Biz Dr teşekkür ederim. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris ve verdikleri destek için Olga Chumakova. FlexStation 3 sisteminin UTHSC Cytodynamic Görüntüleme Tesis bir parçası. Ayrıca Dr teşekkür. Scripps Araştırma Enstitüsü ve HEK293-hTRPA1 istikrarlı hücre hattı sağlamak için Novartis Araştırma Vakfı (GNF) Genomik Enstitüsü Ardem Patapoutian ve Michael Bandell. Araştırma NIH (MXZ için GM081658) ve Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Merkezi (HH) ve Mission Bağlan / TIRR Vakfı (HH) hibe kısmen desteklenmektedir.

1. 96-kuyucuğu Hücre hazırlıkları CDNA insan TRPA1 geçici trasfected HEK293 hücreleri için <ol><li> HEK293 hücrelerin% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (Invitrogen, 16.000-044) ile desteklenmiş 4.5 mg / ml glikoz (Thermo Scientific, SH3002201) içeren Dulbecco&#39;nun Minimal Essential Orta 1-2 gün (DMEM), 50 adet için yetiştirilen / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin (Invitrogen, 15.140-163). Transfeksiyon gününde, hücre yoğunluğu% 70-90 ulaştırılması gerekmektedir. </li><li> Iyi 50 ul poli-L-ornitin (Sigma P3655, steril distile su içinde 20 mg / ml) ve 37 kuluçka ° C, en az 15 dakika boyunca pipetleme Coat 96-kuyucuğu. Dulbecco&#39;nun Fosfat her biri de bir kez durulayın Mg 2 olmadan Tamponlu Salin (DPBS) + ve Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Plaka, birkaç saat için hücre kültürü kaputu sol olabilir. </li><li> 96 plaka her kuyu için, 1.5 ml Eppendorf tüp 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31.985-070) 0.2 mg cDNA seyreltin. Aynı cDNA transfekte kuyu sayısına göre orantılı olarak büyütmek. Ayrıca 25 ul OPTI-MEM transfekte olmak için her sıra ayrı bir 1.5 ml Eppendorf tüp 0.4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11.668-019) sulandırmak. Transfekte için kuyu toplam sayısına göre bu kadar Ölçeği. </li><li> Kısaca vorteks seyreltilmiş cDNA ve Lipofectamine 2000 ve bunları yaklaşık 5 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Eşit hacimde sulandırılmış Lipofectamine 2000 seyreltilmiş cDNA, girdap içeren tüp transferi ve karışımı 15 dakika ila 2 saat oda sıcaklığında bekletin. Bu süre zarfında, 49 ul / poli-L-ornitin kaplı plaka Lipofectamine / cDNA 2000 karışımı aktarın. </li><li> HEK293 hücreleri (Adım 1.1) Trypsinize, bir hemasitometre veya Kontes otomatik hücre sayıcı (Invitrogen, C10227) kullanarak hücre yoğunluğu sayımı, ve 15 ml steril bir hücre istenilen miktarda transfer (genellikle yaklaşık ~ 125,000-150,000 hücre / kuyu) alt konik santrifüj tüpüne. 5 dakika için 1000 x RPM santrifüjleyin. % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile takviye DMEM kültür ortamı ~ 1,250,00-1,500,000 hücre / ml, ancak antibiyotik olmadan yeniden süspanse hücre. </li><li> Bir çok kanallı pipetter veya MicroFill Mikroplaka Dispenseri (Bio-Tek) kullanarak 2000 cDNA-Lipofectamine karışımı içeren her bir kuyunun 98 ul hücre süspansiyonu koyun. Plaka nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatör koymadan önce en az 30 dakika kaputu oturup edelim. Için 37 ° C,% 5 CO 2 ile 20-44 saat inkübe edin . </li></ol> Stably TRPA1 ifade HEK293 hücreleri için <ol start="8"><li> Adım 1.2 kat 96-kuyucuğu izleyin. </li><li> Cömertçe indüklenebilir HEK293-hTRPA1 hücre hattı (Invitrogen, Dr. A. Patapoutian (Scripps Araştırma Enstitüsü) tarafından sağlanan ve yabani tip HEK293 hücreleri (Adım 1.1) olarak aynı ortamda muhafaza ancak 5 mg / ml blasticidin ile desteklenmiş A1113902) ve 50 mg / ml hygromycin B (Invitrogen, 10.687.010). Hücre yoğunluğu yaklaşık% 90 ulaştığında, hücreler trypsinize hücre yoğunluğu saymak ve 5 dakika boyunca 1000 x RPM hücreler istenilen miktarda santrifüj. ~ 1.000.000 hücre / ml yoğunlukta doksisiklin (Fisher, BP26535, 0.25 mg / ml) ile takviye aynı kültür ortamında süspanse edin hücreleri. </li><li> Ul / iyi, çok kanallı pipetter veya MicroFill (Bio-Tek) kullanarak 100 poli-L-ornitin kaplı plakalar hücre süspansiyonu koyun. Plaka nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatör koymadan önce en az 30 dakika kaputu oturup edelim. 37 ° ° C&#39;de,% 5 CO 2 - 16 24 saat. </li></ol> 2. Çözümler <ol><li> Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS), ekstrasellüler çözüm olarak kullanılır. (MM) içerir: 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.25 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 pH 1N NaOH ile 7.4 &#39;e ayarlanır MgCl 2, 10 glikoz, 10 Hepes,). </li><li> Fluo-4 tahlil tampon HBSS içinde probenesid 2 mM içerir. 0,5 N NaOH 250 mM stok probenesid (Sigma, P8761) olun. HBSS için 1:125 bir oranında seyreltilir. 1 N HCl ile pH 7.4 yeniden ayarlayınız. </li></ol> 3. Hücre yükleme Fluo-4 AM <ol><li> 1 mM stok solüsyonu 912 ul susuz DMSO 1 mg Fluo 04:00 (Invitrogen, F14202) eritin. Fluo-4 en az bir ay için stok çözelti -20 ° C&#39;de saklanabilir AM. </li><li> 10 ul 1 mM karıştırın Fluo-4 10 ul Pluronic sonra F-127 (Invitrogen, P3000MP, DMSO içinde% 20 (w / v) solüsyonu) ve 5 ml Fluo-4 tahlil tamponu (Adım 2.2) tüm içeriği transfer ile AM (Sigma, A9418),% 0,1 Bovine serum albümin ile desteklenmiştir. </li><li> Mikroplak yıkayıcı (Bio-Tek gelen ELx405TM gibi) kullanarak 80 ul / 2 kez HBSS (Adım 1.7 veya 1.10) 96-kuyucuğu yetiştirilen hücreler yıkayın. </li><li> Fluo-4 Ul / çok kanallı bir pipetter veya MicroFill (Bio-Tek) kullanarak ve 37 plaka inkübe 50 (Adım 3.2) çözümü yükleme PM ° C 1 saat. </li><li> ELx405TM mikroplak yıkayıcı kullanarak Fluo-4 tahlil tampon (Adım 2.2.) Hücreleri 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir kuyunun Fluo-4 tahlil tampon 80 ul bırakın. </li></ol> 4. Bileşik plaka hazırlanması <ol><li> 1 saat hücre yükleme dönemde, 3x Fluo-4 tahlil tampon istenilen son konsantrasyonlarının agonistleri (veya antagonistleri) 3x dilüsyonları bir dizi hazırlamak. </li><li> 96-iyi bir bileşik plaka seyreltilmiş bileşik çözümler Pipet 250-300 ul. FlexStation 3, bir defada tek bir sütun okur çünkü mümkün olduğunda bileşik plaka aynı sütun ve ilgili pozitif ve negatif kontroller bir bileşik seri dilüsyonları ettirmelisiniz. </li></ol> 5. Plaka okuma FlexStation 3 <ol><li> (FlexStation 3, bilgisayar ve SoftMax Pro 5.2 yazılım) sistemi açın </li><li> Deney yeni bir dosya adı ile kaydedin. Set-up, ESNEK modunu seçin ve aşağıdaki değerleri girin: </li></ol> Protokol # 1, agonist etkisi <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tablo 1" /> Protokol # 2, antagonist etkisi <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tablo 2" /><ol start="3"><li> Yeni bir uç kutusu, bileşik plakası ve plaka okuma, 3 FlexStation uygun tepsilere yerleştirin ve &quot;oku&quot; butonuna tıklayın. FlexStation 3 Bir kerede bir sütun okumak ve önceden programlanmış zaman noktalarında bileşikler okuma kesmeden katacak. Bir sütun ve makine adım 5.2 &#39;de kullanıcı tarafından programlanan tüm sütunlar okunur kadar yapılan bileşik eklemelerle sonraki sütun okumak için devam edecektir okuma bitirmek için yaklaşık 3 dakika (Protokol # 2 için 5 dakika) sürer. </li></ol> 6. Veri analizi <ol><li> Deneysel veriler SoftMax Pro 5.2 yazılımını kullanarak doğrudan veya kopyalanan ve Microsoft Excel gibi herhangi bir elektronik tablo programı içine yapıştırılan işlenebilir. TRPA1 agonist flufenamic asidi (FFA) konsantrasyon-yanıt eğrisi aşağıdaki en küçük kareler uydurma rutin kullanarak inşa edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> Y gözlenen tepki olduğu, Y max normalize edilmiş maksimum tepki, C, ilgili ilaç konsantrasyonu, EC 50, yarı-maksimum bir tepki uyarılmış konsantrasyon ve n H görünürdeki Hill katsayısı. Varsayılan TRPA1 antagonisti bileşik Konsantrasyon-inhibisyon eğrisi FFA (100 mcM) sabit bir konsantrasyonu ve kademeli olarak aşağıdaki uyan en küçük kareler ile hesaplanan bileşik bileşik IC 50 değeri A. konsantrasyonu arttırarak elde edilir denklemi. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> , Burada gözlenen yanıt Y ve Y maksimum pik yanıt normalize [Ant] karşılık gelen bileşik A toplama, IC 50 FFA-uyarılmış yanıt yarı-maksimum inhibisyonu üreten antagonist konsantrasyonu ve n H görünürdeki Tepesi katsayısı. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: TRPA1 + duyarlı boya Ca 2, Fluo-4 (1-2) ile tespit edilebilir kalsiyum akınına yol açar aktivasyonu Ca 2 +-geçirgen katyon kanal,. HEK293-hTRPA1 istikrarlı bir hücre hattı TRPA1 agonistleri ve antagonistleri konsantrasyon-yanıt ilişkileri incelemek için kullanılmıştır. Hücreler, Fluo-04:00 yüklenen 80 ul tahlil tampon yerleştirilir ve FlexStation 3 kullanılarak okunabilir. 30 s için temel floresan kaydettikten sonra, bir seri seyreltme TRPA1 agonist, FFA 40 ul, her istenilen nihai konsantrasyonu 3x akışkansal modülünün bir parçası olarak dahil bir multi-kanal pipetter aracılığıyla hücrelere ilave edildi FlexStation 3. Floresan değişiklikler ek bir 180 s. monitörize edildi Sırasıyla F ve F 0 faiz ve okuma başında zaman floresan değerlerdir - (F 0 F), her bir kuyu için göreceli Fluo-4 floresan değişiklikleri mesafe kadar taşınmış = ifade edildi. FFA konsantrasyonlarının bir dizi yanıt floresan değişikliklere zamanlı kurslar Temsilcisi izleri Şekil. 1. Maksimal yanıt düzeyleri benzer olmasına rağmen, alt FFA konsantrasyonlarda daha yüksek aktivasyon kinetiği açıkça daha hızlıdır, son dört FFA konsantrasyonları için dikkat edin. Bu nedenle, bu farklılıkları ayırt etmek için, konsantrasyon-yanıt ilişkisi üzerine ilk floresan artış oranları (eğim) FFA değişik konsantrasyonlarda (Şekil 2) ek ölçüm tarafından inşa edilmiştir. Yarım maksimal etkisiFFA ive konsantrasyonu (EC 50) 55.4 mcM (n = 3) olarak tespit edilmiştir. Varsayılan TRPA1 antagonisti test etmek için, bir bileşik, protokol # 2 (Adım 2) kullanarak benzer bir deney gerçekleştirdi. Bu durumda, bir dizi antagonisti dilüsyonlarının 30 s (3x istenilen son konsantrasyonlarının 40 ul) ilave edildi ve FFA (100 mcM son bir konsantrasyon için 300 mcM 60 ul) sonra 180 ler eklendi. Bileşik bir doz-yanıt bağımlı 4.3 mcM yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC 50) (n = 3) (Şekil 2) ile FFA TRPA1 hücreleri azalır. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> FFA insan TRPA1 Şekil 1. Konsantrasyon bağımlı aktivasyonu. İzler zamanla floresan FFA-uyarılmış artış (sadece ilk 60 s tepkiler FFA-uyarılmış yanıtlar hızlı kinetiği daha iyi göstermek için gösterilmiştir). Yüksek konsantrasyonlarda FFA ile floresan artış uyarılmış olduğunu lütfen unutmayınız çok düşük konsantrasyonlarda daha hızlı kinetik, zirve floresan seviyeleri benzer olmasına rağmen. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 Konsantrasyon - FFA indüklenen floresan değişim ve bileşik stably HEK293 hücrelerinde ifade insan TRPA1 FFA yanıtı indüklediği inhibisyonu için tepki ilişkileri. Δ, konsantrasyon - FFA yanıt ilişkisi üzerine ilk normalize floresan artış oranları (eğim) FFA konsantrasyonları değişen ek ölçerek tespit edildi. O, varsayılan TRPA1 antagonisti FFA-uyarılmış kalsiyum yanıt inhibisyonu Konsantrasyon-yanıt ilişkisi, bileşik A.

<ol>
	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons.">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li><li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females.">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li><li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2++-+and+membrane+potential-sensitive+dyes:+advantages+and+potential+problems.">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li><li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Hücre içi Ca 2 +, nörotransmitter sürüm (3), kardiyak aksiyon potansiyeli (4), kas hücresi kasılma (5), hücre sinyal iletimi (6-7) ve eksitotoksik hücre ölümü (gibi pek çok fizyolojik ve patolojik koşullar, önemli bir rol oynar 8). Hücre içi Ca 2 + seviyeleri ölçümü fonksiyonel değişiklikler ve Ca 2 + geçirgen kanallar plazma zarı ya da hücre içi organelleri katkısı aydınlatmak için yardımcı olur Ca 2 + yukarıdaki süreçleri (9-13). Ta...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Peki, FlexStation pipetleyin İpuçları </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Peki Tabaklar </td><td> Greiner Bio-one </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Peki Temizle Düz Taban plakaları </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> PM fluo-4 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-ornitin </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenesid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albumini </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

Moleküler Aygıtlar FlexStation 3, çok iyi plakaları otomatik floresan ölçüm yeteneğine bir masa üstü multi-mode mikroplaka okuyucu. Akademik ayarları orta-yüksek verimli ekranlar için idealdir. Bu bir multi-kanal pipetter ve makinenin bir defada bir çok floresan reaktiflerin floresan değişiklikleri izlemek için bir sütun okur ile donatılmış entegre bir sıvı aktarım modülü vardır. Örneğin, FlexStation 3 Ca 2 + geçirgen iyon kanalları ve G-protein reseptörler hücre içi serbest Ca 2 + düzeyleri değişiklikleri ölçerek işlevini incelemek için kullanılmıştır. Geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalları, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynamaktadır seçici olmayan katyon kanalları büyük bir aileyiz. TRP kanalları çoğu kalsiyum geçirgen ve etkinleştirme sırasında kalsiyum akını neden. Bu video, TRPA1 kanal, çok sayıda Ağrılı uyaranlara için bir moleküler sensör farmakolojik profil çalışma FlexStation 3 uygulama göstermektedir. Geçici ya da stabil bir şekilde 96-kuyucuğu yetişen insan TRPA1 kanal, ifade HEK293 hücreleri floresan boya + duyarlı Ca 2, Fluo-4, ve bu hücrelerin gerçek zamanlı floresan değişiklikler ile yüklenen uygulama öncesi ve sırasında ölçülen FlexStation 3 FLEX modunu kullanarak bir TRPA1 agonist. Varsayılan TRPA1 antagonisti etkisi de incelenmiştir. Veri SoftMax Pro yazılımı TRPA1 aktivatörleri ve inhibitörleri konsantrasyon-yanıt ilişkileri oluşturmak için transfer edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Bu video FlexStation 3 kullanarak insan TRPA1 kanalları farmakolojik profili çalışmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Protokol hücre hazırlama, boya yükleme ve mikroplaka okuyucu, FlexStation 3 operasyon detayları kapsar.

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.0K Görüntüleme.  The University of Texas Health Science Center at Houston. Bu video FlexStation 3 kullanarak insan TRPA1 kanalları farmakolojik profili çalışmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Protokol hücre hazırlama, boya yükleme ve mikroplaka okuyucu, FlexStation 3 operasyon detayları kapsar.

Video: Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Biyokimya

<meta charset="utf8"></head><body>Endotel Hücrelerinde Proteaz ile aktive olan reseptör ligandlarının incelenmesi

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding dyes and imaging instruments that can measure fluorescent emissions from up to 1,536 wells simultaneously. However, these instruments are much more expensive and can be challenging to maintain relative to widely available plate readers that scan wells individually. Described here is an optimized plate reader assay for use with an endothelial cell line (EA.hy926) to measure the protease-activated receptor (PAR)-driven activation of G&#945;q signaling and subsequent calcium mobilization using the calcium-binding dye Fluo-4. This assay has been used to characterize a range of PAR ligands, including the allosteric PAR1-targeting anti-inflammatory "parmodulin" ligands identified in the Dockendorff lab. This protocol obviates the need for an automated liquid handler and permits the medium-throughput screening of PAR ligands in 96-well plates and should be applicable to the study of other receptors that initiate calcium mobilization.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Enflamasyon Kontrolü için Proteaz ile Aktive Edilen Reseptörleri Hedeflemek için Parmodulinlerin Geliştirilmesi

An improved protocol for a calcium mobilization assay with endothelial cells, used to identify ligands of protease-activated receptors (PARs), has been developed. The new protocol reduces total assay time by 90-120 min and yields reproducible concentration-response curves.

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Biyoloji

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Nörobilim

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include well-validated targets for therapeutic intervention. Discovery of lead compounds, including small synthetic molecules, that specifically inhibit the receptor&#39;s function, is an important initial step in drug development and relies on sensitive, specific, and robust cell-based assays. Here, we describe a kinetic cellular assay with a fluorescent readout primarily designed to identify receptor-specific antagonists that inhibit the intracellular Ca2+ release evoked upon the activation of the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) by its endogenous ligand, the CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). A key advantage of this method is that it also enables screening of compounds endowed with intrinsic agonistic properties (i.e., compounds eliciting an increase in intracellular Ca2+ concentration in the absence of CXCL12) or compounds modulating the receptor&#39;s function via interaction with allosteric binding sites (i.e., positive and negative allosteric modulators (PAMs and NAMs, respectively)). On the down side, autofluorescent compounds might interfere with the assay&#39;s readout, thereby hampering reliable data interpretation. Most likely this assay can be implemented, with minimal adaptations, as a generic drug discovery assay for many other GPCRs of which the activation leads to a release of intracellular Ca2+.

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

The described cellular assay is designed for the identification of CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interacting agents that inhibit or stimulate, either competitively or allosterically, the intracellular Ca2+ release initiated by CXCR4 activation.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Tıp

Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new therapeutics. Mas related G-protein receptor-X2 (MRGPRX2) is an important receptor that regulates mast cell activation and, thus, directs the general immune response. Numerous ligands for MRGPRX2 have been identified and include endogenous peptides like PAMPs, defensins, LL-37 and other protein fragments (i.e., degraded albumin). Further identification of MRGPRX2 specific ligands requires the screening of a large number of peptides (i.e., peptide library); however, mast cells are difficult and expensive to maintain in vitro and, therefore, not economical to use for screening large numbers of molecules. The present paper demonstrates a method to design, develop, and screen a library of small peptide molecules using MRGPRX2 expressing HEK cells. This cell line is relatively easy and inexpensive to maintain and can be used for in vitro high-throughput analysis. A calcium sensitive Fura-2 fluorescent dye to mark intracellular calcium flux upon activation was used to monitor the activation. The ratio of fluorescence intensity of Fura-2 at 510 nm against excitation wavelengths of 340 and 380 nm was used to calculate calcium concentration. The peptide library used to verify this system was based on the endogenous proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) secretagogue, which is known to bind MRGPRX2 with high specificity and affinity. Subsequent peptides were generated through amino acid truncation and alanine scanning techniques applied to PAMP-12. The method described here is simple and inexpensive yet robust for screening a large library of compounds to identify binding domains and other important parameters that play an important role in receptor activation.

Techniques for generating a library of short peptides that can activate mast cells via the MRGPRX2 receptor are described. Associated techniques are easy, inexpensive, and can be extended to other cell receptors.

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. Genetically encoded calcium indicators (GECIs) with multiple emission windows can be combined (e.g., for simultaneous observation of distinct subcellular events) or used in extended applications with other light-dependent actuators in excitable cells (e.g., combining genetically encoded optogenetic control with spectrally compatible calcium indicators). Such approaches have been used in primary or stem cell-derived neurons, cardiomyocytes, and pancreatic beta-cells. However, it has been challenging to increase the throughput, or duration of observation, of such approaches due to limitations of the instruments, analysis software, indicator performance, and gene delivery efficiency. Here, a high-performance green GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), and red-shifted GECI, K-GECO, is combined with optogenetic control to achieve all-optical control and visualization of cellular activity in a high-throughput imaging format using a High-Content Imaging System. Applications demonstrating cardiotoxicity testing and phenotypic drug screening with healthy and patient-derived iPSC-CMs are shown. In addition, multi-parametric assessments using combinations of spectral and calcium affinity indicator variants (NIR-GECO, LAR-GECO, and mtGCEPIA or Orai1-G-GECO) are restricted to different cellular compartments are also demonstrated in the iPSC-CM model.

The present protocol describes all-optical control and observation of triggered cellular activity in iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) for high throughput drug screening and toxicity testing. Multi-parametric quantification of phenotypic patterns in time, and space, are shown. Long-term effects of drugs over hours, or sequential measurements over days, are demonstrated.

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca^{2 +} seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi