Biz çizimler için Hyewon Cooper teşekkür ederim.

1.. Teşrih Bu protokol boyunca kullanılan Hamamböceği tuzlu su çözeltisi, aşağıdaki bileşime sahiptir: Hamamböceği tuzlu su çözeltisi 36: (100 ml gram) 210 mM NaCl (1,227 gr) 2.9 mM KCl (0.0216 g) 1.8 mM CaCl2 (0.0265 g) 0.2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0.0032 g) 1.8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7.2. 1 M NaOH ve 1 M HCI ile pH ayarlayın.) <ol><li> Sağlam Cerci (Şekil 1) sahip olan tanktan erkek hamamböceği seçin. Erkek son segmentleri kadın oranla dar ve yumurtalıklar ve yumurta kütlesi hiçbir içeren, erkekler incelemek kolaydır. P. erkek americana cerci arasında kısa prob ucu bir çift var. Bu uçları kadınlarda gözlenen değildir. </li><li> Kanatlar, bacaklar ve baş kesti ve bir di vücut, ventral yüzü yukarı, pinsh silikon elastomer ile kaplı. </li><li> Forseps ventral plakaları almak ve posterior sonunda başlayan ve öne çalışma, ince makas ile kesilerek. Cerci kuru tutmaya çalışırken her zaman tuzlu su ile nemli iç organları tutmak. Bir Cerci ıslatmasını önlemek için tuzlu karın yukarı konumlandırmak için mum ya da kauçuk parçaları kullanabilirsiniz. Onlar ıslanmasına yoksa, doku kağıt parçası ile kurulayın. Tarafına iç organları ve beyaz madde (yağ vücut) itin. VNC alanın merkezinde, karın uzunluğu boyunca uzanan ve parlak trakea arasında görünür olmalıdır. Sinir kablosu saydam ve başlangıçta aydınlatma (Şekil 2) doğru ayarlanana kadar görmek zor olabilir. Forseps veya böcek pimleri ile VNC ele YAPMAYIN; yerine cam problar kullanılarak manipüle. </li><li> Hayvanın trakea sistemini en iyi olarak forseps ile sinir kordonu mümkün olduğunca ve ince cam muhtaç bir çift ile temizlemekles, çok dikkatli uzunlamasına A6 ve A5 veya A5 ve A4 ganglionlar (Şekil 3) arasında VNC connectives bölünmüş. Cradle cerci ve kısaltılmış böcek pimleri ve balmumu veya hazırlık (Şekil 4A ve B) uyması için kesilebilir silikon elastomer bir kama ile tuzlu su yukarıya doğru karin. Ganglion içine proje Cercal sinirleri zarar vermemek için son karın segmentinde ekstra dikkatli olun (Şekil 2B ve 5). </li></ol> 2. Ekstrasellüler Kaydı <ol><li> Disseke hazırlanması, mikroskop, ve kayıt cihazı (Şekil 6) nöronlardan gelen sinyaller geçersiz olabilir harici, özellikle AC, elektrik alanlarını engellemek için bir Faraday kafesi içinde kurulum olmalıdır. </li><li> Bu mikroskop sahne bakan böylece mikroskop yerleştirin. Hazırlık aşamasında yerleştirilir sonra, yüksek yoğunluklu aydınlatıcı kirişin konumunu ayarlamakbunu en iyi görünüm için. </li><li> Entegre veri kayıt ünitesi AC / DC diferansiyel amplifikatör bağlayın (özel donanım ve yazılım ayarlarına ayrıntıları önceden 25 tarif edilmiştir). Bir emme elektrodu tutan kafa sahne yükselticiye bağlı olmalıdır. Cl ile kaplanmış gümüş bir topraklama kablosu - daha istikrarlı kayıtları karın sonuçlara sokulur. Vücut boşluğunda çözelti, çanak banyo sıvısı ile temas, bir kayıt elektrotu kalır topraklı ilişkili akışkan içinde değilse nedenidir. </li><li> 4 kHz için kayıt frekansı ayarlayın. 500 mV (bu iz görselleştirme optimize etmek için ayarlanabilir) voltaj ölçek (y-ekseni) ayarlayın. Uyarılara yanıt olarak nöral aktiviteyi kaydetmek için sürekli veya osiloskop modunda kayıt yazılımı çalıştırın. </li><li> A5 yakın VNC connectives birini kesip bir emme elektrot içine A6 bağlı kesik ucunu yerleştirin. P emin olunsinir emme önce içindeki gümüş tel kapsayacak şekilde emme elektrodu içine ull tuz. </li><li> Her cercus üzerinde bulunan kıllar üzerinde bir kuru pipet darbe hava ile. Kaydedilen Bağ için cercus ipsilateral üzerindeki tüyleri uyarıcı taraf farklı bir tepki verir olmadığına bakın. Yanıtların genlik ve uyarılması sırasında belirli bir zaman aralığı içinde sivri sayısına dikkat edin. </li><li> Kayıt için bir Cercal sinir emme elektrodu hareket ettirin. Gerekirse küçük bir açıklığı olan bir elektrot ucu için daha iyi bir uyum, anahtarı almak için. </li><li> A6 Cercal sinir yakın kesilir ve sonra cercus giden sinir emmek. Aksiyon potansiyellerinin kendiliğinden ateşleme olmalıdır. Şimdi, cercus üzerine hava üflemek ve yanıtları not edin. </li></ol> 3. Elektrikle İşe belirleme Duyu sinirleri uyarıcı <ol><li> O (100-500 mse izlerini kaydeder böylece moduna süpürmek için kayıt yazılımı değiştirmec.) her bir uyarıcı tetiklenir. </li><li> Stimülatör çıkışına uyarıcı elektrot bağlayın. </li><li> Iki mini-kanca açar veya klips ile stimülatör kablosunu bağlayın. </li><li> Kayıt birimi üzerinde tetikleme girişine stimülatör BNC tetik çıkışını. </li><li> 10 msn; Frekans:;: Süre: Gecikme 0.3 sn aşağıdaki stimülasyon parametreleri bir tepki uyandırmak gerekir 1 Hz; Voltaj: kayıtlarında bir sinyal elde etmek gerektiği gibi (sadece eşiğin üzerinde ve maksimum yanıt elde edememek) ayarlayın. Bir yüksek gerilim sinire zararlı olabilir atanmada için maksimum eşikten daha yüksek gerilimlere gitmek için hiçbir sebep yoktur. </li><li> Uzun bir sinir kökü uyarıcı emme elektrot içine (Şekil 7, ok kafa) çekilebilecek böylece mümkün olduğunca uzak olarak Cercal sinir kesti. A6 ve A5 veya başka bir segment daha fazla ön arasındaki bağ kullanılabilir. </li><li> Kayıt emme elektrot ayarlayın böylece can puelektrot içine bir kesim bağ yukarı edeceğiz. Sinirlerdeki emme önce içindeki gümüş tel kapsayacak emme elektrotların içine biraz tuzlu çekmek için emin olun. Uyarıcı elektrot da (A3 yakın karın ideal) banyo tuzlu topraklanmış olduğundan emin olun. </li><li> Bir aksiyon potansiyeli ekranda görünene kadar artan gerilimin tek uyaranlara bir dizi sunun. Bir yanıt işe minimal uyarıcı gerilim ve süresi bir kayıt yapmak gerekir. Connectives bir sinaptik tepki görülmektedir kadar yoğunluğunu artırın. Dev akson gelen büyük başak (ekstraselüler AP) ilk görünür ve daha sonra diğer küçük AP da görülebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Full, R. J., Tu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+rapid+running+insect:+two-,+four-+and+six-legged+locomotion.">Mechanics of a rapid running insect: two-, four- and six-legged locomotion.</a> J. Exp. Biol. 156, 215-231 (1991).</li><li>Ritzmann, R. E., Tobias, M. L., Fourtner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flight+activity+initiated+via+giant+interneurons+of+the+cockroach:+Evidence+for+bifunctional+trigger+interneurons.">Flight activity initiated via giant interneurons of the cockroach: Evidence for bifunctional trigger interneurons.</a> Science. 210, 443-445 (1980).</li><li>Libersat, F., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cercal+position+during+flight+in+the+cockroach:+a+mechanism+for+regulating+sensory+feedback.">Control of cercal position during flight in the cockroach: a mechanism for regulating sensory feedback.</a> J. Exp. Biol. 136, 483-488 (1988).</li><li>Ganihar, D., Libersat, F., Wendler, G., Cambi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wind-evoked+evasive+responses+in+flying+cockroaches.">Wind-evoked evasive responses in flying cockroaches.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 175, 49-65 (1994).</li><li>Pipa, R. a. D., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The American Cockroach. , 175-216 (1981).</li><li>Westin, J., Langberg, J. J., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+giant+interneurons+of+the+cockroach;+Periplaneta+americana+to+wind+puffs+of+different+directions+and+velocities.">Responses of giant interneurons of the cockroach; Periplaneta americana to wind puffs of different directions and velocities.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 121, 307-324 (1977).</li><li>Camhi, J. M., Tom, W., Volman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+escape+behavior+of+the+cockroach+Periplaneta+americana.">The escape behavior of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 128, 203-212 (1978).</li><li>Nicklaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Erregung+einzelner+Fadenhaare+von+Periplaneta+americana+in+Abh&#228;ngigkeit+von+der+Gr&#246;sse+und+Richtung+der+Auslenkung.">Die Erregung einzelner Fadenhaare von Periplaneta americana in Abh&#228;ngigkeit von der Gr&#246;sse und Richtung der Auslenkung.</a> Z. Vgl. Physiol. 50, 331-362 (1965).</li><li>Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+wind+recorded+from+the+cercal+nerve+of+the+cockroach+Periplaneta+americana.">Responses to wind recorded from the cercal nerve of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 133, 97-102 (1979).</li><li>Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 93-131 (1984).</li><li>Ritzmann, R. E., Pollack, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thoracic+interneurons+that+mediate+giant+interneuron-to-motor+pathways+in+the+cockroach.">Identification of thoracic interneurons that mediate giant interneuron-to-motor pathways in the cockroach.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 159, 639-654 (1986).</li><li>Plummer, M. R., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+sensory+signals+from+noise+in+the+escape+system+of+the+cockroach+-+the+role+of+wind+acceleration.">Discrimination of sensory signals from noise in the escape system of the cockroach - the role of wind acceleration.</a> J. Comp. Physiol. 142, 347-357 (1981).</li><li>Bullock, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 1-14 (1984).</li><li>Pollack, A. J., Ritzmann, R. E., Watson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+for+tactile+sensory+information+to+thoracic+interneurons+in+the+cockroach.">Dual pathways for tactile sensory information to thoracic interneurons in the cockroach.</a> J. Neurobiol. 26, 33-46 (1995).</li><li>Atwood, H. L., Wiersma, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Command+interneurons+in+the+crayfish+central+nervous+system.">Command interneurons in the crayfish central nervous system.</a> J. Exp. Biol. 46, 249-261 (1967).</li><li>Olson, G. C., Krasne, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crayfish+lateral+giants+as+command+neurons+for+escape+behavior.">The crayfish lateral giants as command neurons for escape behavior.</a> Brain Res. 214, 89-100 (1981).</li><li>Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+cockroach+escape+behavior+with+lesions+of+individual+giant+interneurons.">Analyzing cockroach escape behavior with lesions of individual giant interneurons.</a> Brain Res. 335, 342-346 (1985).</li><li>Comer, C. M., Dowd, J. P., Stubblefield, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+responses+following+elimination+of+the+giant+interneuron+pathway+in+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Escape responses following elimination of the giant interneuron pathway in the cockroach, Periplaneta americana.</a> Brain Res. 445, 370-375 (1988).</li><li>Keegan, A. P., Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wind-elicited+escape+response+of+cockroaches+(Periplaneta+americana)+is+influenced+by+lesions+rostral+to+the+escape+circuit.">The wind-elicited escape response of cockroaches (Periplaneta americana) is influenced by lesions rostral to the escape circuit.</a> Brain Res. 620, 310-316 (1993).</li><li>Casagrand, J. L., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+amines+modulate+synaptic+transmission+between+identified+giant+interneurons+and+thoracic+interneurons+in+the+escape+system+of+the+cockroach.">Biogenic amines modulate synaptic transmission between identified giant interneurons and thoracic interneurons in the escape system of the cockroach.</a> J. Neurobiol. 23, 644-655 (1992).</li><li>Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+ascending+giant+fiber+system+in+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Organization of the ascending giant fiber system in the cockroach, Periplaneta americana.</a> J. Exp. Zool. 108, 243-261 (1948).</li><li>Ramos, R. L., Moiseff, A., Brumberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+and+versatility+of+extracellular+recordings+from+the+cockroach+for+neurophysiological+instruction+and+demonstration.">Utility and versatility of extracellular recordings from the cockroach for neurophysiological instruction and demonstration.</a> J. Undergrad. Neurosci. Educ. 5, (2007).</li><li>Oakley, B., Schafer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+neurobiology.">Experimental neurobiology.</a> , (1978).</li><li>Welsh, J. H., Smith, R. I., Kammer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory exercises in invertebrate physiology. , (1968).</li><li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen:+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception.">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).</li><li>Bacon, J. P., Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+sensory+neurons+in+mutant+cockroaches+compete+with+normal+cells+for+central+targets.">Ectopic sensory neurons in mutant cockroaches compete with normal cells for central targets.</a> Development. 115, 773-784 (1992).</li><li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-factors+and+co-repressors+of+Engrailed:+expression+in+the+central+nervous+system+and+cerci+of+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Co-factors and co-repressors of Engrailed: expression in the central nervous system and cerci of the cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tiss. Res. 327, 177-187 (2007).</li><li>Blagburn, J. M., Gibbon, C. R., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+engrailed+in+an+array+of+identified+sensory+neurons:+comparison+with+position,+axonal+arborization,+and+synaptic+connectivity.">Expression of engrailed in an array of identified sensory neurons: comparison with position, axonal arborization, and synaptic connectivity.</a> J. Neurobiol. 28, 493-505 (1995).</li><li>Booth, D., Marie, B., Domenici, P., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+behavior:+engrailed+knock-out+changes+cockroach+escape+trajectories.">Transcriptional control of behavior: engrailed knock-out changes cockroach escape trajectories.</a> J. Neurosci. 29, 7181-7190 (2009).</li><li>Schrader, S., Horseman, G., Cokl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensitivity+of+wind-sensitive+giant+interneurons+in+the+cave+cricket+Troglophilus+neglectus.">Directional sensitivity of wind-sensitive giant interneurons in the cave cricket Troglophilus neglectus.</a> J. Exp. Zool. 292, 73-81 (2002).</li><li>Libersat, F., Goldstein, R. S., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsynaptic+regulation+of+sensory+activity+during+movement+in+cockroaches.">Nonsynaptic regulation of sensory activity during movement in cockroaches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 8150-8154 (1987).</li><li>Stern, M., Ediger, V. L., Gibbon, C. R., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cercal+filiform+hair+sensory+neurons+in+the+first-instar+cockroach+restores+escape+behavior.">Regeneration of cercal filiform hair sensory neurons in the first-instar cockroach restores escape behavior.</a> J. Neurobiol. 33, 439-458 (1997).</li><li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+specificity+in+the+first+instar+cockroach:+patterns+of+monosynaptic+input+from+filiform+hair+afferents+to+giant+interneurons.">Synaptic specificity in the first instar cockroach: patterns of monosynaptic input from filiform hair afferents to giant interneurons.</a> J. Comp. Physiol A. 166, 133-142 (1989).</li><li>Watanabe, H., Ai, H., Yokohari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+activity+patterns+of+odor-induced+synchronized+potentials+revealed+by+voltage-sensitive+dye+imaging+and+intracellular+recording+in+the+antennal+lobe+of+the+cockroach.">Spatio-temporal activity patterns of odor-induced synchronized potentials revealed by voltage-sensitive dye imaging and intracellular recording in the antennal lobe of the cockroach.</a> Front. Sys. Neurosci. (6), 55 (2012).</li><li>Nishino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+and+olfactory+input+segregation+in+the+mushroom+body+calyces+in+a+basal+neopteran,+the+American+cockroach.">Visual and olfactory input segregation in the mushroom body calyces in a basal neopteran, the American cockroach.</a> Arthropod Struct. Dev. 41, 3-16 (2012).</li><li>Elia, A. J., Gardner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+DDT+on+the+behavior+and+central+nervous+system+activity+in+Periplaneta+americana.">Long-term effects of DDT on the behavior and central nervous system activity in Periplaneta americana.</a> Pestic. Biochem. Physiol. 21, 326-335 (1984).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Bu klasik hazırlama teknikleri sergileyen için nedenlerinden biri cerci sistemi olmuştur olduğunu ve hala sinir devresi gelişme soruları ele yanı sıra sinaptik onarım ve yenilenme 26-31 ilişkin sorular içinde aktif bir araştırma alanıdır. Hamamböceği ventral sinir kablosu faaliyet çağrıştıran iki yöntem sinir sistemi fonksiyonu farmakolojik ajanların veya böcek öldürücü etkilerini incelemek için kullanılabilir. Bu deneyler, sadece tuz çözeltisi içine nöroaktif kimyasal çözülmesiyle yapılmaktadır. CNS işlev üzerindeki kimyasal etkisinin tutarlı bir okuma vermek üzere bağlaçlar bir motor sinir kayıt sırasında normal banyo ortamı bu çözelti alışverişi sonra, uyarılmış ya da spontan aktivitede bir değişiklik gözlenebilir. Tüm nörofizyolojik deneylerde gibi ortak bir sorun elektriksel gürültü. Bu hazırlıkları için sinyal kalitesi muhtemelen en büyük etken isinir dokusu ile ilgili emme elektrodu conta. Tamamen Cercal sinir veya bağ çekmek olmayan bir sıkı mühür idealdir. Kayıtlar ayrıca, sinir kord ve mineral yağı ve petrolatum karışımı ile VNC yalıtım altına yerleştirilmiş çift kanca elektrotlar ile yapılabilir. Karışım, bir şırınga içine yüklenir ve sinir kordonu 32 çevresinde deşarj edilebilir. Ayrıca dikkatli bir diseksiyon herhangi MSS hazırlanması gibi burada da önemlidir. Bazıları kolay dorsal manikür diseksiyon tarafından MSS erişmek için bulabilirsiniz. Bu ventral sinir kablosu zarar olasılığını azaltır iken bu yaklaşımı kullanarak iç organların tümünü kaldırmak için daha zor olabilir. Burada tarif değil, bu preparat, dev internöronlar 32,33 hücre içi kayıt elverişlidir. Tüm sinir kablosu da aynı anda birkaç kayıt ve uyarıcı elektrotlar karşılamak için kaldırılabilir. Antennal lob, mantar bo Aslında keşifdy, ve diğer ön CNS yapılar devam 34-35 hala. Hamamböceği CNS Modern nörobiyolojik araştırma ışık tutacak devam ederken bu özel hazırlık lisans akademik laboratuvarlarda kullanılabilecek kadar basittir.

Orada 4.000 &#39;den fazla hamam böceği türü vardır ama sadece yaklaşık 30 ev zararlıları vardır. Belki de en çok tanınan Afrika kökenli misnamed Amerikan hamamböceği Periplaneta americana ve şimdi neredeyse her yerde gezegen üzerinde bulunur. Tropik hızla koşma hızı 1 ve kaçamak davranış, ek olarak P. americana uçuş 2,3 yeteneğine sahiptir. Hamamböceği, merkezi sinir sistemi (MSS) baskın özellikleri kontrol etme segmentli doğası ve ademi, 4,5 işler vardır. Beyin, göğüs ve karın ganglion ventral sinir kablosu (VNC) oluşturmak için eşleştirilmiş interganglionic connectives ile birleştirilir. Her segmentte ganglion merkezleri entegre edilmiştir. Sadece altlarında, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin sorumlu hücreler ihtiva eden bir dış kortikal bölge ve nöronlar origi en somata oluşmaktadıro ganglion nating. Bu somata internöronlar, düzenleyici nöronlar, ya da motor nöronların ait olabilir. Onlar kökenli (yerel interneuron) ve ganglion içinde kalır aksonlarını veya MSS (interganglionic internöron) arasında ganglionlar veya periferik kas hücrelerinin (motor nöronlar) üzerine sona arasında proje aksonlar kaynağı. Çoğu somata ganglion korteks 5 ventral veya ventrolaterally konumlandırılmış. Eşleştirilmiş, interganglionic bağlaçlar sadece akson ve nöron hücre gövdeleri içerir. Bir ganglion nöropil glial hücreler (nöroglia), akson yolları, akson demetleri ve nöronların dendrit (nevrotiler) içerir. Nöropil nöronal hücre gövdeleri yoksundur. Bu sinir hücreleri ve girdilerin entegrasyonu arasında doğrudan sinaptik iletişim gerçekleşmez ganglion içinde bölgedir. Amerikan hamamböceği P. yeteneği (ayak, han algılamak ve aniden yaklaşan bir avcı yanıt americanad, vb.) cerci ve dev fiber sistemi 6,7 oluşan bir refleks devreye isnat edilmiştir. Cerci karın sonunda (Şekil 1) üzerinde bulunan boynuz gibi, rüzgar duyarlı yapıların bir çift vardır. P. americana her cercus ventral yüzeyi yaklaşık 200 ipliksi (iplik) 14 sütun halinde düzenlenmiştir kıllar içerir. Bu sütunların dokuz sürekli olarak ilişkili reseptör hücre ve akson yanıt özelliklerine göre farklı hayvanlarda tespit edilebilir. Her bir saç bu kolon spesifik olan bir düzlemde en kolay bükmek için izin veren bir yuva bulunmaktadır. Kendi düzlemi boyunca bir yönde hareket saç reseptör hücrede bir depolarizasyonu ve duyu nöron eylem potansiyelleri patlaması (AP) indükler. Ters yönde hareket eden bir kendiliğinden Ap 8 inhibe eder. Yanıtın sapma ve yönlere tercih edilen düzlemi her sütundaki farklıdır. Bu nedenle, filiform saç reseptör kompleksleri hava hareketini tespit etmek için değil, aynı zamanda AP, hava akımı kaynaklandığı yönde şeklinde, &#39;kodlama&#39; için de sorumludur. MSS tarafından bu bilgilerin işlenmesi bir &#39;uygun&#39; kaçış tepkisi 6,7 sonuçlanır. Duyusal kılların Bu fonksiyonel, sütunlu özgünlüğü hayvandan hayvana korunur. Her bir filiform saç reseptör hücre reseptör hücrenin akson 9 AP bir patlama ya da inhibisyonu ile sonuçlanan bir sinir olay (içine saç mekanik sapmasını transdüklenmesinden sorumludur. AP&#39;ler Cercal ile terminal karın ganglion (A6) seyahat onlar ventral sinir kablosu (VNC) dev akson ile sinaps sinir XI. dev aksonlar bir kaçış davranışının 6,10,11 sonuçlanan motor nöronların iletim ve sonraki uyarma sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Davranışsal gecikme oP. kaçış tepkisi f americana herhangi bir hayvan 7 en kısa biridir. Davranış gecikme bir mekanoreseptörler bir uyaranın varış ve bir kaçış yanıt başlaması arasındaki zamanı. Saldıran bir kurbağa gelen teşebbüs kaçış kaydetmek için yüksek hızda sinematografi kullanıldığı deneylerde, hamamböceği hareketini 7,12 hamamböceği için dil uzatma başından itibaren yaklaşık 40 milisaniye (zaman uzak kurbağa onun dönüş başlayacak gözlendi. Kontrollü rüzgar puf kullanma , davranışsal gecikme 11 msn azaltılmış olabilir. Diğer deneyler iken bile daha düşük hızlar (3 mm / (msn 600 mm / 2 bir ivme ile) / msn 12 mm minimum rüzgar hızı puf, bir kaçış tepki uyandırmak olduğunu ortaya sn) yavaş yavaş 12 hareketli durdurmak için hamamböceği yürüyüş neden oldu. Tipik dev fiber sistemleri ve kaçış davranışı arasındaki mevcut güçlü bir korelasyon de 13,14 belgelenmiştir. Instözel bir hücre gerekli ve bir davranış uyandırmak için yeterli olan ances hücre komut nöron 15,16 olarak adlandırılır. P. rüzgar kaçış devresindeki dev internöron (CBS) americana refleks için gerekli değildir. Deneysel CBS ablasyon olan hayvanlar yine kaçış davranışı dolayısıyla bu yaktığımız komut nöronlar 17,18 kabul edilmez sergiler. Sensorimotor devresine rostral olan servikal bağlayıcıları kesilmesi, aynı zamanda beyinden giriş inen kaçış 19 yönünde üzerinde bir etkiye sahip olduğunu gösterir, davranışını etkiler. Ince kontrol ve yedekleme bu yönleri organizmanın hayatta kalması için büyük önem taşımaktadır ve biyojen aminler 20 üzeri nörokimyasal modülasyonu ile tamamlanmaktadır. P. americana sinir kablosu hazırlama Roeder &lt;öncü çalışmaları ile başlayan son on yıllardır neuroethologists için şık bir model sistem olmuştur&gt; 21 sup. Onların giriş 22,23,24 dev internöronlar birincil duyusal faaliyet ve çıkan yanıtları kaydetmek ekran ve analiz etmelerini sağlar. Tanımlanabilir nöral devreleri çevreye davranışsal yanıtların altında yatan fikrini iletmeye ek olarak, bu egzersizleri bu ortak ev haşere tarafından yapılan biyolojik katkılar için bir takdir aşılamak gerekir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

Hamamböceği ventral sinir kablosu hazırlık neuroethology deneylerde, sinir ağı modelleme, ve böcek fizyolojik etkilerini test etmek için uysal bir sistemdir. Bu makalede, bir böcek sinir sistemi çevre düzensizliklerin nasıl tepki tahlil etmek için kullanılabilir hamamböceği duyu modaliteleri kapsamını tarif eder. Burada vurgu Periplaneta americanadan dev fiber iletim cerci aracılık kaçış davranışı üzerinde. Bu yerinde hazırlanmasında nöronal aktivitenin tekrarlanabilir kayıtları oluşturmak için sadece orta diseksiyon beceri ve elektrofizyolojik uzmanlık gerektirir. Peptitler veya diğer kimyasal reaktif maddeler daha sonra fizyolojik tuzlu su ile çözelti içinde, sinir sistemine doğrudan uygulanabilir. Böcek de diseksiyon önce tatbik edilebilir ve kaçış devre merkezi sinir sisteminin heyecanlı devlet için bir vekil olarak hizmet verebilir. Bu bağlamda, bu tarifnamede anlatılan tahliller, aynı zamanda r yararlı olacaktıruzuv rejenerasyon ve sinir sistemi gelişimi evrimi ile ilgilenen esearchers hangi P. americana kurulmuş bir model organizmadır.

Bir hava puf ile cerci tüyleri uyarılması ya da abdominal gangliyon veya Cercal sinir kendisi (Şekil 8) arasında bağlaçlar bağlı hücre-dışı emme elektrodu kullanarak kaydedilebilir birincil duyu nöronlarının deşarj olur. Iki bölgeden kaydedilen Spike genlikleri milivoltluk birkaç mikro volt düzeyindedir. Çünkü ganglionunda sensor entegrasyon bileşiği, aksiyon potansiyeli veya Cercal sinir kaydedilmiş ayrı sivri uçlar halinde görülmektedir sivri uçların sayısı bağlaçlar gelen kayıtları gözlenen göre oldukça büyüktür. Bununla birlikte aynı zamanda nedeniyle, elektrot ve sinir doku arasındaki sıkı conta için bağ olarak kayıt esas olarak daha az gürültü olduğuna dikkat edin. Cerci geniş sivri de hava şişirme tarafından connectives (Şekil 8A) görülebilir. Bu teşvik edici bir yöntem kullanılarak, A3 ve A4 arasındaki tipik kayıtları<html> ly dev interneuron (ler) büyük bir başak özelliği göstermektedir. Fiziksel forseps ile Cerci sürtünme sırasında bir Cercal sinirden kayıt aktivitesinin güçlü bir büstünü (Şekil 8B 1) üretti. Başka bir kayıtta, hava 2 puflar her Cercal sinir hızlı bir kırmak yanıt (Şekil 8B, 2) üretilir. Elektrik A3 ve A4 arasındaki bağ bir emme elektrodu ve kayıt ile Cercal sinir uyarıcı zaman, bir (Şekil 8C 1) ile uyarılmış uyarılmasında bir eşik gözlemleyebiliriz. Cercal sinirin elektrik stimülasyonu açık bir sıcaklık gibi farmakolojik maddeler veya yerel çevresel çevreleyen ile manipülatif çalışmalar için tayin edilebilir connectives bir yanıt (Şekil 8C 2) ortaya çıkarır. <html> fig1.jpg &quot;/&gt; Bozulmamış cerci Şekil 1. Periplaneta americana. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> Şekil 2. Kaldırıldı ventral manikür ile görülen hamamböceği sinir kordonu alttan görünüşü (A). Oklarla belirtilen segmentinin bir büyütülmüş görünüşüdür (B) &#39;de görülmektedir. (C) olarak, bağlayıcılar, cam sonda ile A4 ve A3 arasında dökülen edilmiştir. 6. karın ganglion iki Cercal sinirler kaudal sonunda bırakarak ile (D) gösterilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> Şekil 3.. Hamamböceği sinir kordonu şematik ventral görünümü. YS &quot;&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> Şekil 4. Cerci tuzlu banyo dışına yukarı konumlandırılmış. Açıldı karın dışarı Cerci tutmak için silikon elastomer küçük bir kama şeklinde bir parça ile yükseltilmektedir roach kaudal ucu ile tuz (A) ile sular altında olabilir Banyonun (B). <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> Şekil 5. (Oklarla belirtilen) Cercal sinir ile 6 inci karın ganglion. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> Şekil 6. Ekipman kurmak. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">lar görüntülemek için buraya tıklayın</a>ger rakam. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> Şekil 7. Uyarıcı ve kayıt elektrot kurmak. <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> Şekil 8.. Çeşitli uyarım işlemleri ile connectives ve Cercal sinir Sinir kayıtları. Cerci de hava şişirme ise A3 ve A4 arasındaki connectives bir emme elektrot ile Kaydı (A). Fiziksel (B 1) sürtünme veya Cercal sinir faaliyet hızlı patlamaları hava ponponları (B 2) sonuçlarını sağlayan ya da bir emme elektrot ile birincil Cercal nöronlardan kayıt. Elektrikle Cercal sinir uyarıcı (connectives yanıtları üretir <strong&gt; C = 1). Uyarıcı yoğunluğunda kademeli bir artış (oklar uyarıcı dışlayıcı genliğini gösterir) ve aşağıdaki uyarılmış tepkilerinin şiddetini dikkat edin. Cercal sinirin elektriksel stimülasyon tepkileri (C2) ölçülmesi için uyarılması tutarlılık için Cercal sinir uyarıcı, nispeten daha kontrollü bir araç sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System at JoVE.com

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Bu makalede, hamamböceği ventral sinir kablosu diseksiyonu ve Cercal sinir ve bağlaçlar hücre dışı kayıtları açıklar. Uyarılmış tepkiler Cercal sinir veya cerci doğrudan mekanik uyarma elektriksel stimülasyon tarafından oluşturulur.

Sinir Devre Kaydı bir Bozulmamış Hamamböceği Sinir Sistemi

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.2K Görüntüleme.  University of Kentucky.  Bu makalede, hamamböceği ventral sinir kablosu diseksiyonu ve Cercal sinir ve bağlaçlar hücre dışı kayıtları açıklar. Uyarılmış tepkiler Cercal sinir veya cerci doğrudan mekanik uyarma elektriksel stimülasyon tarafından oluşturulur. 

Video: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Çok Renkli Sinir Devre Topografya Revealing

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Nörobilim

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...