Yazarlar Şekil 1 ve yardım ve tartışma için laboratuvarın diğer üyeleri embriyonun kafaları göstermek için Irene Choi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe DE012728 (TW) tarafından desteklenmektedir

1. Dispase II hazırlayın <ol><li> Hazırlama taze Hepes-tamponlu salin (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). 16.8 ml Ultra Saf H 2 O içine 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7.4 ve 1.2 ml 2.5 M NaCl ekle </li><li> 10 mg / ml dispase II olun. 0.2 g dispase II (Roche, Kedi # 4942078001) tartılır ve 20 ml HBS içinde çözülür. Uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de bireysel Eppendorf tüpleri ve mağaza içinde 1.0 ml alikotları hazırlayın. </li><li> Kullanımdan önce PBS içinde 10 mg / ml dispase II 1:10 seyreltin. Buz üzerinde seyreltilmiş dispase II koyun. </li></ol> 2. Hamile Kadın CD-1 E10.5 Embriyolar teşrih Tüm hayvan deneyleri Colorado Denver Üniversitesi (UCD) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde yapıldı. CD-1 (ICR) fareler Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) elde edildi. <ol><li> % 70 etanol ile diseksiyon alanı ve araçları temizleyiniz. </li><li> Approv kullanarak hamile CD-1 kadın Euthanizeed protokolleri. </li><li> % 70 etanol ile karın püskürtün sonra karın açın. Rahim mesometrium uzakta gözyaşı rahim ve başka bir çekmek için forseps bir set kullanın. Gövde, uterus çıkarın. Karın diğer tarafında uterin horn için tekrarlayın. </li><li> Kısaca kan yıkamak için 10 cm Petri kabındaki buz PBS ile rahim durulayın. </li><li> Buz gibi soğuk PBS ile bir yeni bir Petri kabı içine rahim aktarın. Implantasyon siteler arasında keserek tek embriyo parçalara ayırın. </li><li> Bir stereomikroskop altında buz gibi soğuk PBS içine bir embriyo transfer. Yolk kesesi ile embriyonun maruz kesim sitelerinden birini başlayan rahim kas duvarı yırttınız ince forseps kullanın. Yolk kesesi ve amniyon soyun. Buz PBS ile 6 cm Petri kabı disseke embriyo transfer. Tüm embriyolar bu şekilde toplanan edilene kadar devam edin. </li></ol> 3. Dispase II Tedavisi <ol><li> 6-santimetrelik bir petri tabağına PBS ile tüm embriyolar yıkayın. DeğiştirmekPBS içinde seyreltilmiş 10 mL dispase II ile PBS ile yıkandı. 25 dakika boyunca 37 ° C&#39;de Petri kabı ve inkübe Kapak - bakteriyel bir inkübatör veya sıcak bir odada yeterli olmalıdır - bu adım için bir CO 2 doku kültürü inkübatör kullanmadım. </li><li> Petri kabı çıkarın ve bir stereomikroskop altında embriyo gözlemlemek. Ektoderm gevşek olması gerektiği, bu doku tabakası ve altta yatan mezenşimi arasında açık bir uçurum tiplemesindeki. Aksi takdirde, 37 bir ek 5 dakika ° C de inkübe Sonra buz üzerinde Petri kabı koyun. </li></ol> 4. Bozulmamış Yüz çıkıntıların üzerinden teşrih <ol><li> (VWR, Kedi # 14.672-380) atılabilir cam pipet kullanın Bir stereomikroskop altında bir dispase II 6-santimetrelik bir petri tabağına buz gibi soğuk PBS içine embriyo tedavi aktarmak için. </li><li> Embriyo tutmak için forseps bir çift kullanın. Kafa ve yüz çıkıntıların sınırları (Şekil 1 sınırlarını göstermektedir kesmek için dikkatli bir şekilde ince forseps bir çift kullanımıyüz çıkıntıları). Bir MNP bir tarafında, daha sonra MXP, ve son olarak FNP başlatın. Bozulmamış üzerinden yüz çıkıntıları (Şekil 2A) incelemek için diğer tarafa aynı işlemi uygulayın. </li></ol> 5. Mesenchyme Ayrı Yüz Ektoderm <ol><li> 3x çalışma mesafesi ile bir stereomikroskop altında yüz çıkıntıları gözlemleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı 5 kez yüz çıkıntıları Pipeti uzun bir cam Pasteur pipeti kullanın. Bundan sonra, ektoderm soyulmasına kolaydır. </li><li> Yüz çıkıntıları tutun forseps bir çift kullanın. Çok yavaş ektoderm kalkmasına forseps diğer çifti kullanın. Şekil 2B yüz ektoderm ayrılmış sayfaları gösterir. </li><li> Buz PBS ile bir 1.5 ml Eppendorf tüp içine yüz ektoderm aktarmak için yeni bir uzun cam Pasteur pipeti kullanın. Buz PBS ile başka bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne mezenşimi aktarın. </li><li> Her diseksiyon için yeni buz soğuk PBS kullanın. Örnekleri toplayın. </li><li> T yıkayınPBS ile o örnekleri. 4 ° C, 3 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Uzun cam Pasteur pipetler kullanarak PBS aspire. Örnekler ChIP tahlil için kullanılacak ise, 6.1 adım devam edin. RNA ekstraksiyonu için 6.2 adıma geçin. Protein ekstraksiyonu için 6.3 adıma geçin. </li></ol> 6. Daha Deney için Proses Örnekleri <ol><li> ChIP tahlil için örnekler <ol><li> Çapraz bağ ile% 1 formaldehit ile 1 ml PBS ekleyin. Örnekler homojenize edilir. </li><li> Rotasyon ile 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Tepkimeye girmemiş formaldehit gidermek için her tüpe 1.25 M Glisin 110 ul ekleyin. </li><li> Karıştırılır ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 3 dk için 4 ° C sıcaklıkta 500 x g&#39;de Spin. Süpernatantı. </li><li> Dokulara yıkamak için 1 ml soğuk PBS ekleyin. </li><li> 3 dk için 4 ° C sıcaklıkta 500 x g&#39;de Spin. </li><li> PBS çıkarın ve PBS kez yıkayın tekrarlayın. </li><li> Süpernatantı, sıvı azot içinde doku dondurma oturtun. Sa Mağaza-80 ° C daha sonraki havuzu ve işlenmesi için mples. </li></ol></li><li> RNA ekstraksiyonu için Örnekler <ol><li> RNAlater (Ambion) ihtiva eden tüplerde yüz ektoderm ve mezenşimi yerleştirin. </li><li> ° C doku tam nüfuz izin vermek için gece boyunca 4 RNAlater Çözelti, numuneyi inkübe edin. </li><li> Sonraki havuzu ve işlenmesi için -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Protein ekstraksiyonu için Örnekler </li></ol> Sonraki işlemler için örnek lizis tamponu ekleyin. Veya sıvı azot içinde doku dondurma oturtun. -80 ° C daha sonraki havuzu ve işlenmesi için örnekler saklayın. Notlar <ol><li> Zaman kısıtlamaları. Yoluyla diseksiyon baştan Bölüm 6 başlangıcına 4-6 saat üzerinde planlayın. </li><li> Zaman yetkin, bu bölümleri 4 ve 5 (öne diseksiyon ve ektoderm ayırma) gerçekleştirmek için embriyo başına ~ 10-15 dakika sürer. </li><li> Örnekleri RNA izolasyonu, her eriyik için isen ilk Diethylpyrocarbonate ile tedavi edilmelidir. Ayrıca forseps and Away RNaz ile çalışma alanı temizleyin. </li><li> Dispase II tedavi ve diseksiyonu dışında her zaman buz üzerinde örnekler tutun. Diseksiyon için kullanılan PBS soğuk olduğundan emin olmak için her diseksiyon için yeni buz PBS değiştirin. </li><li> Sharp forseps hassas diseksiyon elde etmek için önemlidir. Herhangi bir bulaşmayı önlemek için tamamen forseps temizleyin. </li><li> Farklı çıkıntıların örnekler toplamak için dispase II tedaviden sonra ayrı ayrı öne teşrih. Sonra ektoderm ve mezenşimi ayırın. </li><li> Dispase II ile tedaviden sonra, yüz ektoderm soyulmasına kolaydır. Diğer ektodermden kontaminasyon özellikle dikkat edin. Tüm potansiyel olarak kontamine doku atın. </li><li> Sonra örnekleri 6. Bölümde uygun noktaya ulaşana kadar durmak yok, başlar. Yüz ektoderm ayrılması bitirin ve elinizden geldiğince hızlı olarak tüm embriyolar için mezenşimin. </li><li> Edispase II nzyme faaliyetlerini gruplar ve markalar arasında farklı olabilir. Farklı marka ve dispase II partiler için tedavi süresini ayarlamak için gereklidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation.">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li><li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate:+usefulness+and+caveats+of+mouse+models.">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li><li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts.">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li><li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis.">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodermal+WNT/&#946;-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face.">Ectodermal WNT/&#946;-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences.">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066 (2009).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li><li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+mouse+Zic1,+Zic2,+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation.">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li><li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development.">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması veya bu makalenin içeriği ile ilişkili diğer çatışmalar var.

Bu protokol, bir ilk dispase II işlenme adımını esas fare embriyonik yüz ektoderm ve mezenşim ayırmak için basit bir yöntem sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarda, önceden dispase II tedavi yüz çıkıntıları diseksiyonu uygulandı, ama biz sürekli mezenşimi &quot;yapışkan&quot; ve işlemek için daha zor hale gelmesidir bulduk. Bizim yeni protokol bu sorunu önler. Kombinasyon dispase II aşağı yukarı pipetleme ve tarafından nazik fiziksel gücü ile tedavi ektoderm ve kolay mezenşimi ayrı...

<table><tbody><tr><td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 &amp;deg;C . </td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr></tbody></table>

separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme

Orofasiyal yarıkların 1000 bebekten dünya çapında 1,2 1,5 etkileyen en sık kraniofasiyal defektlerin vardır. Orofasiyal yarıklaşmanın anormal yüz gelişme 3 neden olur. Yüz insan ve fare, ilk büyüme ve desenlendirme içindeki doku birkaç küçük tomurcukları, 4,5 yüz çıkıntıları dayanır. Eşleştirilmiş frontal burun süreçler (FNP), maksiller çıkıntıların (MXP) ve mandibular çıkıntıların (MdP): yüz altı ana çıkıntıların türetilmiştir. Bu çıkıntılar bir örten epitel kaplı bulunmaktadır mezenşimi ve şişlikler oluşur. Birden fazla tür çalışmalar yüz ektoderm ve mezenşimi arasındaki karışma sinyal yüzünü 6 şekillendirme için kritik olduğunu göstermiştir. Ancak, bu sinyal röleleri Genlerdeki ilgili mekanistik ayrıntıları eksiktir. Bir gen ekspresyonu kapsamlı bir anlayış kazanmak için bir yol, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve develo ile ilişkili kromatin işaretleriping yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılmış doku kompartmanları izole ve karakterize etmektir. Burada embriyonik gün (E) 10.5, çıkıntıların füzyon öncesinde fare yüz oluşumunda kritik bir gelişimsel aşamada yüz ektoderm ve mezenşimi ayırmak için bir yöntem mevcut. Bizim yöntemi daha önce yüz çıkıntıları 7 diseksiyon için kullanmış yaklaşımı uyarlanmıştır. Bu önceki çalışmada kendilenmiş C57BL istihdam vardı / Bu zorlanma gibi 6 farelerin genetik, genomik ve yüz morfolojisi 8 için bir standart haline gelmiştir. Burada, buna rağmen, uygun bir doku daha sınırlı miktarlarda nedeniyle, biz hayvancılık için, daha sağlam satın almak daha ucuzdur outbred CD-1 suşu kullanılmıştır ve herhangi kendilenmiş daha çöp başına daha fazla embriyo (12-18) üretmek eğilimi var fare zorlanma 8. Embriyo izolasyon takiben, nötr proteaz dispase II bütün embriyo tedavi etmek için kullanılmıştır. Sonra, yüz çıkıntıları teşrih edildied dışarı ve yüz ektodermden mezenşimi ayrıldı. Bu yöntem, yüz ektoderm ve mezenşim her ikisi de bozulmadan muhafaza eder. Bu yöntemi kullanarak elde edilen örneklerin protein tespiti, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tayini, mikroarray çalışmalar ve RNA-seq dahil teknikleri kullanılabilir.

Dispase II Tedaviden sonra, embriyonun ektoderm gevşek olma eğilimindedir. Yüz çıkıntıları diseksiyonu (Şekil 2A) sonra sağlam olmalıdır. İzole yüz ektoderm net ve mezenşimi doku (Şekil 2B) ücretsizdir. Protokolünün etkinliğini belirlemek için ve biz önbeyin için tahlil çapraz kontaminasyon tespit Zic3 9, ektodermal belirli cdh1 5 ve ters transkriptaz PCR kullanarak mezenkimal belirli sox10 10 dile getirdi. Çalışmalarımız yü...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Embriyo yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılması için bir protokol tanımlanmıştır. Biz, ilk bütün embriyolar tedavisinde tüm yüz çıkıntıları üzerinden incelemek dispase II kullanın ve sonra yüz ektoderm ve mezenşimi ayırın.

Fare Embriyonik Yüz Ektoderm ve mesenchyme ayrılması

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

separation-of-mouse-embryonic-facial-ectoderm-and-mesenchyme

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Embriyo yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılması için bir protokol tanımlanmıştır. Biz, ilk bütün embriyolar tedavisinde tüm yüz çıkıntıları üzerinden incelemek dispase II kullanın ve sonra yüz ektoderm ve mezenşimi ayırın.

Video: Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biyoloji

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Gelişim Biyolojisi

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Nörobilim

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and fusion above the tongue. Defects in this process lead to cleft palate, a common birth defect. Recent studies have shown that palatal shelf elevation involves a remodeling process that transforms the orientation of the shelf from a vertical to a horizontal one. The role of the palatal shelf mesenchymal cells in this dynamic remodeling has been difficult to study. Time-lapse-imaging-based quantitative analysis has been recently used to show that primary mouse embryonic palatal mesenchymal (MEPM) cells can self-organize into a collective movement. Quantitative analyses could identify differences in mutant MEPM cells from a mouse model with palate elevation defects. This paper describes methods to isolate and culture MEPM cells from E13.5 embryos-specifically for time-lapse imaging-and to determine various cellular attributes of collective movement, including measures for stream formation, shape alignment, and persistence of direction. It posits that MEPM cells can serve as a proxy model for studying the role of palatal shelf mesenchyme during the dynamic process of elevation. These quantitative methods will allow investigators in the craniofacial field to assess and compare collective movement attributes in control and mutant cells, which will augment the understanding of mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation. Furthermore, MEPM cells provide a rare mesenchymal cell model for investigation of collective cell movement in general.

We present a protocol for isolation and culture of primary mouse embryonic palatal mesenchymal cells for time-lapse imaging of two-dimensional (2D) growth and wound-repair assays. We also provide the methodology for analysis of the time-lapse imaging data to determine cell-stream formation and directional motility.

Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA sequencing and primary cell culture). Yielding viable, healthy cells in large quantities is critical, and the optimal conditions to do so are tissue dependent. Cell populations in the tongue epithelium and underlying mesenchyme/connective tissue are heterogeneous and tissue structures vary in different regions and at different developmental stages. We have tested protocols for isolating cells from the mouse tongue epithelium and mesenchyme/connective tissue in the early developmental [embryonic day 12.5 (E12.5)] and young adult (8-week) stages. A clean separation between the epithelium and underlying mesenchyme/connective tissue was easy to accomplish. However, to further process and isolate cells, yielding viable healthy cells in large quantities, and careful selection of enzymatic digestion buffer, incubation time, and centrifugation speed and time are critical. Incubation of separated epithelium or underlying mesenchyme/connective tissue in 0.25% Trypsin-EDTA for 30 min at 37 &#176;C, followed by centrifugation at 200 x g for 8 min resulted in a high yield of cells at a high viability rate (&#62;90%) regardless of the mouse stages and tongue regions. Moreover, we found that both dissociated epithelial and mesenchymal/connective tissue cells from embryonic and adult tongues could survive in the cell culture-based medium for at least 3 h without a significant decrease of cell viability. The protocols will be useful for studies that require the preparation of isolated cells from mouse tongues at early developmental (E12.5) and young adult (8-week) stages requiring cell dissociation from different tissue compartments.

We have developed a generalized protocol to dissociate a large quantity of high-quality single cells from the epithelium and mesenchyme/connective tissue of embryonic and adult mouse tongues.

Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens act in a concentration- and time-dependent manner to specify distinct transcriptional programs that instruct and reinforce cell fate. One mechanism by which appropriate morphogen signaling thresholds are ensured is through delivery of the signaling proteins by specialized filopodia called cytonemes. Cytonemes are very thin (&#8804;200 nm in diameter) and can grow to lengths of several hundred microns, which makes their preservation for fixed-image analysis challenging. This paper describes a refined method for delicate handling of mouse embryos for fixation, immunostaining, and thick sectioning to allow for visualization of cytonemes using standard confocal microscopy. This protocol has been successfully used to visualize cytonemes that connect distinct cellular signaling compartments during mouse neural tube development. The technique can also be adapted to detect cytonemes across tissue types to facilitate the interrogation of developmental signaling at unprecedented resolution.

Here, an optimized step-by-step protocol is provided for fixation, immunostaining, and sectioning of embryos to detect specialized signaling filopodia called cytonemes in developing mouse tissues.

Sitonem analizi için embriyonik fare dokusunun fiksasyonu

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Fare Embriyonik Yüz Ektoderm ve mesenchyme ayrılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler