Bu çalışma, Würzburg Üniversitesi Enfeksiyon Hastalıkları Araştırma Merkezi (ZINF) gelen, Genç Araştırmacı Araştırma Programı tarafından finanse edilmektedir. Juan C Garcia-Betancur Würzburg Üniversitesi Yaşam Bilimleri Enstitüsü (GSLS) bir doktora üyesidir.

1. Etiketleme B. subtilis ve Biyofilm Oluşumu Deneyi <ol><li> PCR ile, ilgilenilen geni promoter bölgesi amplifiye. Bu örnek olarak P tapa, Tasa matriks proteini 26 üretimi sorumlu genlerin klonlanması arttırıcının göstermektedir. Pkm008 vektör (Özlü laboratuar, Harvard Tıp Okulu. Boston, ABD tarafından yaratılmış) içine Clone P tapa (Şekil 2). </li><li> Enzimatik sindirimi (Enzyme önerilen, XhoI) ile plazmit doğrusallaştırmak. </li><li> B. doğal yetkinlik neden subtilis, daha önce tarif Harwood tek adımlı protokolü takip eden ve 27 keserek 168 süzülür. </li><li> Yetenekli hücrelerin kültürüne doğrusallaştırılmış plazmid ekleyin ve inkübasyon iki saat sonra spectinomycin direniş için seçin. </li><li> Elde Suşlarının B. nötr amyE odağı haline yapı taktınız çift ​​rekombinasyon tarafından subtilis (Şekil 4). Oluşturmak içinBir çift-etiketli suşu, bu şekil 3&#39;de ortaya plazmid pDR183 kullanılarak nötr odağına Laca içine ikinci bir raportör entegre. Bu pKM008 içinde klonlanmış Muhabirlerin yerleştirilmesi için yukarıda açıklanan aynı teknik kullanılarak, bu raportör yerleştirin. </li><li> Biyofilm oluşturan yapabiliyor NCIB3610 süzün 168 muhabir aktarın. SPP1 faj iletim protokolü 28,29 kullanın. TY ortamda donör suşu (LB +10 mM MgSO 4 +10 uM MnSO 4) Grow. Faj stok seyreltme 100 ul kültürünün 200 ul karıştırın. Inkübasyon 30 dakika sonra yumuşak agar 3 ml ekleyin ve faj haleler 37 ortaya izin ° C </li><li> Yumuşak agar toplayın. O Santrifüj ve supernatant geçmesi bir şırınga 0.22 mikron filtre düşündüm. TY ortamda yetiştirilen alıcı suşu bir kültür bulaştırmak için bu süpernatant kullanın. 30 ul 10 kültürü seyreltilmiş 1:10 arasında ml ilave edilir. 30 dakika inkübe ve inkübasyon 24 saat sonra antibiyotik direnci için seçin. </li><li> Se37 bir dosyayı içeren bir koloni ve LB gecede büyümek ° C </li><li> % 1.5 agar 30 MSgg katı biyofilm uyaran ortamda gecede kültür 3 uL Nokta. Hücreler 30 ° C (Şekil 3) 72 saat boyunca büyümeye olanak sağlar. Büyüme Üç gün sonra, MSgg agar yüzeyi üzerinde oluşturulmuş biyofilmlerde agar yüzeyinde bir kompleks morfolojik mimarisini geliştirmiştir. </li></ol> 2. Biyofilm Dispersiyon ve Hücre Sabitleme <ol><li> Biyofilm şeklinde bir kürdan veya cımbız kullanarak MSgg agar yüzeyine çıkarın. Biyofilm tutarlılığı size tek parça agar yüzeyinden soyma kapalı izin vermelidir. </li><li> PBS tamponu 3 ml biyofilm yerleştirin ve bir pipet veya iğne yoluyla tekrarlanan geçişi ile biyofilm dağıttı. Alternatif olarak, biyofilm dispersiyon hafif sonikasyon kullanılarak yapılabilir. Hafif sonikasyon bir 3 çıktı ve 0.7 saniye genliği 12 darbe gerektirir. </li><li> Numuneler hücre tek analiz Fix. ResuspenTam olarak, yedi dakika için oda sıcaklığında 4% paraformaldehit çözeltisi ve inkübe 1 ml hücre süspansiyonu d 300 uL. 4% paraformaldehit eriyiğinin bileşimi: Paraformaldehitten 2 g PBS tampon 50 ml 4 ul 10 N NaOH 0,22 um bir alikot filtre ve yoluyla çözeltisi süzmek </li><li> PBS tamponu fiksasyon üç kez yıkayın ve sonra hücreler PBS tamponu 300 uL onları tekrar süspansiyon. </li></ol> 3. Floresans Mikroskopi <ol><li> Bir mikroskop lamı üzerinde% 0.8 agaroz 200 uL dökün ve dikkatli bir slayt ile örtün. Alt slayt bağlı agaroz bir tabaka elde etmek için 2 dakika sonra usulca üst slayt çıkarın. </li><li> Nokta 2 agaroz tabakanın yüzeyi üzerinde sabit bir hücre uL ve bir mikroskop cam kapak ile birlikte kapsar. </li><li> Floresans mikroskobu Örnek yerleştirin. Biz bir Leica CRT6000 iIluminat ile donatılmış bir Floresans mikroskop Leica DMI6000B kullanınsistemi iyon. BP500/20, Em: YFP için filtre Ex olan BP535/30 ve CFP Ex şunlardır: BP426/20, Em: 480/40 </li><li> Numunenin Açığa 50-200 ms arasında bir uyarma floresan. Deney için seçilen koşullar herhangi bir floresans gösteren bir negatif kontrol göre eksitasyon süresi ayarlanır. </li><li> Parlak alan ile elde edilen aynı görüntü floresan görüntü bakın. Bir resimde iki görüntü birleştirme. Sonuçlar P tapa-YFP Şekil 6 &#39;da reporter temsil edilirler barındıran bir tek-etiketli suşu kullanılarak akış floresans mikroskobu elde edilmiştir. </li></ol> 4. Akım Sitometri Kullanımı Tek Hücreli Kantitasyonu <ol><li> Hafif sonikasyon kullanarak sabit hücre örneği Dispers. Hücre erimesi neden olmadan tek hücrelere kümeleri dağıtmak için, bir 5 çıktı ve 0.7 saniye genliği ile 12 bakliyat 2 serisi performans örnek sonikasyon. Işık mikroskobu ile hücre dağılımı verimliliği onaylayın. </li&gt; <li> Sitometresi analizi önce PBS tamponu örnek 1:100 sulandırınız. Biz bir akış sitometresi BD FACS Canto II kullanın. YFP floresan için, 530/30 filtre ile birleştiğinde 488 nm dalga boyunda lazer uyarma kullanın. CFP floresans, bir 408/40 filtresi ile birleştiğinde 405 nm&#39;de lazer eksitasyon kullanabilir. </li><li> Iki negatif kontroller ile akış sitometresi makine kalibre. Süspansiyon hiçbir hücreler PBS ile tampon A örneği akış sitometresi ile duyulana partikül boyutu için negatif kontrol olarak hizmet olmalıdır. Hiçbir floresan muhabiri etiketli örnek bir akış sitometresinin floresans duyarlılığı için negatif kontrol olarak hizmet edilmelidir. </li><li> Akış sitometresi içinde flüoresan raportör etiketli Örnek yerleştirin. Her numune için, saniyede 300 ile 3000 olayları arasında bir akış hızı ile en az 50.000 olayları analiz. </li><li> FACS Diva yazılımı (BD Biosciences) kullanarak veri yakalama ve FlowJo 8.5.2 yazılımı kullanarak bunları analiz. Gösteriyor ki kontrol için floresan sinyalleri bakınyok floresans. </li><li> İki eksenli grafik bir tek etiketli suşu floresans sinyal izleme verileri sunmak. X ekseni ve Y eksen floresans farklı seviyelerde ifade eden hücrelerin sayısı tespit floresans sinyali çizilir. Sonuçlar P tapa-YFP şekil 8&#39;de temsil muhabiri barındıran tek etiketli suşu kullanılarak flow sitometri analizi ile elde. </li><li> Üç eksenli grafik bir çift etiketli suşu floresans sinyal izleme verileri sunmak. X ve Y ekseni (örneğin, GFP Y ekseni olarak X-eksenine ve CFP ölçülen olacaktır) takip kanalların her birinin floresans sinyali çizilir. Z-eksenine plot her bir raportör ve kağıt düzlem (Şekil 9 ve 10) dik olacak konturu izohatlar olarak eksprese eden hücrelerin sayısı. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Zaman B. subtilis b bir plaka üzerinde büyüriofilm tetikleyen orta MSgg, biyofilm oluşumu 30 ° C 30 inkübasyon üç gün sonra görülür. Biyofilm güçlü tutarlılık gösteren ve bu tek parça agar yüzeyinden soyulmuş olabilir. Dahası, belirgin biyofilm katılan hücre alt (Şekil 5) bir göstergesidir karmaşık bir morfolojik mimarisini göstermektedir. Örneğin, koloninin yüzeyinde kırışıklık oluşumunda biyofilmler sonuçlar hücredışı matrisin üretimi. Bu özellik matriks üreticileri 19 subpopülasyonu farklılaşması ile korele edilebilir. Sporların, bu yapıların 30 apikal alanda beri lokalize Benzer şekilde, biyofilm yüzeyinde hava yapıların yaratma, sporlanan hücrelerin bir alt varlığında bir göstergesidir. Bir tek etiketli ve floresan mikroskobu kullanarak bir çift etiketli olan gerginlik r hücre farklılaşmasının görselleştirme örneklerisırası ile, Şekil 6 ve 7&#39;de epresented. Tek-etiketli suşu flüoresan raportör barındıran matris üreten hücrelerin subpopülasyonu olarak ifade edilir P tapa-CFP. Bu subpopülasyonu biyofilm (Şekil 6) oluşturan hücre dışı matriks üretmek ve salgılamak sorumludur. Çift etiketli suşu muhabiri barındıran P tapa-CFP 26 ve ek muhabiri P srfAA-YFP 31. Bu ikinci muhabiri matris üreticilerin farklılaşma (Şekil 7) sinyal basamaklarını tetikler sinyal molekülü surfactin salgılamaya sorumlu hücrelerin subpopülasyonu izlemenizi sağlar. Surfactin üreticilerin subpopülasyonu sarı renkli yanlış ise matris üreticilerin subpopülasyonu mavi renkli yanlıştır. Muhabir P tapa-YFP Şekil 8&#39;de sunulmaktadır barındıran tek etiketli suşu kullanılarak flow sitometri analizi. Tedavi edilmeyen kontrol susu barındıran değilHerhangi bir floresan protein genleri tek bir nüfusu düşük bağıl floresans gösterdi. Olmayan biyofilm uyaran koşullarda P tapa-YFP barındıran Hücreleri matris üreticilerin subpopülasyonu ayırt etmedi ve bütün nüfusun düşük bağıl floresans gösterdi. Biyofilm tetikleyen durumda, yüksek nisbi floresan hücrelerin bir alt düşük bağıl floresan tepe noktasında 23 sağında bir omuz olarak gözlenen, oluştu. Bir çift-etiketli suşu akış sitometresi kullanılarak analizinden elde edilen sonuçlar Şekil 9 ve 10&#39;da temsil edilir. Şekil 9 çift etiketli suşu P tapa-CFP, P srfAA-YFP kullanarak matrisi üretici ve surfactin üreticilerin subpopülasyonunun izlenir. Arkaplan floresan kontrolü olarak biz herhangi bir floresan protein genleri barındıran olmayan bir suş kullanılmıştır. Sonra, tek etiketli suşu kullanarak her floresan kanal matrisi üretici ve surfactin üreticilerin her subpopülasyonu tespit<html> kontrol olarak s. Çift etiketli suşu P tapa-CFP, P srfAA-YFP floresan gazetecilere yüksek düzeyde eksprese eden hücrelerin iki subpopülasyonunun gösterdi. Her nüfus özel hücreler 15 iki alt popülasyonlar arasındaki gazetecilere ifadesi hiçbir örtüşme olduğunu gösteren çerçeveli. Çift etiketli kullanarak Benzer şekilde, akım sitometri analizi suşu P skf-YFP, P tapa-YFP rakam 10 sunulmuştur. Geni skf için reportör matris üreticileri 24 subpopülasyonu ile koordineli ayırt etmek için tarif edilmiştir yamyamlar 32, bir subpopülasyonu farklılaşmasını izler. Bu durumda, çift-etiketli suşu YFP ve CFP hem de ifade flöresanlı hücre tek bir subpopülasyonu gösterdi. Bu iki hücre farklılaşması yollarının koordineli aynı subpopülasyonu aktive olduğunu göstermiştir. &quot;1.jpg /&gt; Şekil 1.. Deney genel şeması. Protokolü üç ana adımda ayrılır. Birinci adımda B&#39;nin suşu etiketlenmesi gerektirir ilgi subpopülasyonu izler muhabiri füzyon subtilis. İkincisi, biyofilm uyaran koşulları etiketli suşları büyür. Üçüncü olarak, biyofilm dağıtmak ve floresan mikroskobu ve akım sitometri kullanarak nüfusun tek hücreli analizi yürütmek. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" /> Şekil 2. Entegrasyon vektör pKM008 şematik gösterimi. Bu vektör çift rekombinasyon tarafından nötr odağı amyE içine ilgi muhabiri füzyon bütünleştirir. Ilgi (P tapa) ile promotör EcoRI sınırlama sitelerini ve HindIII kullanılarak vektörüne klonlanır. Sonra, CFP genin ekspresyonu promotör P tapa kontrolü altındadır. Orientatplazmid içinde genlerin iyon bir ok olarak temsil edilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" /> Şekil 3. Entegrasyon vektör pDR183 şematik gösterimi. Bu vektör çift rekombinasyon tarafından nötr odağı Laca içine ilgi muhabiri füzyon bütünleştirir. Ilgi (P tapa - CFP) arasında füzyon EcoRI sınırlama sitelerini ve BamHI ile vektörüne klonlanır. Plazmid içinde genlerin yönelimi bir ok olarak temsil edilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" /> Şekil 4. B. kromozom içine gazetecilere entegrasyon şeması çift ​​rekombinasyon tarafından subtilis. (A) B. subtilis kromozom biyofilm gelişimini etkilemeden muhabiri füzyonları bütünleştirmek için iki nötr lokusları, amyE ve Laca sahiptir. (B) </spKM008 çift rekombinasyon&gt; Süreci Lüks. Doğrusallaştırılmış plazmid B. genomunun içine entegre çift ​​rekombinasyon tarafından subtilis. Muhabiri füzyon istikrarlı bir şekilde nötr lokus entegre. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" /> Şekil 5. B. biyofilm suşu B. subtilis bioflm oluşumu NCIB3610. Proses subtilis NCIB 3610 30 az üç gün boyunca biyofilm uyaran orta MSgg büyüyen ° C Biyofilm gelişmesi Sıralı resimleri 12 saatte çekildi. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" /> 6 Şekil. Floresan mikroskop altında matriks üreticilerin subpopülasyonu Görselleştirilmesi. B. bir biyofilm gelen bir örnek subtilis P tapa - metreden parmak sayma floresan mikroskop altında sabit ve incelenmiştir. Floresans 200 mseksitasyon hücrelerinin geri kalanından daha yüksek floresans yayan hücrelerin bir alt kanıtlandığı. Bu matris üreten hücrelerin subpopülasyonu olarak kabul subpopülasyonu. Ölçek bar 3 mikron olduğunu. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" /> Şekil 7. Floresan mikroskop altında matrisi üretici ve surfactin üreticilerin subpopülasyonu Görselleştirilmesi. B. bir biyofilm örnek subtilis P tapa-metreden parmak sayma, P srfAA-YFP çift etiketli zorlanma tespit ve floresan mikroskop altında incelendi. Hücrelerin geri kalanından daha yüksek floresans yayan hücre 250 ms kanıtladığı iki alt popülasyonlarının Pozlama süresi. Bir subpopülasyonu YFP ifade ve münhasıran YFP kanal (sarı renkli yanlış) ile tespit edildi. Bu surfactin üreticilerin alt nüfusudur. Başka subpopülasyonu CFP ifade ve münhasıran OBP chann ile tespit edildi<html> El. Bu matris üreticilerin alt nüfusudur. Ölçek bar 3 mikron olduğunu. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" /> Şekil 8. 2-B akım sitometri. Kullanarak matris üreticilerin subpopülasyonu Kantitasyonu B. bir biyofilm hücreleri Dağınık subtilis P tapa-YFP akım sitometri ile takip edildi. Akış sitometresi 50.000 olaylar sayılır ve her olay için floresan sinyal izlendi. YFP sinyal yoğunluğu X ekseni çizilir iken sayılır hücre sayısı Y ekseni çizilir. Hücre dışı biyofilm uyaran koşulları elde etmek için LB ortamda yetiştirildi. Hücreler biyofilm uyaran koşulları elde etmek için orta MSgg yetiştirildi. Matris üreticilerin subpopülasyonu sadece biyofilm uyaran koşullarda farklılaştırır. Bu rakam López ark uyarlanmıştır., PNAS (2009) 106 :280-285. s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg &quot;/&gt; Şekil 9. 3-D akış sitometresi kullanılarak matris üretici ve surfactin üreticilerinin subpopülasyonu Kantitasyonu. Izlenir kanalların Floresans sinyali X ekseni (YFP için) ve Y ekseni (CFP için) &#39;de verilmiştir. Z-eksenine her reporter eksprese eden hücrelerin sayısını ölçer ve konturu izohatlar kağıt düzlemine dik olarak ölçülür. Bu deneyde kontrol olayların sayısı 50,000 olaylardı. Sol üst panel hiçbir floresan protein genleri barındıran eşiğe bir kontrol sunuyor. Sağ üst panel tek etiketli suşu P srfAA-YFP kullanarak YFP floresans kanal (sarı çerçeveli) içinde surfactin üreticilerin subpopülasyonu algılar. Sol alt panel tek etiketli suşu P tapa-CFP kullanarak OBP floresans kanal (mavi çerçeveli) matris üreticilerin subpopülasyonu algılar. Çift etiketli suşu P tapa &lt;/ Em&gt;-CFP, P srfAA-YFP sağ alt panelde izlenir. Bu sarı ve mavi çerçeveli iki subpopülasyonunun gösterdi. Bu rakam López ark uyarlanmıştır., Genler ve Gelişim (2009) 23 :1631-1638. <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" /> 10 Şekil. Matris üretici ve 3-D akış sitometresi kullanılarak yamyamız subpopülasyonu Kantitasyonu. Izlenir kanalların Floresans sinyali X ekseni (YFP için) ve Y ekseni (CFP için) &#39;de verilmiştir. Bu deneyde kontrol olayların sayısı 50,000 idi. Sağ üst panel tek etiketli suşu P skf-YFP içinde YFP floresans kanal (sarı çerçeveli) içinde yamyamız subpopülasyonu algılar. Sol alt panel tek etiketli suşu P tapa-CFP içinde OBP floresans kanal (mavi çerçeveli) matris üreticilerin subpopülasyonu algılar. Double etiketli suşu P tapa-CFP, P skf-YFP X ve Y eksenleri (yeşil çerçeveli) için çapraz hücrelerin sadece bir alt gruptaki gösterdi. Aynı anda iki muhabir ifade Çünkü subpopülasyonu YFP ve CFP kanal tespit edilir. Lopez ve ark., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

<ol>
	<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microbial+biofilms.">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+microbial+communities:+biofilms,+interactions,+and+genetic+systems.">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms.">Biofilms.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-associated+proteins.">Biofilm-associated proteins.</a> C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).</li><li>O'Gara, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ica+and+beyond:+biofilm+mechanisms+and+regulation+in+Staphylococcus+epidermidis+and+Staphylococcus+aureus.">ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).</li><li>Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+and+biofilm+formation+in+Bacillus+subtilis.">Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).</li><li>Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sigmaD-dependent+autolysins+in+Bacillus+subtilis+population+heterogeneity.">Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity.</a> J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).</li><li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation.">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis.">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+signaling+in+a+bacterium.">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis.">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media.">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li><li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture,+sporulation,+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis.">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms.">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis.">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li><li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactin,+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis:+isolation,+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation.">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li><li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms.">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+systems+in+staphylococci.">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li><li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1.">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production,+competence+development,+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li><li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+by+sporulating+bacteria.">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism.">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bakteri toplulukları genler delillerin mikrobiyal topluluklar 33,34 karmaşıklığı belirli ifade hücrelerin subpopülasyonunun gösteriyor olması. Bu protokol ilgi herhangi bir gen ekspresyonu mikrobiyal toplum içinde özel hücreler belli bir subpopülasyonu kısıtlı olup olmadığını belirlemek için yardımcı olmalıdır. Geleneksel yöntemlerin bütün mikrobiyal topluluk ve mikrobiyal toplum içinde gen ekspresyon dalgalanmalara gen ekspresyonu veya mikroarray analizi oranı gen ekspresyonu d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Teknik </td><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td rowspan="11"> Kompozisyon MSgg </td><td> 5 mM potasyum fosfat </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100mM MOPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür 2mm </td><td> Roth </td><td> 2189.1 </td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> Demir klorür 50μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> Çinko klorid 1 mikrona </td><td> ¸ </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Tiamin 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Gliserol% 0.5 </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutadostum% 0.5 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Triptofan 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Fenilalanin 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Hücre fiksasyon </td><td> Paraformaldehyde </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sonikasyon </td><td> Hücre Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Floresans Mikroskopi </td><td> Floresan Mikroskop </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Yazılım Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Floresans Mikroskopi </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry

Biyofilm oluşumu hemen hemen tüm bakterileri 1-6 genel bir niteliktir. Bakteriler biyofilmler oluştururlar, hücreler çoğunlukla 7-10 diğer faktörler arasında proteinler ve ekzopolisakkarit tarafından oluşturulmuştur hücre dışı matris içinde kaplı vardır. Mikrobiyal topluluk genellikle 11-17 özel hücreler farklı subpopülasyonu farklılaşması gösterir biyofilm içinde kaplı. Bu subpopülasyonunun arada ve genellikle 18-21 biyofilm içinde zamansal ve mekansal organizasyonu gösterir. Model organizma Bacillus subtilis Biyofilm oluşumu özel hücreler farklı alt popülasyonlarının farklılaşmayı gerektirir. Bunlar arasında, biyofilm hücre dışı matriks üretmek ve salgılamak sorumlu matriks üreticileri, en subpopülasyonu 11,19 biyofilm oluşumu için gereklidir. Bu nedenle, matris üreticilerinin farklılaşması B. biyofilm oluşumu hallmark subtilis. Biz B. Biyofilmlererde matris üreticilerin subpopülasyonu görselleştirmek ve ölçmek için floresan gazetecilere kullanmış subtilis 15,19,22-24. Somut olarak, bu matris üreticilerinin subpopülasyonu kendi ürettiği ekstraselüler sinyal surfactin 25 varlığında karşılık olarak ayırt olduğu araştırmacılar tarafından gözlenmiştir. İlginç bir şekilde, surfactin matris üreticileri 15 subpopülasyonu farklı özelleşmiş hücre bir alt tarafından üretilir. Bu raporu B. subtilis biyofilmler içinde matrisi üretici ve surfactin üreticilerin subpopülasyonu görselleştirmek ve ölçmek için gerekli teknik yaklaşım ayrıntılı var. Bunu yapmak için, matris üretimi ve surfactin üretimi için gerekli olan genlerin flüoresan gazetecilere B&#39;nin kromozom içine sokulur subtilis. Reporters sadece özel bir hücre subpopülasyonu cinsinden ifade edilmiştir. Daha sonra, alt popülasyonlar olabilirfloresan mikroskobu ve akım sitometri (Şekil 1&#39;e bakınız) kullanılarak izlenir. Özel hücrelerin farklı alt popülasyonlarda bakterilerin çok hücreli topluluklar içinde bir arada olması, bize Prokaryotlarda gen ifadesinin düzenlenmesinde hakkında farklı bir bakış açısı kazandırır. Bu protokol deneysel olarak bu fenomeni adresleri ve kolay bir mikrobiyal topluluk içinde fenotipik heterojenite altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, başka herhangi bir çalışma modeline adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry at JoVE.com

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol tarif<em&gt; B. subtilis</em&gt; Floresan mikroskobu ve akım sitometri kullanarak biyofilm.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

20.3K Görüntüleme.  University of Würzburg. Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol tarif B. subtilis Floresan mikroskobu ve akım sitometri kullanarak biyofilm.

Video: Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Genetik

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Çevre

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Flow Sitometride Bacillus subtilis Spor Sayımı ve Etiket Analizinin İyileştirilmesi

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biyokimya

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler