Name: rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

Yazarlar mikroenjeksiyon yanı sıra anonim değerlendirenler anlayışlı görüşleri ile ilgili yardım için RJ Sommer ve X Wang müteşekkiriz. Bu çalışma NIH hibe SC2GM089602 tarafından desteklenmektedir.

1. Transgenesis: DNA hazırlığı <ol><li> Hakim ko-enjeksiyon belirleyicisi: pRL3 [Ppa-PRL-1 (tu92)] PRL3 plazmid görsel olarak başarılı bir dönüşüm olayları tanımlamak için, baskın bir ko-enjeksiyon belirteç . Bu plazmid yakından C. SQT-1 kolajen geni ile ilgili Ppa-PRL-1 geni baskın bir mutant allel (tu92) için kodlar elegans ve wild tip sinüzoidal lokomosyon solucan vücut ekseni 1,5 boyunca saat yönünde büküm hareketleri haline dönüştürür. Dönüştürülmüş hayvan C. kullanılan popüler bir baskın seçim işaretleyici rol-6 (su1006) çok benzer. Geçtiğimiz 20 yıl boyunca elegans. </li><li> Hedef muhabiri transgen: Ppa-egl-4p: GFP Ilgi bir gen dizisi 9 kodlama GFP transkripsiyonel veya translationally bağlantılı olabilir. Bu çalışmada, Ppa-egl-4promoter: GFP (egl-4, cGMP bağımlı protein kinaz) kullanımıçeviri başlangıç ​​upstream 2 kb parçası S. GFP ifade kazandırmaz eğer d belirlemek için pacificus PS312. Bu GFP vektör modifiye ile GFP kodlama bölgeyi içeren intron ve çok amaçlı Ppa-rpl-23 nazik Xiaoyue Wang ve Ralf J. Sommer (Max-Planck Enstitüsü, Tübingen, Almanya, AB) tarafından sağlanan 3 &#39;UTR terminatör 5. </li><li> Genomik DNA: PS312 Ayrıca yabani-tip P. pacificus PS312 genomik DNA, özellikle transgenik F 1, F 2 döl 5 hayvanlar, istikrarlı transgen miras almak için gereklidir . Kararlı F 2 transgenik hatları görülenlere benzer: genomik DNA iki transgenlerin (GFP muhabiri: ko-enjeksiyon işaretleyici PRL-3 ve Ppa-egl-4p) ile karmaşık ekstra kromozom dizileri oluşturur henüz belli değil C. elegans 3. Ancak, aynı cohesi gereksinimi paylaşmak için genomik DNA ve transgenlerin varve çıkıntılar, güçlü konak hücrelerine doğru DNA şanzıman (gDNA Sigma G1N10 kiti kullanılarak hazırlanmıştır) tanıyabilir karmaşık ekstra-kromozomal dizileri oluşumunu göstermektedir. </li><li> DNA sindirimi : GFP vektör DNA ve ko-enjeksiyon işaretleyici pRL3 ve PS312 gDNA uyumlu yapışkan çıkıntılar üretmek için: Kısıtlama enzimler Ppa-egl-4p linearize için kullanılır. Vorteks değil, dokunarak karıştırın. 37 az bir saat boyunca inkübe ° C </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 mikrogram </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> PstI (10 U / ml) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 100 mcL </td></tr><tr><td> Ppa-egl-4p: GFP </td><td> 4 mikrogram </td></tr><tr><td> 10x tampon </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Sali (10 U / ml) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 mikrogram </td></tr><tr><td> 10x tampon </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> PstI&#39;in ve Sal I (10 U / ml) </td><td> Ul 8 </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 1 Kısıtlama Enzim Digest için karışım. <ol start="5"><li> DNA yağış ve hazırlık <ol><li> 1:10 sodyum asetat (3 M NaCOOCH-3 pH 5.2) ve sindirilmiş ürün% 100 etanol hacmi 2.5X ekle, pelet daha kolay görmek için 20 ng / glikojen ul ekleyin . </li><li> 15 dakika 14.000 rpm&#39;de Santrifüj 4 ° C </li><li> Tippi tarafından süpernatant Durusuyavaş yavaş ng santrifüj tüpü baş aşağı ve daha sonra bir kağıt mendil, dokunarak, pelet, tüpün alt köşesindeki güvenli olduğundan emin ve etanol ücretsiz. </li><li> 1 ml% 75 etanol ekleyin. </li><li> Hemen 4 5 dakika 14.000 rpm az dönmeye ° C </li><li> Yavaş ters santrifüj tüpüne devrilme ve sonra bir kağıt mendil pelet bu tüpün alt köşesindeki güvenli ve emin etanol dokunarak süpernatant Durusu. </li><li> Kuru pelet 5 dakika 14.000 rpm&#39;de santrifüj vakum 25-30 ° C, kuru ve tamamen ücretsiz etanol kadar. </li><li> TE veya steril dH 2 O 30 ul ekleyin ve bir girdap ile 4 ° C karıştırma kısa bir süre önce bir gece bekletin. </li><li> Tablo 2, enjeksiyon karışımı enjeksiyon için her saflaştırılmış DNA nasıl oluşturulacağı anlatılmaktadır. </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza Enjeksiyon karışımı çözündükten sonra olabilir enkaz parçacıklar kurtulmak için tüp 5 dakika 14.000 rpm&#39;de aşağı doğru döndürünenjeksiyon iğnesi tıkayabilir. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Genetik materyal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Ppa-egl-4p: GFP (Sali) </td><td> &gt; 5 ng / ul (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / ml </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (PstI + Sali) </td><td> &gt; 60 ng / ml </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 30 ul </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Ppa-PRL-1 enjeksiyon karışımı 2. RNA Girişim: in vitro çift zincirli RNA sentezi <ol><li> PCR ilgi gen yükseltmek için kullanın. RHL091 5&#39;-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC 3 &#39;(BamHI site) ve RHL092 5&#39;-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3&#39; (PstI site) 464 bp genomik frag yükseltmek için kullanılır.Ppa-PRL-1 (tu92) aleli içeren pRL3 vektör Ment (konum 3-466). </li><li> BamHI ve PstI ile PCR ürünü Digest. </li><li> BamHI / PstI pL4440 RNAi besleme vektör 2 sindirilir parçası Arter. </li><li> Yetkili hücrelerin içine eklenen vektör Dönüşümü ve Ampisilin LB medya levhalar (50 mg / ml) onları büyümek. </li><li> T7 primerler kullanılarak PCR ile başarıyla takılı vektör seçin. </li><li> BLOK-IT RNAi sentezi kiti (Invitrogen) kullanarak) çift iplikli RNA dsRNA yapmak için PRL-1 geni içeren PCR ürünü çevrili T7 kullanın. </li><li> Kadar 1 enjeksiyon için mikrogram / ul&gt; 200 ng / ml, dsRNA konsantrasyonu en iyi. </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza Enjeksiyon karışımı çözündükten sonra, bir iğne tıkayabilir enkaz parçacıkların kurtulmak için tüp 5 dakika 14.000 rpm&#39;de dönerler. </li></ol> 3. Mikroenjeksiyon: transgenlerin ve / veya dsRNA enjeksiyon Protokolü <ol><li> Enjeksiyon İğnesi <ol><li> Sıcaklığı: Narishige iğne çektirmesi (PC-10 model #) ayarlayın <ol><li> Alt düğmeyi çevirin &quot;No.2 Isıtıcı.&quot; </li><li> &quot;No.2 Isıtıcı Ayarı&quot; Turn. paneli kadar okur topuzu 55,0-60,0 ° C değişen uzunluklarda konik iğne ucu. </li></ol></li><li> (Bir adım iğne çeker) &quot;Adım 1&quot; geri altındaki düğmeyi çevirin. </li><li> Iğne odasına yükleyin ve güvenli olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Başlat&quot; düğmesini (kırmızı düğme) basın ve iğne (bu iki zıt yönlerde aynı iğne yapmak gerekir) tüm ağırlıkları ile çekilmesine izin verir. </li><li> Iğne, iğneler üzerinde biriken tozu önlemek için Play-Doh ile sabitleniyor plastik bir kültür plaka oda ve mağaza çıkarın. </li></ol></li><li> Montaj Pedleri <ol><li> 1,5 ml santrifüj tüpüne, 1 ml H 2 O Noble Agar 0,02 g ekleyerek% 2 Noble Agar çözüm Agar, 4 ° C ile bir yıl kadar saklanabilir. </li><li> İyice karıştırın ve&gt; 88 ° C&#39;ye ayarlanmış bir ısı bloğu agar eritebilir </li><li> 1 ml mikropipet kullanarak, (Fisher, 12-544-F) sıvı% 2 Noble Agar bir damla cam slayt ortasına yerleştirin. </li><li> Damla üstünde başka bir cam slayt koyarak düzleştirin. </li><li> &quot;Bırak Adım&quot; Beş cam slayt bir katman kalmayıncaya kadar tekrarlayın. </li><li> Her cam sürgülü cam slayt çıkarın birbirlerine slaytlar. </li><li> Kuru bir elektrikli fırında 70 cam slaytlar agar ped düzleştirmek ° C gecede 4 saat (ya da oda sıcaklığında gece). </li><li> Ileride kullanmak için birden fazla Enjeksiyon pedleri ve mağaza olun. </li></ol></li><li> Hermaphroditic gonadlar içine mikroenjeksiyon </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> Şekil 1. P. şematik çizim pacificus anatomi net çekirdekli hücreler dişi germ hücreleri (oosit) ve gri gölgeli kısmı bağırsak. Sadece bir distal anterior gonad gösterilirama iki distal gonadlar, gövde ortasında yakın dorsal birbirlerine çapraz dikkat edin. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> Şekil 2. Görüntüleri mikroenjeksiyon, (A) enjeksiyon iğne ucu çekti kılcal parçasının aşırı sağ bir çizgi ile odak . Keskin bir nokta hala korurken, bu kenarı iğne ucu hafifçe dokunarak, iğne ucu ayrılmalıyız. (B) üst içine iğne ekler sadece ilk enjeksiyon için bağırsak eğriliği yukarıdaki gonaden. (C) altına iğne ekler ikinci enjeksiyon için sadece gut eğrilik altında gonaden. <ol start="3"><li><ol><li> Kontrast ve DIC kesme ayarı hermafrodit gonadlar görüntülemek için ideal olduğundan emin olun. </li><li> Çekti kılcal iğne içine enjeksiyon karışımı 1.0-2.0 ul yükleyin. </li><li> Mikroenjeksiyon manipülatör iğne yerleştirin; nitrojen tankı basınç göstergeleri ideal koşulları belirlenmiş olmalıdır (10-20 psi0.5-1 saniye süreyle). </li><li> Iğne ucu bir slayt (Şekil 2A) yerleştirilen, ince çekti kılcal tüp kenarına hafifçe dokunarak kırın. <ol><li> İğne kesici slayt çekti petrol bir damla cam bir slayt üzerine yerleştirilen kapiller ince parçası </li></ol></li><li> İğne sonra (P. pacificus onlar kuru önce enjeksiyon için 5 dakikalık bir pencere var ve ölmek) pad solucan almak ise atıl bir konumda yer olabilir. </li><li> J4-genç erişkin solucanlar dolu bir tabak kullanarak, tüm solucanlar OP50 bakteriyel çim kapağı sadece yeterli parafin yağı (ağır) dökün. </li><li> Pick bir solucan ve enjeksiyon pad üzerine yerleştirin. </li><li> Iğne ve iğne (Şekil 2B, 2C) uzak vulva yönde pozisyon solucan gonad mikroskop solucan ile cam slayt yerleştirin. </li><li> Mikroskop görünümü konumu iğne indirin. </li><li> Aynı odak düzlemi (Şekil 2B) üst gonad ve iğne yerleştirin.</li><li> Yavaşça solucan Poke ve pompa enjeksiyon karışımı; distal uç doğru ayıran ooctyes (transgen veya dsRNA teslim optimize etmek için başarılı bir enjeksiyon gösterir, enjeksiyon üzerine distal yakın olana kadar devam gonad genişleme dalgası görmelisiniz ucu). </li><li> Yeniden konumlandırmak alt gonad ve tekrar enjeksiyon enjekte etmek için iğne, bu gonad oositlerin yayılması olmayacaktır bağırsak altında ve (Şekil 2C) ulaşmak için böylece daha zor ancak. </li><li> Normal görünümlü solucan enjeksiyondan sonra başarılı bir enjeksiyon gösterir; (vulva dışarı çıkıntılı ya da vücut boşluğunun içine attı) herhangi bir hasarlı gonadlar olmamalıdır. </li><li> Rölanti iğne geri yerleştirin. </li><li> Solucan kurtarmak için hazırlayın. </li><li> M9 tampon enjekte solucan yerleştirilen ped üzerine bir damla (0.5 ul) ekleyin. </li><li> OP50 bakteri tercihinizi kullanarak, solucan OP50 ile dokunma, ve sopa olmalıdır. We, ağız pipeti kullanmayın. </li><li> Solucan tabağa OP50 50 ul noktalar ile seeded yerleştirin, 2-4 solucanlar gibi plakalar kurtarıldı olabilir. </li></ol></li><li> Transgenesis için enjeksiyon sonrası Depolama ve Tarama <ol><li> Mağaza 20 (P 0) solucanlar enjekte ° C ~ 4 gün yumurtalarını ve F 1 büyüyecek. </li><li> Seçili fenotip (transgenesis Ppa-PRL-1 hakim işaretleyici ifade yuvarlanan hayvanlar için, arama ekran) için dördüncü gününde Ekran solucanlar. </li><li> Tek bağımsız F 1 Pick 25 yeni numaralı seribaşı plaka ve saklamak için gözlenen bir fenotip ile hayvanlar ° C; bu sıcaklık F 1 istikrarlı çizgilerin oluşumunu teşvik eder &#39; s. </li><li> Tek F 2 F 1 hatlarından bağımsız. Bireysel F 2 satır benzer transgen aktarım hızlarına sahip. Biz genellikle&gt; 15 elde F dönüştürülmüş F 1 hayvan başına 2 satır. </li><li> 25 ° C&#39;de sonraki nesillere Mağaza </li><html><li> Her bir hat için: silindirleri iletim hızı genellikle bu hedef transgen ekspresyon seviyesi (GFP: Ppa-egl-4p) belirlemek için şu anda gerekli olan F 4 nesil sonra sabit kalır. GFP ifade baskın rulo fenotip penetrans derecesi ile ilişkili olmayabilir. </li></ol></li><li> RNAi fenotipleri için enjeksiyon sonrası Depolama ve Tarama <ol><li> Mağaza 20 (P 0) solucanlar enjekte ° C ~ 4 gün yattı ve F 1 büyümek için. </li><li> Ekran F seçilen fenotip (RNAi demonte fenotipi Ppa-PRL-1 fenotip kaybı bizim durumumuzda, hedef gen aktivitesinin kaybı ile ilişkili olabilir penetrant fenotipleri için arama için ekran) dördüncü gününde 1 solucanlar. </li><li> Deneyimlerimize göre, non-silindiri demonte fenotip F 2&gt;% 97 kaybolur. </li></ol></li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: <html> Transgenesis p &quot;&gt; 1 Sonuç <table border="1"><tbody><tr><td> Oturum </td><td> P 0 Injected </td><td> F 1 Silindirler </td><td> % Transgenik F 2 </td><td> Ortalama% iletim F 2 sonra </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Hat 1) 0% (2 hat)% 13 </td><td> NA % 13 ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (3 hat)% 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> % 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (4 hat)% 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> % 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> % 26 (5 hat) </td><td> % 22 ± 10 </td></tr></tbody></table>içeriği &quot;&gt; çapraz vermedi * makaralı bir erkek; NA: Uygulanabilir değil : GFP (Sal I sindirilir), pRL3 (rulo) (PstI&#39;in sindirilir) ve gDNA PS312 (PstI ve Sali sindirilir): Tablo 3 Sonuçları Ppa-egl-4p enjekte PS312. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> Şekil 3. (A) wild tip (B, C) ​​istikrarlı bir F 4 pRL3; Ppa-egl-4p:: nöron GFP ifade baş gösteren GFP transgenik hattı. 2. RNA girişim sonucu <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> Şekil 4. RNA PRL-1 mutantlar &quot;yuvarlanan&quot; hareketin komple demonte (A) PRL-1 rulo kazanç fonksiyon-mutant tu92 enjekte etti. (B) PRL-1 mutant sergi, normal wild tip duruş ve hareket &quot;nakavt&quot;. (C) PRL-1 (alt) da uzun b Injecteddaha ody PRL-1 mutant (üstte). (D) uzun vücut enjekte PRL-1 (alt) (üst) wild tip PS312 daha uzun da. Uzun vücut fenotip aynı zamanda rol-5 C. (SQT-1) RNAi demonte gözlendi elegans N2 (veriler gösterilmemiştir). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rulo </td><td> non-roll </td></tr><tr><td> Bir PRL-1 dsRNA (200 ng / ul) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> Yatak PRL-1 dsRNA (ng / ul 1000) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> kontrol </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tablo 4 Ppa-PRL-1 dsRNA enjeksiyonları özeti. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0.0019 ve 0.041, sırasıyla 200 ve 1000 ng / ul enjeksiyonları için iki kuyruklu Fisher Exact Testi,,.

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

P. pacificus popülasyonları dünya çapında çeşitli bokböceği böcek türleri ile yakın ilişkisi bulunan ve serbest yaşayan ve paraziter nematod arasındaki ara bir model nematod . P. gücü gelişmekte olan bir model organizma olarak pacificus tarafsız ileri genetik ekranlarını izole mutantlar teşvik pozisyonel haritalama, genetik ve fiziksel haritalar entegrasyonu yatıyordu (yani sadece daha önce C. elegans karakterize aday genler için) 6,10. Anc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Ürün: </th><th> Katalog #: </th><th> Faaliyet alanı: </th></tr><tr><td> DMI3000 Enjeksiyon mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Mikroenjektör manipülatör (Direct drive) </td><td> Narashige BC-3 Rotil </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> İğne Çektirme </td><td> Narashige PC-10 </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> Mikroenjektör ™ All-Dijital Multi-basınç sistemi </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Memeli Genomik DNA Miniprep Seti </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Klonlama Jet kiti </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plazmid Miniprep kiti </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Konsantratörü ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO Araştırma </td></tr><tr><td> BLOK-IT ™ RNAi TOPO ® transkripsiyon kiti </td><td> K3500-01 ve K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher bilimsel </td></tr><tr><td> Mikroskop cam kapak (1.5 - 0,16 - 0,19 mm kalınlığında; Boyut: 50 x 45mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Cam kılcal damarlar (filament) </td><td> 615000 </td><td> AM sistemleri </td></tr><tr><td> Parafin Yağı (Ağır) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

RNA girişim ve istikrarlı transgenesis gen fonksiyonu ve ifade analizleri derinlemesine daha fazla, tamamen sıralı genomların elde birçok türün özellikle anatomi ve organizmanın moleküler hücre biyolojisi nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Gelişmekte olan model organizmalar için gittikçe daha uygun fiyatlı olmasına rağmen Örneğin, stably Caenorhabditis olmayan türlerin transgenik hatları bulaşan Caenorhabditis elegans 3, taç grup Caenorhabditis dışında Strongyloides stercoralis 4 ve Pristionchus pacificus 5 istisna ile, bu aldatıcı filumun (Nematoda) bildirilmiştir değil. P. genişleyen rolünü kolaylaştırmak için çalışmada, gelişme, evrim, ve davranış 6-7 pacificus, biz burada, transgenik hayvanlar ve gen RNAi tarafından yıkmak yapmak için mikroenjeksiyon kullanmak için geçerli yöntemleri açıklanmaktadır. Gonadlar gibi <em&gt; C. elegans ve diğer birçok nematod, P. gonadlar pacificus syncitial ve doğrudan mikroenjeksiyon tarafından teslim oosit içine DNA ve RNA içeren yeteneğine sahip. C. aksine P. de elegans Ancak, istikrarlı transgen miras ve somatik ifade pacificus hedef transgenlerin ve coinjection belirteçler 5 biter tamamlayıcı endonükleaz ile sindirilir kendini genomik DNA eklenmesini gerektirir. Ayrıca taşıyıcı genomik DNA Strongyloides stercoralis 4 ve C germ hücreleri transgen ifade gereksinimi için benzer elegans. Ancak, bu hayvanların kendi genomik DNA için spesifik bir gereklilik ise açık değildir, çünkü P. pacificus soma karmaşık olmayan çok kopyalı genlerin susturulması ya da çok verimli P. içinde ekstrakromozomal diziler pacificus mitoz sırasında uygun kinetochore montaj için genomik dizileri gerektirir. Iki kollu (ventral göççift ​​cinsiyetli olarak didelphic) gonadlar, bireysel solucanlar 8 hem de gonadlar enjekte yeteneği daha da zorlaştırmaktadır. Ayrıca demonte haddeleme olmayan F 1 döl elde etmek için çift iplikli RNA (dsRNA) gonadlar içine enjekte edilerek baskın bir mutant (rulo, tu92) mikroenjeksiyon kullanımı göstermektedir. C. aksine elegans, ancak diğer pek çok nematod gibi, P. pacificus PS312 besleme ve iliklerine ve bu nedenle dsRNA syncitial gonadlar içine mikroenjeksiyon tarafından uygulanmalıdır yoluyla sistemik RNAi açık değildir. Bu çalışmada, biz Ppa-egl-4 organizatörü dönüştürmek için gerekli olan mikroenjeksiyon işlemi tanımlamak için umut: GFP füzyon muhabir ve demonte baskın bir rulo PRL-1 (tu92) mutant görsel bilgilendirici bir protokoldür.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus at JoVE.com

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi spesifik mRNA transkript 1-2 demonte model organizmalar, transgenesis gen işlevleri işleyebilirsiniz. Bu protokol, necromenic nematod içine stably iletilen DNA ve geçici çift iplikli RNA tanıtmak için gerekli teknikleri göstermek için hedefliyor<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;, Evrimsel gelişim ve davranış biyolojisi çalışmaları için.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K Görüntüleme.  California State University. RNAi spesifik mRNA transkript 1-2 demonte model organizmalar, transgenesis gen işlevleri işleyebilirsiniz. Bu protokol, necromenic nematod içine stably iletilen DNA ve geçici çift iplikli RNA tanıtmak için gerekli teknikleri göstermek için hedefliyor Pristionchus pacificus, Evrimsel gelişim ve davranış biyolojisi çalışmaları için.

Video: RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Çevre

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Biyomühendislik

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biyoloji

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target gene. In the nematode, C. elegans, RNAi is particularly easy and effective because it can be delivered simply by feeding the worms bacteria that express double stranded RNA (dsRNA) that is complementary to a gene of interest. First, this video will introduce the concept of RNA interference and explain how it causes targeted gene knockdown. Then, we will demonstrate a protocol for using RNAi in C. elegans, which includes preparation of the bacteria and RNAi worm plates, culturing of the worms, and how to assess the effects of RNAi on the worms. RNAi is frequently used to perform reverse genetic screens in order to reveal which genes are important to carry out specific biological processes. Furthermore, automated reverse genetic screens allow for the efficient knockdown and analysis of a large collection of genes. Lastly, RNAi is often used to study the development of C. elegans. Since its discovery, scientists have used RNAi to make tremendous progress on the understanding of many biological phenomena.

RNA Interference RNAi in Caenorhabditis elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target ...

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,