Bu çalışmaya katkıda ve en Yapısal Membran ve Fonksiyonel Biyoloji Grup, geçmiş ve şimdiki üyeleri hem birçok kim vardır. Tüm etmek bizim en içten teşekkürlerimizi ve şükranlarımızı. Bu eser Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM75915, P50GM073210 ve U54GM094599) ve FP7 COST Action CM0902 hibeleri ile kısmen desteklenmiştir.

1. Kristalleşme Plaka hazırlama Robotik bir kristalleşme deneme yapmak için ayarlama referans 2 ayrıntılı olarak açıklanan cam kristalleşme sandviç plaka (Şekil 2), ve temel levha hazırlanması ile başlar. Taban plakası ilk Silanlanmış olmalı ve kuyuları oluşturur delikli çift sopa boşluk, plaka uygulanması gerekir. Bunun için gerekli malzeme ve sarf malzemeleri Malzeme altında maddeler halinde sıralanır. <ol><li> Bir kağıt havlu üzerine plaka yerleştirin, çözüm silanizing birkaç damla uygulayın ve bir kağıt mendille plaka yüzeyi üzerinde eşit biçimde dağıtın. </li><li> Su bir behere plaka daldırarak aşırı silanizing çözüm çıkarın. </li><li> Beher plaka çıkarın, kuru bir kağıt havlu, Silanlanmış tarafta o kadar yerleştirin ve kağıt havlu ile hafifçe silerek kendi yüzeyidir kurulayın. </li><li> Delikli, çift-çubuk boşluk üzerinde koruyucu kapak soyunve cam levha kuru, Silanlanmış yüzeye, spacer, yapışkan tarafı aşağı geçerlidir. Boşluk sol üst köşesinde ve spacer bitişik iki ve çakışık plaka ile taban plakası üzerine doğru şekilde yerleştiğinden emin olun. </li><li> Taban plakası üzerinde boşluk düzleştirmek için ve aralarında sıkı bir mühür oluşturmak için bir rulo veya brayer kullanın. </li></ol> Önceden birleştirilmiş plakaları (; MD11-55-100, moleküler boyutları; ve LCP96T-UVP70U, Swissci HR3-151, Hampton Research), ticari olarak mevcuttur. Maliyet nedenlerden dolayı, yukarıda protokolü takip kendi plakaları monte tercih. 2. Mezo Robot 1&#39;de Bu video madde olarak gösterilmesi için mezo robot içinde ilk olarak şu anda MS &amp; FB grubu (Şekil 3) de kullanılan biridir. Robotun tüm ayrıntıları Malzemeler altında ve Referans 5. bölümünde bulunabilir. Malzeme ve equipment Malzeme altında maddeler halinde robot kullanarak bir kristalizasyon deneme kurmak için gereklidir. <ol><li> Robotun güvertede Bölüm 1 &#39;de hazırlanan boşluk ile taban plakası yerleştirin. Bu taban plakası uyum amaçları için iyi bir pozisyon ile işaretlenmiş kendi platformuna sahiptir. Plaka tanımlama amaçlı etiketlenmiş olmalıdır. </li><li> Kristalleşme plakasının yanına robot güvertesinde kendi platformunda 96-çöktürücü blok sabitleyin. </li><li> Plastik sızdırmazlık kapağı soyulması tarafından dikkatle blok açın. </li><li> Nemlendirici açın ve robot güverte taban plakası üzerinde ve genelinde nemli hava akışı yönlendirmek. Nemlendirici çökelti çözeltisi buharlaşmasını azaltmak için ve kristalleşme plaka 5 üzerinde tekrarlanabilirliğini artırmak için gösterilmiştir. Bu Mezofaz ve dağıtım başlamadan hemen önce, aksi takdirde ortam bağıl nem düşük olduğunda alanı önceden nemlendirmek veya önceden açık olarak set-up açılabilir. </li><li> Üreticinin yönergelerini takip robotu başlatılamıyor. Tam prosedürler zamanla değişecektir çünkü Enstrüman özgü talimatlar burada ayrıntılı olarak tarif edilmeyecektir. Esasen, ne başlatılıyor sırasında olur robot kolu dağıtım Mezofaz üç ortogonal yönde X, Y ve Z yönünde referans konumları ile sağlanan olmasıdır </li><li> Robotun Kol 1 (Şekil 3), iğne dağıtım ile tam bir Hamilton şırınga protein yüklü Mezofaz takın. Şırınga içine yüklemek için Mezofaz ve nasıl hazırlamak için nasıl tam ayrıntıları Kaynaklar 3,7-10 tarif edilmiştir. </li><li> Kristalizasyon taban plakası üzerinde boşluk gelen üst koruyucu kapağı çıkarın ve taban plakası platformda fiducials ile plaka üzerinde kuyular hizalayın. Not, bu video amacıyla, koruyucu kapak hizalama basamağı sırasında Görüntüleyici yardımcı olmak üzere yer bırakılmıştır. </li><li> Dozaj syring bir iğne ucu hizalamakristalleşme plaka (O A1) sol köşesinde iyi üstteki alt sahip e. Bu iğne ucu da alt söz konusu ne kadar yakın izlerken dağıtma kolunun yükseklik ya da Z-koordinat ayarlayarak göz tarafından yapılır. Ucu sadece kuyunun dibinde dokunuyor Bu dağıtım kolunun yüksekliğini ayarlayarak çok hafif iken platformda yan yana plaka taşıyarak karar olabilir. </li><li> Bilgisayara uç temas plakası dağıtma kolunun Z-koordinat girin. Dağıtıcı 80 mikrometre bu referans baz plakasının yüzeyine karşılık gelen Z-pozisyonundan iğne ucu ile yer almak üzere programlanmıştır. </li><li> Göz de A1 merkezinde iğne ucu ile yerleştirin. Kontrol bilgisayarı referans X, ucu merkezli dağıtım kol Y koordinatı saklayın. Bu koordinat levha üzerinde kalan kuyu merkez tanımlamak için kullanılır. </li><li> Prtaze mezofaz sağlamak için robot bilgisayarda uygun komutu kullanılarak ime şırınga ve iğne dağıtıcı birinci ve bunu takip eden kuyular mezofaz bunların tamamlayıcı almasını doldurur. Bir doku ile iğnenin ucunda çekilmiş Mezofaz siliniz. </li><li> Robotun Kol 2 çöktürücü dağıtım ipuçları yıkanır ve çöktürücü blok çözümler aspire hazırlanan adımları kızarma yuvarlak başlatmak için Run Robot (X-AP) programını başlatın. </li><li> Etkinleştir hareket çöktürücü çözümleri (genellikle 800 nl) izledi ilk protein yüklü Mezofaz (genellikle 50 nl), bir seferde sekiz kuyu bir sütun ile kuyu sıralı yükleme ayarlamak için robot işlevini dağıtmak. Yükleme sütunları arasında, iğnenin ucundaki bir yerleştirilen bir park konumuna mezofaz dağıtma kolu döner kurumasını ucunda mezofaz önlemek için sünger ıslattı. Dağıtım Mezofaz ve çöktürücü süreci tekrarlanırPlaka üzerinde 11 kez plaka dolana kadar. Mezofaz ve çöktürücü ile bir 96-kuyulu plakanın yükleme tamamlamak için 5 dakika sürer. </li><li> Plaka doldurulur ve robot kollar kendi parkta konumlarına geri dönmüşlerdir bitmez, robot güverte plakasını çıkarın ve düz bir katı yüzey üzerine yerleştirin. </li><li> Derhal, iyi kompozisyon zamana bağımlı değişiklikler en aza indirmek için bir kapak-cam plaka mühür. Bu kapak cam taban plakası ile kare hizalanmış ve kapak cam hiçbiri taban plakasının izi ötesinde olduğunu, 96 kuyu tamamen kapalı olduğundan emin olmak için önemlidir. Bir silindir veya brayer kapak camı ile boşluk arasında sıkı ve eşit bir mühür oluşturmak için kullanılır. </li><li> Olması gerektiği gibi set up gitti emin olmak için plakasını kontrol edin. Ne bir arayan her kuyuda görünümü &#39;Bir tavada kızarmış yumurta&#39; dir. Kızarmış yumurta sarısı mezofaz karşılık gelir. Yumurta ve beyaz bir çökeltici madde solutive pan kenarına iyi kristalleşme çevre uzunluğudur. İdeal olarak, üç konsantrik vardır. </li><li> Kristal büyümesi için sıcaklık kontrollü bir depolama alanı içinde plaka yerleştirin. </li><li> Artık plakaları kurmak isteniyorsa, robot güverte çöktürücü bloğu kaldırmak, sıkıca kapatın ve depolama içine geri koymak. </li><li> Robotun dağıtım kolundan Mezofaz içeren şırınga çıkartıp parçalayarak, bir sonraki kullanım için hazırlık metanol ve kuru dikkatlice dağıtım iğne ve yüksük gibi parçaları, yıkayın. </li></ol> 3. Mezo Robot 2&#39;de. Sivrisinek LCP Sivrisinek LCP robot (Şekil 4) Robot 1 tarafından kullanılana benzer bir mezofaz dağıtıcı içerir. Robot 1 aksine olarak, tek kullanımlık uçları ile çökeltici madde dağıtır. Programlama yazılımı özellikle kristallenme tabak ve precipit çalışmak için araç ayarlamak için kullanılırkarınca blok ve belirli bir sırayla Mezofaz ve çöktürücü kullanıcı tanımlı birimler dağıtmak için. Bu gibi ayrıntılar üreticisi tarafından sağlanan ve burada tarif edilmeyecektir. <ol><li> Gibi Robot 1 altında ve Jüpiter madde 1712 1, içinde açıklanan iğne ile birlikte ve protein yüklü mezofaz ile doldurulmuş bir şırınga Hamilton, hazırlayın. </li><li> Robotun dağıtım kolunda pozisyonda şırınga Kelepçe. </li><li> Güverte kullanın X ve dağıtım şırınga iğne Y koordinatları kurmak için lazer sensörü monte. Bu mezofaz plaka üzerindeki her bir kuyucuğa merkezine doğru sürülür sağlamak için gereken önemli bir adımdır. </li><li> Kontrol paneli üzerindeki bir düğmeye dokunarak, asal şırınga iğne Mezofaz sınırdışı. Kuyu yüklemek için robot kullanarak hazırlık bir doku ile iğne ucundan ekstrüde Mezofaz çıkarın. </li><li> Robot nemli güvertede kristalizasyon plaka yerleştirmeden öncekapilarite tarafından yerinde plaka tutma yardımcı olmak için su ile bir kaç damla platform yüzeyi en. </li><li> Cam taban plakası üzerinde boşluk koruyucu kapağı çıkarın ve iyi yapışma sağlamak için sıkıca platform üzerine yerleştirin. Böylece dağıtım iğne ucu ile ilgili olarak plaka kuyuları doğru konumlandırılmasını sağlayabilir 3 köşe kuyu hizalamak için platform üzerinde üç fiducials kullanın. Cihaz artık bir dağıtım döngüsü girmek için komut verilir. </li><li> Döngüsü Mezofaz taze Mezofaz ile kuyu yüklemeye geçmeden hemen önce, küçük bir cam plaka üzerine sürülür, ikinci bir astar adımla başlar. Sonra robot ilk Mezofaz plaka üzerinde 8 kuyu dikey bir sütun ile yükler ve Mezofaz bolus üstüne çöktürücü solüsyonu dağıtmak için tek kullanımlık uçları kullanır. Bütün yuvalara dolana kadar işlem plakasının uzunluğu boyunca 11 defa tekrarlanır. Tüm süreci tamamlamak için yaklaşık 5 dakika sürer. </li><li> Çıkarmakdolu robotun platformunda, plaka ve Robot 1 altında yukarıda tarif edilen bir kapak camı ile izole edin. </li><li> Kristal büyümesi için bir sıcaklık kontrollü bir ortam içinde, uygun şekilde etiketlenmiş, plaka yerleştirin. </li></ol> 4. Mezo Robot 3&#39;te. Gryphon LCP Gryphon LCP robot (Şekil 5) robot 1 ve 2 için yukarıda anlatılana benzer bir mezofaz dağıtma sistemini içerir. Ne diğer iki ayıran 96 Çöktürücü çözümleri eşzamanlı reçete olmasıdır. <ol><li> Protein yüklü mezofaz hazırlayın ve robot 1 ve 2 uyarınca, yukarıda tarif edildiği gibi, dağıtma şırınga içine yükleyin ve Jüpiter madde 1712 1. </li><li> Robotun dağıtım kolunda pozisyonda şırınga Kelepçe. </li><li> Robotun güvertesinde çökelti çözeltisi blok ve kristalizasyon plakası yerleştirin. </li><li> 96-ucu hea yükleyinÇöktürücü çözümleri ile d. Bir kullanıcı tanımlı gecikme süresi viskoz presipitanlar aspire kolaylaştırmak için sağlanmıştır. </li><li> Bir dağıtım döngüsü girmek için alet komutu. Döngüsü mezofaz tamamlanması için yaklaşık 1 dakika süren bir süreç içinde 96 kuyu içine ardışık olarak dağıtılmış olması ile başlar. 96-ucu kafası sonra kristalizasyon kuyularda Mezofaz bolus üstüne kerede 96 Çöktürücü çözümler dağıtır. Tüm plaka yükleme işlemi 2 dakika içinde bitti. </li><li> Robot platformu dolu plakasını çıkarın ve Robot 1 altında yukarıda belirtildiği gibi bir kapak-cam ile kapayın. </li><li> Kristal büyümesi için bir sıcaklık kontrollü bir ortam içinde, uygun şekilde etiketlenmiş, plaka yerleştirin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bu video makalenin amacı bir viskoz, cam toplam yüzeyi membran proteini yüklü Mezofaz ile otomatik kristallendirme çalışmalarında nasıl kurulacağını göstermek içinh 96-kristalleşme plakaları. Vurgu az manuel müdahale gerektiren uzmanlaşmış robotlar aracılığıyla otomasyonu üzerinde. Bir robot kullanıldığında Mezofaz ve çöktürücü kalmaması ve iyi içinde hem yerleştirme, hacimleri açısından Tekrarlanabilirlik ve hassasiyet, bekleniyor. Bu crystallogenesis destekleyen şartlar etkin tarama bakış açısından önemlidir. Ayrıca görüntüleme cihazları ile genellikle yapılır kristal büyümesini değerlendirmektir analiz boru hattı sonraki adım için kritik öneme sahiptir. Damla veya bolus konumu görüntüleme sürecinin anahtarı olduğu ve kuyuya bolus düzensiz ve yanlış yerleşimi genellikle düzeltmek için kullanıcı müdahalesi gerektirir ve zaman alır. Örnekleme amaçları için, uygun bir şekilde ve doğru bir biçimde yüklü levha örnekleri Şekil 6 &#39;da gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> <html> Şekil 1. Akış mezo-yetiştirilen membran protein kristalleri üretimi, hasat ve kriyo-soğutma dahil adımları özetlemektedir. Kesikli kırmızı çizgi ile çevrili Adımlar Bu Jove makalenin odak vardır. Robotlar Adımlar 29-32 yılında Mezofaz ve çöktürücü çözümleri dağıtmak için kullanılmıştır. Referans 3 Gönderen. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. A tam yüklü ve mühürlü 96-cam sandviç kristalizasyon tabağı. Her iyi 50 nl kübik faz ve 1 ul çökelti çözeltisi içerir. Anlaşılır olması için, kübik faz Sudan Red ile boyanmış ve çökelti çözeltisi Metilen Blue içerir olmuştur. Referans 5 Gönderen. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 3 &quot;/&gt; Şekil 3. Mezo robotu (Robot 1). Robotun iki kolu var. Kol 1 dağıtır protein yüklü lipidik Mezofaz. Kol 2 Çöktürücü çözümler dağıtır. Dolum sırasında, 96-plaka kendisini hareketsiz robot güvertede pozisyonda sabit kalır. Iki kol Mezofaz ve çöktürücü çözümler sunmak için hareket. Referans 3 Gönderen. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Sivrisinek LCP robotu (Robot 2). Robot 1, 96-kuyulu plaka ve çökelti çözeltisi blok üzerine oturduğu Sivrisinek LCP ve güverte farklı olarak, dolum esnasında yatay olarak hareket eder. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Gryphon LCP Robot (robot 3). Bir sırasındakurmak, lipidik kübik faz dağıtıcı 96-plaka üzerine protein yüklü Mezofaz sunmak için hareket eder. Güverte sonra çökelti çözeltisi ucu başının altına plaka konumlandırmak için yatay çevirir. Tüm 96 Çöktürücü çözümleri aynı anda dağıtılır. Resim üreticisi (kaynaklı <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) ve etiketli. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6.. Bir tam yüklü ve mühürlü 96-cam sandviç plaka (A) ve uygun bir şekilde kuyu (B) ve uygun olmayan şekilde (C, D), mezo robot (Robot 1) kullanılarak doldurulur. In plaka üzerinde barkod etiketi bir plaka inkübatör / görüntüleme cihazı içinde plaka izlemek için kullanılır. Panellerde BD, çökelti çözeltisi ve Mezofaz sırasıyla P ve M, işaretlenir. Beklenen &#39;bir tavada kızarmış yumurta&#39;B iyi görünümü, bir uygun şekilde yüklenebilir ve sızdırmaz bir özelliğidir. C, çöktürücü bir off-merkezi konumda iyi düzgün akar olmuştur ve boşluk ile temas geldi. C, bu Mezofaz hacmi olması gerekenden daha az olduğunu da görünür. Çökelti çözeltisi ile tamamlanmamış yükleme için bir örnek ölçek için D&#39;de gösterildiği gibi, tüm kuyu çapı 6 mm &#39;dir.

<ol>
	<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501 (2011).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallization.">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li><li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II:+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping.">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li><li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution.">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li><li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis.">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography.">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video yazıda otomatik bir protein yüklü lipidik Mezofaz kullanarak 96-sıra cam sandviç plakaları mezo kristallendirme çalışmalarında kurmak için bir robot nasıl kullanılacağını göstermiştir. Bu çalışmada kullanılan orijinal olarak 7 robot özel olarak tarif edildiği gibi, viskoz ve yapışkan bir mezofaz nanolitre hacimleri doğru ve tekrarlanabilir bir dağıtımı için bir pozitif yer değiştirme cam şırıngaya içerecek şekilde tasarlanmıştır. Doğruluk ve hassasiyet bir robot önemli özellikleridir. Ancak, bu özellikleri robotun performansı değerlendirilir ve kalibrasyon gerçekleştirilir derece ve düzenlilik olarak sadece iyi. Bireysel plakaları kurmak edilirken robotun performansını değerlendirdi gerektiğini söylemeye gerek yok. Bu robotun kusursuz çalışır ve katılımsız çalıştırmak için robot bırakmak olduğunu varsaymak uygun değildir. Özenli ve dikkatli operatörü bir pos olmalıdırition bir ses falan düzgün çalışmıyor ve hemen düzeltmek için bir görünümü ile dikkat. Ayrıca, her plaka dikkatle en kısa sürede plaka mühürlü yanı içeriklerin bütünlüğü için göz tarafından kontrol edilmelidir ve kristalizasyon denemeleri için uzağa koymak önce. Bu sadece bir sonraki levha yüklenirken birkaç saniye gerçekleştirmek ve yapılabilir gerektirir. Fark, örneğin, özellikle kuyu tam dolu olmayan belirli bir çöktürücü boşaltım ucunu arızalı olduğu gerçeğini aydınlatabilir. Mezofaz teslim düzensiz olduğu görüldü olmalı, ilgili arızalı öğe hemen düzeltilmesi gerekir. Bu konularda dikkat ve kurulum sırasında ilgili ayarlamalar yaparak kadar değerli ve lipid membran proteini içeren, zaman ve malzeme tasarrufu olacaktır. Bir kamera kristal büyüme izlemek için kullanılırsa, doğruluk ve hassasiyet de görüntüleme sırasında izlenebilir. Damla veya hap ile Örneğin, sistematik problemlerkamera tarafından konumu bir şey doğru değildir ve protokol yerde akıntıya düzeltici eylem gerekli olduğunu gösterir. Güvenilir performans çıkarları nedenle robotu düzenli aralıklarla kalibre edilmeli ve gerektiği gibi. Kalibrasyonları çökeltinin kuyuya bolus ve Çöktürücü yerleşim yanı sıra teslim Mezofaz hacmi içermelidir. Açıkçası, mümkün kalibrasyon kalite kontrol egzersiz kapsadığı dönemde yapılan çalışmalarda kullanılacak benzer hacimleri ve malzemeler kullanılarak yapılmalıdır. Kalibrasyonu kadar önemlidir bu yüzden de stok robotu parçaları ve malzemeleri yeterli kaynağı yaşıyor edilir. Afet ve beklenmedik arızaları, tıkanıklıkları ve çöker ve meydana yapabilirsiniz. Böyle bir durumda, müsait bir yedek çöktürücü teslim ucu olan, örneğin, çok değerli bir zar proteini hazırlama gerektiği gibi kullanılmış olduğu anlamına olabilir veboşa değildir. Bir robotun avantajları bazıları aslında devamlı çalışmak ve yorgunluğu &#39;şikayet&#39; ya zarar vermez olacak gerçeğini içerir. Bir robot, aynı zamanda aydınlatma kontrollü ve çevresel şartlar altında, böyle karanlıkta insan dostu olarak kabul edilmez koşullar altında kullanılan ve aşırı sıcaklıklarda olabilir. Bu makale gösterilen robotlar tüm ~ 20 ° C&#39;de ortam koşullarında kullanıldı Ancak, proteinlerin ve non-ortam sıcaklığında, kontrollü 11,12 ışık ve bir oksitleyici veya indirgeyici bir ortamda 13. gerektirmez proje vardır. Bütün bunlar, bir kristalizasyon robot kullanılan göreceli olarak kolay olan, yiyecek ve içecek olabilir. Önceki bir Jüpiter Video yazıda mezo yöntemi ile kristallendirme çalışmalarında elle 1 kurmak nasıl gösterdi. El ile güvenilir bir şekilde vazgeçilebilir mezofaz arasında minimum hacmi b sınırlıdırçalışmaların oluşturulmasını kişinin y keskinliği görsel ve istikrarlı ellilik. Bizim tecrübelerimize göre, 100 nl gibi düşük Mezofaz hacimlerini kolaylıkla işlenir. Biz varsayılan hacmi 40 nl hakkında elle dağıtılan bir laboratuar biliyorum. Ancak, oldukça küçük hacimli bir robot kullanarak mümkündür. Bunların yanı sıra, 550 pikolitre gibi düşük mezofaz miktarlar robot 14 vazgeçilebilir olduğunu göstermiştir. Bu iş bakıldığında robot tarafından daha fazla minyatür uygulandığı takdirde, bir kristalizasyon deneme gerçekleştirmek için gerekli olan değerli zar proteini miktarının büyük bir azalmaya yol açacak olan, mümkün olduğu anlaşılmaktadır. Bu video makalede, üç ticari robotlar lipidik mesophases kullanarak high-throughput membran protein kristalizasyon göstermek için kullanılmıştır. Bunlardan ilk olarak Jove 1712 1 anlatılan manuel denemeler kurma tecrübesine dayanarak MS &amp; FB Grubu, geliştirilmiştir. Bu aletler olduğument ile en aşinalık var ve mevcut makale toplu kullanımı için ayrılmıştır. Diğer iki robot makale yazılmış ve ilgili görüntüleri eksiksizlik çıkarları buraya dahil edilmiştir zamanda MS &amp; FB Grubu gösteri vardı. Her üç robotlar çok aynı Mezofaz dağıtım sistemi, pozitif deplasmanlı cam şırınga 5,7 olduğu temel özelliğini kullanın. Onlar Çöktürücü teslimat ile ilgili en belirgin olarak farklıdır. Robotlar 1 ve 2 8 kuyu, bir anda bir kristalizasyon plaka üzerinde tek bir sütuna aynı anda çöktürücü başarabilenin. Buna karşılık, Robot 3 tek bir eylem tüm 96 Çöktürücü çözümler dağıtır. Robot 2 tek çöktürücü dağıtım ipuçları ile yalnızca bir araçtır. Özellikle uygulamaya bağlıdır farklı enstrümanlar ile ilişkili artılarını ve eksilerini vardır ve bu burada ayrıntılarıyla olmayacak. Her üç çalışma söylemek yeterlidir ve beni kristaller ürettimezo yöntem ile mbrane proteinleri. Makromoleküler kristalografisi tarafından yapı tayini genel sürecinde sonraki adımları hasat ve kriyo-serin kristalleri için bu videoyu makalede anlatıldığı gibi kurmak plakalar ve kayıt ve onlardan süreci X-ışını kırınımı için vardır. Bu konular bu serinin 1,15 ayrı vallahi makaleler kaplıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Bileşenleri </td></tr><tr><td> Brayer (rulo) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Gaz sızdırmaz şırınga </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Cam lamelleri </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Cam levhalar </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Sanat Robbins </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Mezo robot </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Çeşitli </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Sivrisinek LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Delikli çift sopa ayırıcı bant </td><td> Saunders Corporation (delik açılmış) </td><td> özelleştirilmiş </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Çöktürücü çözümleri </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Arıtılmış su </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Yağmur-X </td><td> Shell Oto Bakım </td><td> 80199200 </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Şırınga ipuçları </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (manometre 22) </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Dokular </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Su şişesi </td><td> çeşitli </td><td> NA </td><td> Reaktif </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

Membran proteinlerinin yapı-fonksiyon çalışmaları büyük ölçüde makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX) aracılığıyla sağlanır türü mevcut yüksek çözünürlüklü 3-D yapılar sahip yararlanacak. MX temel bir madde ideal kırınımı kaliteli kristaller sabit bir kaynağı olduğunu. Mezo ya da zar proteinleri kristalize edilmesine ilişkin bir lipidik kübik faz (LCP) yöntemi de membran proteinleri kristalizasyonuna yönelik çok sayıda yöntem biridir. Bu kristallerin büyümesi de bir bicontinuous mezofaz kullanır. Bir yöntem olarak, geç bazı muhteşem başarılar olmuştur ve şimdi kullanarak ilgilenen birçok araştırma grupları ile çok dikkat çekti. Yöntemi ile ilişkili sorunlardan biri barındırma Mezofaz kalın bir diş macunu andıran, son derece ağdalı ve yapışkan olmasıdır. Böylece, kristalizasyon kuyulara küçük hacimli bir tekrarlanabilir bir şekilde elle dağıtma beceri, sabır ve elinizi sabit tutmanız gerekir. Ju yapmak için bir protokolMembran Fonksiyonel ve Yapısal Biyoloji (MS &amp; FB) Grup 1-3 geliştirilmiştir st. Yöntemini açıklayan Jüpiter Video yazılar mevcuttur 1,4 bulunmaktadır. Mezo çalışmalarda kurmak için manuel bir yaklaşımla bu tür kristal optimizasyonu ve türevlendirme gibi özel uygulamalar ile belirgin avantajları vardır. Ancak düşük bir verim yöntemi olmaktan muzdarip yok. Burada, robotik mezo kristallendirme çalışmalarında gerçekleştirmek için bir protokol göstermektedir. Bir robot hız, doğruluk, kesinlik, minyatür ve indirgeyici bir ortamda ya da düşük veya yüksek sıcaklıklarda, örneğin karanlık gibi düşmanca koşullar olarak kabul edilebilir ne altında uzun süre sürekli çalışabilecek olmanın avantajlarını sunmaktadır. Doğru kullanıldığında mezo robot, bir ölçüde de yavaş adımlardan biridir kristalizasyon kolaylaştırarak membran protein yapısını verimlilik ve işlevi araştırma artırabilirgenel yapısının belirlenmesi boru hattı. Bu video yazıda, mezo crystallogenesis içinde ayrılmaz viskoz ve yapışkan Mezofaz başarabilenin üç piyasada mevcut robotların kullanımını göstermektedir. İlk robot MS &amp; FB Grubu 5,6 geliştirilmiştir. Diğer iki son zamanlarda kullanılabilir hale gelmiştir ve tamlığı için buraya dahildir. Bu makalede anlatılan protokol bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Bütün manipulasyonlar oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) koşullar altında yapıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases at JoVE.com

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Görüntüleme.  Trinity College Dublin. Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Video: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Biyokimya

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Kimya

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography services to users worldwide. The HTX lab has a strong focus in the development of new methods in macromolecular crystallography. Through the combination of a high throughput crystallization platform, the CrystalDirect technology for fully automated crystal mounting and cryocooling and the CRIMS software we have developed fully automated pipelines for macromolecular crystallography that can be remotely operated over the internet. These include a protein-to-structure pipeline for the determination of new structures, a pipeline for the rapid characterization of protein-ligand complexes in support of medicinal chemistry, and a large-scale, automated fragment screening pipeline enabling evaluation of libraries of over 1000 fragments. Here we describe how to access and use these resources.

Here, we describe how to use the automated macromolecular crystallography pipelines for protein-to-structure, rapid ligand-protein complex analysis and large-scale fragment screening based on the CrystalDirect technology at the HTX Laboratory in EMBL Grenoble.

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biyoloji

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Protein Kristalizasyonu için Yüksek Verimli Tarama

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

Yazar Gündemi: Protein Kristalografisi için Kristal İsabetler Elde Etmek için Yüksek Verimli Tarama  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Lipidik Bisellerde ABC Taşıyıcı Membran Proteinlerinin Kristalizasyonu

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

Yazar Spotlight: İlaç Geliştirmeyi İlerletmek için ABC Taşıyıcı Membran Proteinleri için Bir Bicelle Kristalizasyon Kurulumu 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme