Bu çalışma NS042228 MCH Olympus FV1000 konfokal UW Zooloji Bölümü (PI Bill Bement) için bir NIH paylaşılan enstrümantasyon hibe S10RR023717 ile satın alındı ​​R01 NIH tarafından desteklenmiştir. Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.

1. Enjeksiyon slaytlar ve görüntüleme slaytlar Meclisi Enjeksiyon slaytlar: <ol><li> Sylgard silikon elastomer üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. </li><li> Bond üç standart cam mikroskop Sylgard kullanın kesiştiği uzun kenarları yan yana düzenlenmiş olan diğer iki slaytlar, üstüne bir slayt istifleme birlikte slaytlar. Üst slayt dik açılı bir köşesinde ya da üst ve alt slaytlar arasında &quot;duvar&quot; oluşturur. </li><li> Sylgard gecede ayarlanmış olsun. Bu slaytları yeniden kullanılabilir. </li></ol> Görüntüleme slayt: <ol><li> Odasına mikroskop sahnede slayt sahibinin uygun şekilde standart bir cam mikroskop lamı (75mm x 25mm x 1mm) aynı boyutta kesilmiş paslanmaz çelik dikdörtgenler kullanın. 1,5 cm delik dikdörtgenin merkezinde kesilir. </li><li> Sylgard metal dikdörtgen yapıştırmayın 22 mm 2 lamel. Iyice lamel mühür yeterli Sylgard kullanın. Inverted mikroskop görüntü, embriyolar bu lamel üzerine monte edilebilir ve alttan görüntülenmiş. </li><li> Sylgard gecede ayarlanmış olsun. Bu slaytları yeniden kullanılabilir ve kullanımlar arasında% 70&#39;lik alkol ile temizlenmelidir. </li></ol> 2. DNA yapılarının hazırlanması Transgen bir doku belirli bir şekilde ifade etmek için, faiz gen hücre özel bir organizatörü arkasında klonlanmış. Biz zebrafish neurogenin1 gen (3.1ngn1) bir cis-düzenleyici element 2 ya da duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinden ifade sürücü sox10 gen (-4.9sox10) 3, sırasıyla kullanın. Hücre ve membran dinamikleri görselleştirmek için, sitoplazmik ifade veya membran lokalize fluorophores. F-aktin dağıtım için, kodlayan DNA mCherry (UtrCH-mCherry) erimiş utrophin calponin homoloji etki alanı ifade eder. UtrCH mCherry biyosensör prob aktin dinamikleri 1 ile müdahale olmadan F-aktin görselleştirme sağlar. Biz rekombinasyon tabanlı klonlama stratejisi 4 ve zebrafish Tol2kit 5 sağlanan vektörler Invitrogen Gateway kullanarak bu DNA yapıları oluşturur. <ol><li> Zebrafish Tol2kit 5 Multisite-Gateway Teknolojisi ve vektörler kullanarak ifade vektör (ler) oluşturun. Plazmidler pT2KXIGDin gelen Tol2 omurgası içerir. </li><li> QIAfilter Plazmid Midi Hazırlık kiti (QIAGEN A.Ş.) ve steril su Zehir ile plazmid DNA arındırın. DNA enjeksiyon için lineerleştirilmiş olması gerekmez. </li></ol> 3. DNA yapıları Enjeksiyon <ol><li> Su,% 0.2 fenol kırmızısı (enjeksiyon sırasında görünüm için) nihai konsantrasyonu 10-50 mg / ml DNA DNA sulandırınız. </li><li> Iğne doldurun ve kalibre: yaklaşık 1 ul DNA çözümü ile çekilmiş bir kılcal iğne Geri dolgu ve iğne tutucu (bir Picospritzer) enjeksiyon aparat takın. , Ince bir forseps kullanarak, iğne ucu açıklığı yaklaşık 10 mm çapında olduğu gibi kapalı ucunu kırmak. Oküler mikrometre ile mineral yağ damlacık çapı ölçülür. Nl hacmi yaklaşık 1 Bir damla almak için baskı süresi ayarını ayarlayın. </li><li> E3 embriyo orta (5mM NaCl, 0.17mM KCl, CaCl 2 0.33mM, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7.0) 1-hücreli aşamada embriyoların toplayın. </li><li> Enjeksiyon slayt ve konumu, üst ve alt slaytlar arasında oluşan dik açı köşesinde embriyoların yaklaşık 30-60 embriyoların transferi. Embriyoların, yüzey gerilimi tarafından slayt düzenlenen E3 böylece en çıkarın. </li><li> Bükülmüş bir diseksiyon pin hücre enjeksiyonu slayt duvara böylece embriyolar döndürmek için kullanın. </li><li> Yumurta sarısı ve embriyo tek bir hücreye, embriyonun koryon üzerinden iğne kılavuzu mikromanipülatör kullanın. 0.5-1 nl DNA çözümü hücre içine enjekte edilir. </li><li> 28.5 E3 ve inkübe Petri kapları içine embriyo transferine ° C Gerekirse, geliştirme, düşük sıcaklıkta embriyolar inkübe edilmesiyle önlenebilir. </li></ol> 4. Görüntüleme için Montaj embriyolar <ol><li> Embriyolar görüntüleme (amaçlar için yaklaşık 14-17 saat sonrası döllenme) için istenilen yaş ulaşmadan önce yaklaşık bir saat ince forseps ile embriyoların chorions çıkarın. </li><li> Floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak etiketli hücreler embriyo seçin. Biz uzun çalışma mesafesi ve yüksek büyütme kombinasyonu nedeniyle Nikon AZ100 kapsamı 4X objektif (40X büyütme) kullanın. </li><li> Bir embriyo yaklaşık 50 ul E3% 0.2 Tricaine anestezi (10X konsantrasyonda) içeren bir mikrofuge&#39;de tüp içine yerleştirin. </li><li> Tricaine seyreltilmesi% 0.02 nihai konsantrasyonu 10 mM HEPES (42 ° C sıcaklıkta tutulan), 500 ul E3% 1 düşük erime noktası agaroz ekleyin. </li><li> Hemen bir agaroz açılan embriyo transferigeniş bir delik cam pipet kullanarak görüntüleme slayt lamel. </li><li> Agaroz sertleşir önce etiketli hücreleri ile bölgenin alt lamel (nöral krest hücreleri ve spinal duyusal nöronlar için aşağı dorsolateral sırt aşağı) karşı aşağı bakacak şekilde, embriyonun konumu. </li><li> Görüntüleme odasının birleştirin: Coat bir tarafı plastik, metal görüntüleme slayt silikon vakum yağ ve yapıştırmayın ile bir halka (2 cm dış çapı 3 mm, yüksek). Gres yağıyla halka diğer tarafında ceket. </li><li> E3 içeren 10 mM HEPES ve% 0.02 Tricaine odasının doldurun. Halka iyi yağlanmış yüzey 22 mm 2 lamel iliştirilmesi odasının üst Seal. </li></ol> 5. Olympus FV1000 konfokal IX81 mikroskobu ile hücre davranışlarının 4D görüntüleme Görüntü elde detayları mikroskop sistemi özelliklerine bağlıdır. Burada Olympus FV1000 konfokal mikroskop için geçen zaman satın alma süreci tanımlamak. Zeiss LSM 510 konfokal sistemi 6 time-lapse edinimi için önceki vallahi protokol bakın. <ol><li> Mikroskop sahnede slayt sahibinin görüntüleme odasına yerleştirin ve iletilen ışık altında 10X veya 20X objektif kullanılarak embriyo odaklanmak. </li><li> 60X objektif (1.2 veya daha yüksek NA) geçin ve Epifloresans ile etiketli hücre odaklanmak. Biz ya immersiyon yağı (UPLSAPO 60xO NA 1.35) ya da su altında kalacak (UPLSAPO 60xW NA 1.20) lens kullanabilirsiniz. </li><li> FV yazılımı (Sür 1.7c), lazer tarama XY tekrar başlamak için tıklayın. </li><li> Satın alma ayarları ve görüntü elde etme denetimleri (lazer çıkış, tarama hızı, HV, kazanç ve ofset seviyeleri) en az (% 25 veya daha düşük), doku hasarı önlemek ve photobleaching azaltmak için lazer güç tutarak sinyal optimize etmek için ayarlayın. </li><li> Z-serisi elde etmek için, adım büyüklüğü ile birlikte, z yığının alt ve üst sınırları belirler. Derinlik simgesi XY Sweep simgesini XY ve Z vurgulanan o kadar meşgul olduğundan emin olun. XYZ Sweep simgesini tıklayarak satın alma başlayın. </li><li> Hızlandırılmış bir zaman serisi elde etmek için, Toplama Ayarlar penceresinde TimeScan başlığı altında bir zaman aralığı ve zaman noktalarının sayısını ayarlamak. XY Sweep simgesini XY (Z) ve T vurgulanan böylece Image Acquisition Kontrol Pencerede Zaman Simgesi tıklayın. XY (Z) T Sweep simgesini tıklayarak satın alma başlayın. </li><li> Alternatif olarak, TimeController bir zaman atlamalı kurmak için kullanılabilir. Büyük veri kümeleri oluştururken bellek ayırma aşmadığı Bu programlama, yararlı olur. Aygıt altında, TimeController pencere açın. Yeni bir görüntüleme Görev oluşturun. Görüntü parametre penceresi açılacaktır. Satın alma ayarlarını güncellemek için FV Durum düğmesini tıklatın. Emin olun Kaydet ve Sil sonlandırın başlığı altında kontrol edilir. Çıktı dosyası adı ayarlayın ve ayarları kaydetmek ve pencereyi kapatmak için Tamam&#39;ı tıklatın. Loop fonksiyonu, zaman noktalarında istenen zaman aralığı ve sayı ayarlamak için kullanın. Hazır tıklayın ve satın alma işlemini başlatmak için Başlat. Duraklat ve Z-shift fonksiyonları ise görüntüleme yeniden odaklanabilmek için kullanılabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Rakamlar ve film örnekleri, membran hedefli fluorophores veya aktin biyosensör probu ile etiketlenmiş duyusal nöronlar ve nöral krest hücrelerinden tasvir. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 bir Tg (ngn1: GFP-caax) Konfokal görüntüleri (z-projeksiyonları): mCherry-caax DNA 25 pg ngn1 ile enjekte edilen transgenik embriyo. MCherry CAAX etiketler yeşil etiketli tüm Rohon Sakal duyusal nöronlar ile arka planda bir nöron kırmızı (A) (B) yeşil ve kırmızı kanalları C) Birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Konfokal z projeksiyonları ~ 20 pg ngn1 ile enjekte edilen embriyolar nöronların:. MCherry-UtrCH DNA A) 16,5 hpf embriyo Rohon Sakal duyusal nöron. F-aktin sinyal büyüme konisi (ok başları) ve yeni kurulan aksonlar boyunca çıkıntılar güçlü B) Nöron 20 hpf embriyonun büyüme konileri dallı periferik akson (ok başları) ve daha olgun merkezi zayıf sinyal güçlü F-aktin sinyali gösteren aksonlar (oklar). Ölçek çubuğu = 50 mm.

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

DNA enjekte optimum konsantrasyon organizatörü büyüklüğü ve gücü oluşturmak ve ampirik olarak tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Transgen ifade enjekte embriyo çok küçük bir oranı çok az neden olurken çok fazla DNA enjeksiyonu, geniş hücre ölümü ile sağlıksız embriyolar yol açabilir. DNA ekspresyon seviyesi hücreden hücreye değişir fluorofor sinyal gücü ile ilişkilidir. Epifloresans altında embriyolar sıralama iken, son derece yüksek seviyede ifade olanlar dahil değild...

<table><tbody><tr><td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

Zebra balığı, in vivo geliştirme sırasında görüntüleme hücre davranışları için ideal bir model . Zebra balığı embriyolar dışarıdan döllenmiş ve gelişimin her aşamasında böylece kolayca ulaşılabilir. Ayrıca, doğal ortamda sağlam embriyonun hücre ve moleküler dinamiği yüksek çözünürlüklü görüntüleme, optik netlik sağlar. Biz nöral krest hücrelerinin göç ve nöron akson akıbet ve rehberlik sırasında hücre davranışlarını analiz etmek için canlı bir görüntüleme yaklaşımı kullanıyor. Canlı görüntüleme, hücre hareketi süreçleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için yararlıdır. Gibi çıkıntılı aktivite ve moleküler dinamik olarak hücre hareketi detayları, görselleştirmek için, tek tek hücrelerin etiketlemek için avantajlıdır. Zebra balığı, plazmid DNA enjeksiyonu, geçici bir mozaik ifade desenini verim ve diğer hücre etiketleme yöntemleri üzerinde farklı avantajlar sunuyor. Örneğin, transgenik çizgiler genellikle tüm hücre popülasyonlarının etiket ve böylece tek bir hücrenin ince çıkıntılar (veya moleküler dağılımında değişiklikler) görselleştirme gizleyebilir. Buna ek olarak, tek hücreli aşamada DNA enjeksiyonu, daha az invazif ve daha sonraki aşamada boya enjeksiyonu çok daha hassas. Burada bireysel gelişmekte olan nöronların veya nöral krest hücreleri ve görüntüleme in vivo olarak davranışlarını etiketleme için bir yöntem açıklanmaktadır . Biz mozaik transgen ifadesi sonuçları 1-hücreli dönem embriyoların, plazmid DNA enjekte edilir. Vektörlerin hücre özel rehberleri içeren duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinin bir alt kümesi olan ilgi bir gen sürücü ifadesi. Biz membran hedef GFP ile veya canlı hücreleri 1 F-aktin görselleştirme sağlayan bir biyosensör probu ile işaretli hücrelerin örnekler sunuyor. Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Video: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Nörobilim

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Optik Tektum Gelişiminde Mikroglia Davranışının Aydınlatılması

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Beyin Gelişimi Sırasında Mikroglia Göçünü Keşfetmek için Zebra Balığı Kullanma

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler