<p class="jove_content"> Bu çalışma, Alman Bilim Vakfı (DFG) ve Alman federal ve eyalet hükümetleri Mükemmellik Girişimi tarafından finanse edildi. </p>

<p class="jove_title"> 1. Bitki materyali, Crosslinking </p><ol><li> Hasat 1-2g Arabidopsis 50 ml plastik tüp yaprak (6, 10 cm rozet çapa kadar) ve crosslinking tampon ile 40ml kadar doldurmak. </li><li> Yaprakları, tampon yüzeyi üzerinde özel bir filtre süngeri sağ doldurma, örneğin dalmış muaftır emin olun. Sonra bir desikatöre tüpler yerleştirin. </li><li> Vakum 10dk sızmak. Crosslinking durdurmak için her tüp 2M glisin 2.5ml eklemek ve glisin eşit dağılımını garanti tüpler ters. </li><li> Vakum başka bir 5min sızmak ve bir elek üzerinde yaprakları hasat sırasında sıvı atın. </li><li> Yıkama 1L, sonra bir bardak beher su, kağıt havlu ile iyice kuru yapraklar ile iki kez bırakır. </li><li> Taze bir plastik tüp yaprakları toplayın ve sıvı nitrojen içinde dondurarak. Mağaza -80 ° C kadar kromatin izolasyon bırakır. </li></ol><p class="jove_title"> 2. Kromatin izolasyonu </p><ol><li> Yapraklar kullanana kadar sıvı azot tutuldu harç ve dişilik organı ile zemin. </li><li> 50-ml plastik tüp toz transferi ve 30ml ekstraksiyon tamponu # 1 geçici olarak askıya. </li><li> Bir tepegöz çalkalayıcı 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe. </li><li> 50-ml taze bir plastik tüp içine dört kat miracloth boyunca Filtrat süspansiyon. </li><li> 2.800 xg 20min için Spin 4 ° C </li><li> Süpernatantı ve 1 ml tampon ekstraksiyon # 2 fırça ile pelet askıya. İlk tampon # 2 küçük bir hacim eklemek, sonra pelet bir boya fırçası ile askıya alma ve sonra tampon geri kalanını ekleyin. </li><li> 4 12,000 xg&#39;de 10 dakika süreyle bir 1.5mL mikrofuge&#39;ye tüp ve spin süspansiyon transfer ° C </li><li> Bu arada, 1.5mL ekstraksiyon tamponu # 3 içeren 2mL mikrofuge&#39;ye tüpleri hazırlayın. </li><li> Bükülmüş tüp (adım 2.7) süpernatantı ve ekstraksiyon tamponu # 3 300μL pelet askıya. İlk olarak, tampon # 3 küçük hacimli bir boya fırçası ile pelet askıya, ve sonra geri kalan tampon eklemek. </li><li> Dikkatle pipetlemeyin adım 2.8 &#39;de hazırlanan 1,5 mL tampon ekstraksiyon # 3 üst pelet (adım 2.9) askıya aldı. Iki faz karışımı olmayacak emin olun. 4 16.000 xg&#39;de 1s için Spin ° C. </li><li> Süpernatantı ve sonication tampon 300μL bir boya fırçası ile kromatin pelet askıya. </li><li> DNA boyutu yaklaşık 400bp Sonotrode ile ya da ultrasonik banyoda kromatin sonikasyon. Sonicating zaman, emin kromatin yaklaşık 30 üzerinde ısıtılır ° C ısıya duyarlı çapraz bağları korumak için olun. Sonication süresi farklı sonication cihazlar arasında önemli ölçüde farklılık gösterir, çünkü deneysel olarak belirlenir. Rehberlik için, iki farklı aygıtlar için ayarları verilmiştir: </li></ol><p class="jove_content"> 0.6mL mikrofuge&#39;ye tüp Bandelin marka Sonotrode maruz kromatin% 25 güç, çevrim = 50 ayarları ile beş kez 20 patlamaları ile sonication. Bunu yaparken, bir buz banyosunda her 20 <sup>inci</sup> patlamaları sonra serin bir örnek . </p><p class="jove_content"> Diagenode Bioruptor ultrasonik banyo ile sonication için, su banyosu ve buz ile doldurun ve &#39;yüksek&#39; ayarı ile 1.5mL mikrofuge&#39;ye tüpler 30 saniye on kat sonikasyon. Her 30 saniye sonra, başka bir 30 saniye boyunca serin örnekleri. </p><ol start="13"><li> Spin 4 16.000 g 5min için örnek sonicated ° C çözünmemiş malzeme hızlandırabilir. Süpernatant doğrudan immunoprecipitation için kullanılabilir. Alternatif olarak, numuneler, sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C ye kadar daha fazla kullanım saklanan şok olabilir. </li></ol><p class="jove_title"> 3. Immunoprecipitation </p><ol><li> 40μL protein-A antikor bağlayıcı tampon agaroz ve 1.8mL. Içeren 2 ml mikrofuge&#39;ye tüpleri hazırlayın Kromatin hazırlık 200μL (adım 2.13) ekleyin. </li><li> Havai bir çalkalamalı 1s tüpleri inkübe edin. </li><li> Protein-A agaroz boncuk atın ve immunoprecipitation için supernatant kullanabilirsiniz. </li><li> Kromatin konsantrasyonu (&#39;input&#39;) belirlemek için bir 40μL-kısım çıkarın. </li><li> 30μL protein-A agaroz ve 400μL sonicated kromatin süspansiyon özgü reaktifler ve teçhizat aşağıdaki tabloda belirtilen değişiklik-spesifik antikor miktarı. </li><li> Bir tepegöz çalkalayıcı 2.5h veya gece boyunca inkübe 4 ° C </li><li> 440 x g. 2min için boncuk aşağı Spin </li><li> Boncuk pelet 900μL (aşağıdaki listeye bakın) her yıkama tamponu ile yıkayın. Her tampon için, bir havai çalkalayıcı 4 ° C, 10 dakika süreyle tampon inkübe boncuk, sonra 440 xg&#39;de 2min dönmeye supernatant atın ve bir sonraki tampon eklemek. <ol><li> Düşük tuz yıkama tamponu </li><li> Yüksek tuz yıkama tamponu </li><li> LiCl yıkama tamponu </li><li> Te yıkama tamponu </li></ol></li><li> Son yıkamadan sonra, kalan herhangi bir tampon tamamen kaldırmak. </li></ol><p class="jove_title"> 4. Histon ve DNA De-crosslinking ve çöktürülmüş DNA saflaştırılması </p><ol><li> Agaroz pelet ve 3.4 adım 40μl &#39;giriş&#39; örnek bir vorteks karıştırıcı 5min için karışımı, spin örnekleri ve incu de crosslinking tampon 100μL ekle65 ° C gecede kesilmek. </li><li> Ticari bir DNA veya PCR saflaştırma kiti ile DNA arındırın. </li><li> Genellikle son sütun eluat 01:05 seyreltme 5μl gerçekleştirmek için yeterli geleneksel lokus spesifik gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol><p class="jove_title"> 5. Tamponların Tablosu </p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Crosslinking tampon</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Formaldehit </td><td> % 3 (v / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Ekstraksiyon tamponu # 1</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Ekstraksiyon tamponu # 2</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Ekstraksiyon tamponu # 3</strong> </td></tr><tr><td> Sodyum bütirat </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 0,15 (w / v) </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Sonikasyon tampon</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 25mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 0.5 (w / v) </td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Antikor bağlanma tampon</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 50mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 0,1 (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Düşük tuz yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 0,1 (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Yüksek tuz yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 0,1 (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> Lityum klorür </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> % 1 (v / v) </td></tr><tr><td> Sodyum desoxycholate </td><td> % 1 (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Te yıkama tamponu</strong> </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking tampon</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 6.8 </td><td> 62.5mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> % 2 (w / v) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10mM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6. Temsilcisi sonuçları: </p><p class="jove_content"> <em>Arabidopsis thaliana PR2</em> savunma gen ekspresyonu bir β kodlamaAntimikrobiyal aktivite <sup>12,</sup> 1,3-Glukanaz benzothiadiazole (BTH), bitki hormonu salisilik asit <sup>3</sup> sentetik bir analog tarafından sağlandı. <strong>Şekil 1</strong> <em>PR2</em> ifade aktivasyonunun gösterir histon lizin kalıntılarının asetilasyon bir artış ile ilişkili <em>PR2</em> organizatörü H3 ve H4. Nucleosome yoğunluğu <sup>13</sup> gen aktivasyonu sırasında azalır histon 3 değişmeyen bir bölge için bir antikor ile elde edilen sinyalin, histon asetilasyonu değerleri normalize edildi. </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="Şekil 1"/><br /> <strong>Şekil 1 BTH Arabidopsis <em>PR2</em> organizatörü histon asetilasyonu neden olur.</strong> Bitkiler 100μM BTH veya ıslatılabilir toz kontrolü ile tedavi edildi. 72h sonra, yapraklar toplanmış ve kromatin izole edilmiştir. Asetilasyon özel antikorlar (resimde gösterildiği gibi) ile yağış sonrası elde edilen sinyal histon H3 değişmeyen bir etki alanı için bir antikor ile yağış elde sinyaline normalize edildi. Çöktürülmüş kromatin RT-qPCR tarafından belirlendi. Veri BTH tedavi yokluğunda histon değişiklik seviyeleri için standardize edilmiştir. </p>

<ol>
	<li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin.">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em style='font-style: italic'>EMBO rep</em>. <b>3</b>, 224-229 (2002).</li><li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3:+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic.">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <b>25</b>, 15-30 (2007).</li><li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response.">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em style='font-style: italic'>EMBO rep</em>. <b>12</b>, 50-55 (2011).</li><li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter.">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Cell</em>. <b>18</b>, 119-132 (2006).</li><li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize.">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Physiol</em>. <b>141</b>, 1078-1088 (2006).</li><li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis.">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Physiol</em>. <b>143</b>, 1660-1668 (2007).</li><li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+GCN5,+HD1,+and+TAF1/HAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression.">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Cell</em>. <b>18</b>, 2893-2903 (2006).</li><li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+techniques+for+plant+cells.">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Journal</em>. <b>39</b>, 776-789 (2004).</li><li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation.">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em style='font-style: italic'>Trends Biochem. Sci</em>. <b>25</b>, 99-104 (2000).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Meth</em>. <b>3</b>, 11-11 (2007).</li><li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize.">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em style='font-style: italic'>Plant J</em>. <b>53</b>, 465-474 (2008).</li><li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+in+Arabidopsis.">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em style='font-style: italic'>Plant Cell</em>. <b>4</b>, 645-656 (1992).</li><li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+displacement+in+transcription.">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em style='font-style: italic'>Genes Develop</em>. <b>20</b>, 2009-2017 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"> Çıkar çatışması ilan etti. </p>

<p class="jove_content"> Protokolde en kritik adımlar, DNA ve histon, yaprak malzemenin türü ve miktarı, malzemenin taşlama, ve kromatin sonication crosslinking. Bu konularda daha ayrıntılı bir tartışma için, refs bakın. 9 ve 10. </p><p class="jove_step"> Sonikasyon ve crosslinking: </p><p class="jove_content"> 400bp hakkında parçaları sonication sırasında kromatin bozmak için önemlidir. Ise yetersiz sonication uzun kromatin parçaları bırakacaktır kapsayan sonication, DNA ve histon bozarak kromatin yok edecektir. Distal histon modifikasyonları test lokus yerel değişiklikler ayırt edilemez, çünkü bu yöntemin özgüllüğü etkileyebilir. Sonikasyon verimliliği en iyi örneklerinden DNA izole ve uzunluğu makaslanmış DNA agaroz jel elektroforezi ile belirlenmesi, Sonikasyon, de-crosslinking DNA ve histon önce ve sonra 20μL kromatin toplayarak test edilir. Kromatin hazırlık hala parçalanmış DNA görselleştirme etkileyebilir arıtma bu aşamada, büyük miktarda RNA içerdiğinden RNAse elektroforez önce numuneleri eklenmelidir. Makaslanmış Kromatin DNA DNA 400bp etrafında maksimum sinyal yoğunluğu olmayan makaslanmış Kromatin DNA 10kbp daha uzunsa bir karalama formları ise örnekleri, kromatin immunoprecipitation için yararlıdır. </p><p class="jove_content"> Biz rutin olduğu gibi bırakır kromatin crosslinking için% 3 (v / v) formaldehit kullanır, ancak% 1 (v / v) formaldehit, çoğu durumda yeterli olabilir. Bizim ellerde, düşük formaldehit konsantrasyonları sonucu PCR reaksiyonlarında kısa sonication kez ve arka plan sinyalleri için izin verir. Ancak, yeterli miktarda formaldehit genellikle bağımsız deneyler arasındaki PCR sinyali düşük tekrarlanabilirlik. Bu düşük konsantrasyonlarda formaldehid ile yaprak yetersiz nüfuz etmesine bağlı olabilir. Bileşik süre ile polimerize eğilimi sık sık formaldehit hisse senedi alışverişi yapmak emin olun. Formaldehit çözümleri yalnızca yaklaşık bir ay boyunca stabildir ve bu dönemde pek metanol istikrar uzamıştır. Bu deneysel koşullar kurarken farklı formaldehit konsantrasyonları test etmek için tavsiye edilir. </p><p class="jove_step"> Bitki materyali ve taşlama miktarı: </p><p class="jove_content"> Yaprakların birbirine yapışmasını önlemek için tampon büyük bir hacim düşük miktarda yaprak malzeme sızmak için çok önemlidir. Yaprak formaldehit yetersiz infiltrasyonu genellikle sonuçları yapışmasını. Ayrıca, çok fazla bitki materyali miracloth doku gözenekleri bloke eder. Öğütme verimliliği önemli ölçüde mükemmel bir uyum ile bir havanda kullanarak bağlıdır. Biz rutin olarak ek sıvı azot yokluğunda bir sıvı azot soğutmalı havaneli ve harç ile öğütmek için üç kez 50 saniye kadar malzeme ince bir toz için zemin. </p>

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Protein-A-Agaroz </td><td> Roche </td><td> 11 134 515 001 </td><td> antikor sınıfı bağlıdır. </td></tr><tr><td> Protein-G-Agaroz </td><td> Roche </td><td> 11 243 233 001 </td><td> antikor sınıfı bağlıdır. </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> biz 1μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-asetil-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> biz 1μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-trimetil-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003-50 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-dimetil-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> biz 5μL kullanılan </td></tr><tr><td> Anti-monometil-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10μL </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> histon yoğunluğu kontrol etmek için 1μL kullanılan </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü </td><td> Roche </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of histone modifications in plant leaves

<p class="jove_content"> Kromatin yapısı ökaryotlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesi için önemlidir. Bu süreçte, histon H3 ve H4 amino-terminal kuyrukları kromatin remodeling, DNA metilasyon ve kovalent değişiklikler temel rolleri <sup>1-2</sup> oynamaktadır. H3 ve H4 histon modifikasyonları, lisin ve arjinin metilasyon, lisin asetilasyonun, serin <sup>kalıntıları</sup> 1-2 fosforilasyon içerir . Bu modifikasyonlar gen aktivasyonu, baskı ya da uygun sinyalleri (mikrop-ilişkili moleküler desenleri, ışık, hormonlar, vs.) <sup>3-7</sup> algı sonra ifade daha hızlı ve sağlam bir aktivasyon destekler gen astarlanmalıdır bir devlet ya ilişkilidir . </p><p class="jove_content"> Burada, biz, özel seçilmiş bitki genleri kromatin modifikasyonları güvenilir ve hassas tespiti için bir yöntem mevcut. Teknik değişiklik-spesifik antikorların <sup>9,10</sup> ile <sup>8,9</sup> formaldehit, ekstraksiyon ve kromatin, kromatin immunoprecipitation (ChIP) sonication (modifiye) histon ve DNA çapraz bağlanma dayalı, histon-DNA kompleksleri de-crosslinking gen belirli gerçek zamanlı kantitatif PCR. Yaklaşım, <sub>C</sub> 4 <sup>mısır</sup> 5,11 fotosentez ve <sup>Arabidopsis</sup> 3 sistemik bağışıklık ile ilgili özel histon modifikasyonları tespit için yararlı olduğu kanıtlanmıştır . </p>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Histone Modifications in Plant Leaves at JoVE.com

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content">Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.</p>

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Görüntüleme.  RWTH Aachen University. Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.

Video: Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in <em>Magnaporthe oryzae</em>

<p class="jove_content">Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription factors (TFs), chromatin regulators, and histone modifications, as well as detecting entire genomes for uncovering TF binding patterns and histone posttranslational modifications. Chromatin-modifying activities, such as histone methylation, are often recruited to specific gene regulatory sequences, causing localized changes in chromatin structures and resulting in specific transcriptional effects. The rice blast is a devastating fungal disease on rice throughout the world and is a model system for studying fungus-plant interaction. However, the molecular mechanisms in how the histone modifications regulate their virulence genes in <em>Magnaporthe oryzae </em>remain elusive. More researchers need to use ChIP-seq to study how histone epigenetic modification regulates their target genes. ChIP-seq is also widely used to study the interaction between protein and DNA in animals and plants, but it is less used in the field of plant pathology and has not been well developed. In this paper, we describe the experimental process and operation method of ChIP-seq to identify the genome-wide distribution of histone methylation (such as H3K4me3) that binds to the functional target genes in <em>M. oryzae. </em>Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.</p>

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

<p class="jove_content">Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.</p>

<em>Magnaporthe oryzae'de</em> Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Genetik

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

<p class="jove_content">Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.</p>

<p class="jove_content">The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.</p>

Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Biyokimya

Histon Proteomik Analizi ve Translasyon Sonrası Modifikasyon Karakterizasyonu

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

<p class="jove_content">Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as posttranslational modifications (PTMs). Identifying the position and nature of each PTM or pattern of PTMs in reference to external or genetic factors allows this information to be statistically correlated with biological responses such as DNA transcription, replication, or repair. In the present work, a high-throughput analytical protocol for the detection of histone PTMs from biological samples is described. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) enables the separation and PTM assignment of the most biologically relevant modifications in a single analysis. The described approach takes advantage of recent developments in dependent data acquisition (DDA) using parallel accumulation in the mobility trap, followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. Histone PTMs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.</p>

Yazar Spotlight: LC-TIMS-ToF MS/MS ve PASEF aracılığıyla gelişmiş histon PTM izomer tanımlaması

<p class="jove_content">An analytical workflow based on liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) for high confidence and highly reproducible "bottom-up" analysis of histone modifications and identification based on principal parameters (retention time [RT], collision cross section [CCS], and accurate mass-to-charge [<em>m/z</em>] ratio).</p>

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

Kimya

<meta charset="utf8"></head><body><p>Histon İzoform Zenginleştirme ve PTM Karakterizasyonu için 2D Jel Ayırma</p>

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

<p class="jove_content" fo:break-after="page">Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which control nucleosome dynamics and determine cell fate. The nucleosome, which is the functional unit of chromatin, comprises DNA, four pairs of histones (H3, H4, H2A, and H2B) making up the globular core, and the linker histone H1, which stabilizes the chromatin structure. The amino (N)-terminal tails of the histones protrude from the globular core domains and undergo distinct PTMs that influence the chromatin landscape. Some evidence suggests that histone PTM homeostasis is crucial for preserving all physiological activities. The deregulation of histone PTMs is the primary cause of abnormal cellular proliferation, invasion, and metastasis. Therefore, developing methods for characterizing histone PTMs is crucial. Here, we describe an effective technique for isolating and analyzing histone isoforms. The method, based on the combination of two orthogonal separations, allows the enrichment of histone isoforms and the following mass spectrometry identification. The technique, originally described by Shechter et al., combines acid-urea polyacrylamide gels (TAU-GEL), which can separate basic histone proteins based on size and charge, and Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE), which can separate proteins by molecular weight. The result is a two-dimensional map of histone isoforms, suitable for in-gel digestion followed by mass spectrometry identification and western blot analysis. The result is a two-dimensional map of histone isoforms, suitable for both in-gel digestion followed by mass spectrometry identification and western blot analysis. This proteomic approach is a robust method that allows the enrichment of a single histone isoform and the characterization of new histone PTMs.</p>

<meta charset="utf8"></head><body><p>Yazar Spotlight: Kanser Tedavisi için Hedef Olarak Epigenetik Modifikasyonlar ve Metabolik Yeniden Kablolama</p>

<p class="jove_content">This method describes a simple and fast strategy for histone proteoform characterization and investigation. </p>

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

<p class="jove_content">Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection <em>via </em>the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.</p>
<p class="jove_content">Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.</p>
<p class="jove_content">This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.</p>

<p class="jove_content">We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.</p>

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Biyoloji

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in <em>Arabidopsis</em>

<p class="jove_content">In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.</p>
<p class="jove_content">Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded <em>Arabidopsis</em> ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence <em>in situ</em> hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.</p>

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

<p class="jove_content">We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence <em>in&#160;situ</em> Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount <em>Arabidopsis thaliana</em> ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.</p>

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem