen fonksiyonu 4 sinyal var. </li></ul> Bitki floem ile çalışma meydan yaralama üzerine kendisine mühür kapasitesini yatıyor. Orada floem eksuda toplamak için kullanılan dört ana yöntem vardır, ama onlar seçin türlerinde sadece çalışır: 1) cucurbits yılında yaprak sapı kesim ile floem eksüda makul miktarlarda elde etmek mümkündür. Yaralı hücre kontaminasyon başlangıç ​​damla kaldırıldıktan sonra, saf floem sap 1, 15 arasında oldukça büyük bir miktarda elde etmek mümkündür. Ancak, artan toplama zaman, sıvı kromatografi yaklaşımlar (yayınlanmamış) için giderek uygun olmayan bu eksuda kalınlaşır yapma. Son yayınlar türüne göre, bu floem sap eithe türetilmiştir olduğunu, göstermektedirbu elek elemanları (FP) için &quot;mobil&quot; floem sap içeren yapar iken r fasikül (FP) veya extrafascicular floem (AP) ve bu, aynı zamanda ksilem 40 dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, 41 kirlenme eğilimli . 2) İkinci bir yaklaşım kök veya yaprak sapı sığ kesik veya delikler ile floem sap elde etmektir. Bu yöntem, acı bakla 17, 25, 36 kabakgiller ve Brassica napus 12 başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada yaralı hücrelerinden kirlenme az ve çok saf dışkıların. Ancak, bitkiler çok seçici delinme sadece elek elemanları için zor olduğu için sağlıklı ve sulak olması gerekir. Ksilem damarları çentikli ise, tüm eksuda ksilem akışı içine çekilir. Bu çok kırılgan veya yüksek Odunlaşmış sapı veya sapları ile bitkiler için uygun yöntemi yapar. 3) Yaprak biti stylectomy yaprak bitleri elek elemanları içine stile eklemek için izin verirn bir lazer ile yaprak biti kaldırır. Floem sap kalan Stile 2, 9, 10, 35, 38 boyunca yayılır. Teorik olarak, yaprak bitleri tarafından enfekte edilebilir herhangi bir bitki bu yaklaşım için kullanılabilir. Ancak, çoğu sera ya da büyüme odası yöneticileri patojenin kullanımını desteklemez. Buna ek olarak, yaprak bitleri kendi tükürük 19, 33 ile floem içine birkaç proteinlerin tanıtmak. Bu 30 yeniden programlama sınırlı bir transkripsiyonel yol açar ve floem kompozisyon 26 değiştirme potansiyeline sahiptir. 4) Burada anlatılan yöntemi floem sap EDTA-kolaylaştırdı sızma olduğunu. Bu yöntem, floem 20 sızdırmazlık önlemek için EDTA kullanmaktadır. EDTA Ca 2 + aksi floem mühür bu süreçleri katılacak iyonları şelat. EDTA hücre hasarı ile 30 yol açabilir, çeşitli gruplar, hücre ince yapısı veya phloe 20 mM kullanılan bu yöntem, 10 mM EDTA, konsantrasyonlarının olumsuz etkisi gözlemledikm yükleme ve taşıma 5, 24. Herhangi bir zararlı etkisi yanı sıra kromatografisi ve jel elektroforezi ile EDTA girişimi azaltmak için, bitkiler 1 saat sonra suya taşınır ve eksüda sadece sonraki bölümünde 14 kullanılır. Bu nedenle, yerine EDTA içine eksudasyon daha, floem su (EDTA-kolaylaştırdı sızma) içine exudated edilir. Bu floem eksuda toplanması için bir düz ileri, düşük maliyetli ve düşük teknolojili bir yöntemdir. Floem SAP bu şekilde proteinler, küçük moleküller, lipidler ve RNA&#39;lar analiz etmek için kullanılabilecek pek çok bitki elde edilir ve başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Deneyler sınırlı bir miktarda monokotlarda 11 gerçekleştirilirken, bu yöntem dikotlar (Perilla 17, 20, Arabidopsis, 8, 13, 14, Kavak 7) için daha uygun gibi görünmektedir. Eksuda toplanması terleme yoluyla eksuda kaybını önlemek için nemli bir ortam meydana zorundadır. Bitki bağlı olarak, 1-2 saat boyunca, EDTA inkübasyon olduğufloem / elek elemanları sızdırmazlık önlemek için yeterli. Toplama sonra su içine oluşabilir. Bu EDTA hücre yapısı ve istikrar üzerindeki olumsuz etkisi önlenmesi yararı vardır. Ayrıca, HPLC ya da SDS-page gibi yöntemler ile EDTA müdahale ortadan kaldırır. Bu Arabidopsis için geçerli gibi gösterilir. Daha büyük tesisler için, EDTA ve eksüda koleksiyonlarında inkübasyonu ölçeklenmesi sahiptir ve oldukça 1.7 ml&#39;lik tepkime tüpleri daha kap içinde gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)</td><td>PYREX or Corning</td><td></td><td>Any clean, shallow dish will work</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Only open containers in fume hood</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

Bitki floem uzun mesafe taşımacılığı (fotoğraf-) ve biyotik veya abiyotik stres taşıma sinyallerinin olarak özümseyen için gereklidir. Bu şekerler, amino asitler, proteinler, RNA, lipid ve diğer metabolitleri içerir. Böylece kompozisyonu ve fonksiyon floem ki, bu moleküllerin birçok rolü ve anlamada büyük bir ilgi varken, bitki gelişimi ve stres önemleri yanıt belirlenecek henüz. Floem analizi için bir engel üzerine floem mühürler kendisini yaraladı gerçeği yatıyor. Sonuç olarak, floem sap elde edilebileceği bitkilerin sayısı sınırlıdır. Eklendi ekipman olmadan çeşitli bitki türlerinden floem eksuda toplanması sağlayan bir yöntem EDTA-kolaylaştırdı floem eksuda koleksiyonu burada açıklanan olduğunu. Kullanımı kolay iken, hücrelerin yaralama yol yapar ve bakım hasarlı hücrelerin, içeriği kaldırmak için alınması gereken. Buna ek olarak, çok sayıda kontrol eksüda saflığı kanıtlamakgereklidir. Oldukça içeriğini sadece göreceli miktar oluşabilir floem sap (birçok türde mümkün değil) doğrudan bir koleksiyon daha bir sızma olduğu için. Diğerleri üzerinde bu yöntemin avantajı birçok otsu veya odunsu bitki türlerinin (Perilla, Arabidopsis, kavak, vb) kullanılan ve minimal ekipman ve eğitim gerektirir olmasıdır. Bu proteinler, şekerler, lipitler, RNA virüsleri ve metabolitlerin sonraki analiz için kullanılabilir dışkılarının oldukça büyük bir miktarda yol açar. Bu, hem araştırma hem de bir öğretim laboratuarda kullanılabilir kadar basittir.

Bu floem sap karmaşıklığı bitkiler en iyi yanıt gelişim ve stres sinyalleri değişen göndermek nasıl sorusuna cevap olabilir ki son birkaç yıl içinde netlik kazandı. EDTA-kolaylaştırdı floem eksüdasyon kullanan diğer yaklaşımlar için uygun değil, ekonomik ya da fizyolojik ilginizi çekebilecek bitkilerden floem eksuda analiz etmek için fırsat sağlayabilir. Yeterli floem ve hasat floem-lokalize proteinleri belirlemek ve (Şekil 3) geliştirme veya strese yanıt olarak düzeylerini değişiklikleri algılamak için eksuda için bu yöntemi sağlar. Rakam gösterir, protein çok düşük bolca olduğu için, henüz düzeylerini LC-MS/MS kullanarak sonraki proteomik deneyler için veya Western Blot analizi için yeterince yüksek. Kabakgiller bulgular kök kesme su potansiyeli denge bozulması ve daha sonra bir su akışına yol açıyor ve düşündürmektedirapoplastı 41 mümkün kirletici. : Yine bir ila sekiz saat arasında değişen zamanlar için toplama floem protein profili / kompozisyon Arabidopsis&#39;te (. Yalnızca mutlak miktarı Guelette ark değişir) toplandı, protein miktarı ve bulunan protein deseni etkilemez türleri (Arabidopsis arasında değişmektedir de; Perilla, şerit I ve NI) ve tedaviler (Perilla farklı bir gün uzunluklarında büyüdü, şerit I ve NI). Sonuç protein sinyalleri görüntülenebilir gibi, tespit ve takip. mRNA ve mikro RNA&#39;lar, aynı zamanda bu yöntemle floem sıvılarında tespit edilebilir. Bununla birlikte, RNaz inhibitörü ile tedaviye genişletilmiş eksudasyon süresinde mRNA bozulmasını önlemek için gereklidir. Bu elek elemanlar işlevsel kloroplast, RUBISCO küçük ya da büyük bir alt birim (sırasıyla, eritrositler veya rbcL), içermediği floem çok bilinen mRNA, negatif kontroller olarak kullanılır-Lokalize Ubiquitin-bağlayıcı enzim gibi mRNA bir pozitif kontrol (Şekil 4) olarak kullanılabilir. Benzer şekilde, şeker ya da küçük metabolitleri GC-MS ve LC-MS kullanılarak analiz edilebilir. Burada floem eksüda neredeyse tüm glikolitik yolun 12 de dahil olmak üzere fonksiyonel bir enzim, çok sayıda içerdiği belirtilmelidir. Bu nedenle, birkaç zaman noktalarını kullanarak eksuda toplama sırasında metabolik süreçleri ortaya çıkarabilir. Bir örneği Şekil 5&#39;te gösterilmektedir: Tüm sızıntıdaki, sukroz en bol metaboliti, bu 1 saat boyunca toplandıktan sonra çok açıktır. Bununla birlikte, beş saat sonra fruktoz oranı sakaroz biraz azalır. Aynı eksüda sonraki dört saat için, bir saat için, ve tezgah üzerinde bırakılırsa, oran fruktoza sukroz floem aktif enzimler oda sıcaklığına de sakaroz bozulmaya yol dışkıların düşündüren, çok daha büyük bir ölçüde azaltılırsıcaklık (daha yoğun yorumlar için 14). Bu, sistemin canlılığını 34 kaybedene kadar floem yükleme ve elek elemanları içine arkadaşı hücrelerinden moleküllerin taşıma sızma sırasında devam edebilir bulgularla tutarlıdır. Floem eksuda lipid ve, uzantısı, uzun mesafe lipid sinyal bitki bilimi ilgi oldukça yeni bir alan vardır. Hidrofobik doğası nedeniyle, lipidlerin düşük konsantrasyonlarda mevcut olan ve yalnızca çözündürme için diğer moleküllere bağlı olabilir. Yine de, EDTA-kolaylaştırdı eksudasyon görselleştirmek için yeterli malzeme toplanmasına olanak (TLC: Şekil 6) ve (LC-MS; es Şekil 7) tespit birkaç bitki türünden floem lipidleri bulunmaktadır. Şekilde görüldüğü gibi birkaç lipid türleri belirlemek ve ayırmak mümkündür. LC-MS farklı lipid türleri tanımlamak için ve differe bir lipid profili içinde değişiklik izlemenizi sağlarnt genotipleri veya tedavi. Bu bitki gelişimi ve stres tepkisi sırasında lipid rolünün çalışılması için olanak sağlar. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Şekil 1. Arabidopsis veya Perilla bir floem dışkılarının toplanması akış şeması. Farklı yollar mavi gösterilir farklı son ürünler, yol. RNA, RNaz inhibitörü (100 U / ml, Roche) nın hazırlanması için, floem eksüda toplandığı içine su ilave edilir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Şekil 2. Toplamak floem eksüda için malzeme Kurulumiyon. Kurulum protokol adımları 3,1-3,4 için gerekli tüm malzemeler görüntüler. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Moleküler ağırlık belirteci (şeritli 2): MW; floem bulundu Şekil 3 Proteinler iki farklı bitki türleri, Arabidopsis (At) ve Perilla (; farklı bir gün uzunlukları I ve NI) bir eksuda. Proteinler,% 10-20 gradyan SDS-PAGE kullanılarak ayrıldı. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Şekil 4,. AnaliziRubisco küçük ve büyük alt ünitesi için mRNA (sırasıyla, eritrositler ve rbcL) ve ubikuitin-bağlayıcı enzim (UBC) varlığı. mRNA Arabidopsis yaprağı (L), yaprak sapı (P) ve floem eksüda (Ph) toplanmıştır, PCR kullanılarak görüntülendi transkripsiyonu ve belirli transkript ters. Bu rakam Guelette ark güncellenmiştir. 14. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Floem Şekil 5. GC-MS profilini kez farklı miktarda tahsil eksudatları. Not nasıl toplama süresi (B), 5 saat için 1 saat toplama (A) &#39;dan sukroz değişiklikler nispi miktarı. Odasında &quot;kuluçka&quot; ardından 1 saat toplandıktan sonra Profil eksüda<html> Dört saat boyunca sıcaklığında (RT) (° C). Yaprak metaboliti profili (D). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Şekil 6. İnce tabaka Perilla (solda) ve Arabidopsis (sağ) yaprakları ve floem eksüda lipidler karşılaştırarak kromatogram. Yıldız eksüda floem spesifik lipidler göstermektedir. Dgdg: digalactosyldiacylglycerol; PG: fosfatidilgliserol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Arabidopsis lipidler gösteren rakam kısmı Guelette ark değiştirildi 14.. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; her zaman &quot;&gt; <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Şekil 7. LC-MS / negatif iyon modunu kullanarak Arabidopsis floem eksuda (kloroform faz) Lipid profili. En iyi olarak Grafikler (mutantı A) ve alt (vahşi tip B) iki farklı genotipleri (oklar ile gösterildiği gibi) arasında lipid farklılıklar göstermektedir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method at JoVE.com

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Floem sap bileşimi yanı sıra yükleme ve uzun mesafe taşıma mekanizmasının Bilgi bitki gelişimi ve stres / patojen yanıt olarak ve ulaşım asimile uzun mesafe sinyal anlaşılması için gereklidir. Bu el yazması EDTA-kolaylaştırdı yöntemi kullanılarak floem eksuda toplanması açıklar.

Toplanması ve analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floem EDTA-kolaylaştırdı Yöntemi eksuda

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

24.3K Görüntüleme.  Michigan State Universtiy.  Floem sap bileşimi yanı sıra yükleme ve uzun mesafe taşıma mekanizmasının Bilgi bitki gelişimi ve stres / patojen yanıt olarak ve ulaşım asimile uzun mesafe sinyal anlaşılması için gereklidir. Bu el yazması EDTA-kolaylaştırdı yöntemi kullanılarak floem eksuda toplanması açıklar. 

Video: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol aims to introduce general guidelines for the collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) on metabolite production. First, alfalfa seedlings are grown under DEHP stress in a hydroponic culture experiment. Second, the plants are transferred to centrifuge tubes containing 50 mL of sterilized ultrapure water for 6 h to collect root exudates. The solutions are then freeze-dried in a vacuum freeze dryer. The frozen samples are extracted and derivatized with bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA) reagent. Subsequently, the derivatized extracts are measured using a gas chromatograph system coupled with a time-of-flight mass spectrometer (GC-TOF-MS). The acquired metabolite data are then analyzed based on bioinformatic methods. Differential metabolites and significantly changed metabolism pathways should be deeply explored to reveal the impact of DEHP on alfalfa in view of root exudates.

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

The secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol describes how to assess the impact of xenobiotics on alfalfa via nontargeted metabolomic analysis.

Di (2-etilheksil) Ftalatın Metabolit Üretimi Üzerindeki Etkisini İncelemek için Yonca Kökü Eksüdalarının Toplanması

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Çevre

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Biyokimya

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biyoloji

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Bir örnek olarak

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Arabidopsis thaliana'da Polen Hidrasyon Profillerini Ölçmek İçin Geliştirilmiş Bir Yöntem

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Yazar Spot Işığı: Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, İn Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

Toplanması ve analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Di (2-etilheksil) Ftalatın Metabolit Üretimi Üzerindeki Etkisini İncelemek için Yonca Kökü Eksüdalarının Toplanması

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana

Hücre Özgül Analizi

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili