Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu protokol, floresan kılavuzlu, tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometresi için mikroMS kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve birincil sıçan nöronal hücrelerinin gelişmiş moleküler profilini çıkarmayı sağlar.
Tek hücreli ölçümler, beynin zengin uzay-kimyasal heterojenliğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Matris destekli lazer/desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS), tek tek hücrelerdeki endojen moleküllerin etiketsiz, yüksek verimli karakterizasyonunu yapabilir. Lazer kaynaklı post-iyonizasyon (MALDI-2) ile MALDI kütle spektrometrelerinin geliştirilmesindeki son gelişmeler, çeşitli lipitler ve diğer küçük moleküller için büyük ölçüde geliştirilmiş algılama hassasiyeti sağlar. Bununla birlikte, hücresel çözünürlükte MALDI-2 ile büyük örneklerin MS görüntülemesi çoğu uygulama için engelleyici bir şekilde yavaştır. Bu protokolde, birincil hücreler izole edilir ve iletken slaytlar üzerine dağıtılır. Bağıl hücre konumları, tam lam floresan mikroskobu ile belirlenir, ardından mikroskopi koordinatlarının MALDI-2 kütle spektrometresinin aşama koordinatlarına doğru bir şekilde birlikte kaydedilmesi sağlanır. Yalnızca hücre konumlarının hedefli MS analizi, tüm numunenin MS görüntülemesine kıyasla yüksek analit kapsamı ve azaltılmış veri boyutu ile yüksek verimli, tek hücreli ölçümler sağlar. Tek hücre hazırlama, tam slayt floresan görüntüleme, matris uygulaması ve MALDI-2 kütle spektrometresi için gerekli kritik adımları açıklıyoruz.
Lipitler ve metabolitler, hücresel fonksiyon için temeldir ve zarların, enerji kaynaklarının ve sinyal moleküllerinin temel bileşenleri olarak hizmet eder 1,2. Bununla birlikte, bileşimleri ve bollukları, hücre tiplerindeki ve gelişimsel ve fonksiyonel durumlardaki farklılıkları yansıtarak, tek tek hücreler arasında önemli ölçüde değişebilir 3,4,5. Bu farklılıkları analiz etmek, biyolojik değişkenliği anlamak ve farklı hücre alt popülasyonlarını tanımlamak için çok önemlidir. RNA dizilimi gibi tek hücreli ölçüm teknikleri, hücreye özgü yararlı transkript profilleri sağlar6. Bununla birlikte, bu transkript düzeyindeki ölçümler, lipitlerin ve metabolitlerin gerçek hücresel miktarlarını doğrudan yansıtmaz, çünkü gen ekspresyonu her zaman bu analitlerin gerçek bolluğu ile ilişkili değildir. Bu nedenle, lipitlerin ve metabolitlerin doğrudan ölçümleri için özel yöntemler, tek hücrelerin ve popülasyonlarının kimyasal bileşiminin kapsamlı analizi için gereklidir.
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi görüntüleme (MSI), endojen biyomoleküllerin yerindeetiketsiz uzamsal haritalaması için tercih edilen bir araçtır 7,8. Tipik olarak, MALDI ile, bir iyon ve nötr molekül tüyü oluşturan, organik bir matris ile birlikte kristalize edilmiş ince bir numune katmanından malzemeyi ablate etmek için bir UV lazeri kullanılır. Oluşan iyonlar daha sonra bir MS analizörü ile ayrılır ve bir kütle spektrometresi içinde tespit edilir. Modern kütle spektrometresi aşamalarının doğru konumlandırılması göz önüne alındığında, lazer, MSI tarafından moleküler görüntüler oluşturmak için belirli numune bölgelerini hedefleyecek şekilde konumlandırılabilir veya bölgeler arasında rasterleştirilebilir. Odaklanmış bir lazer ışını ve doğru aşama hareketi ile elde edilen hücresel veya hücre altı uzamsal çözünürlükte (< 10 μm) MSI, tek tek hücreler hakkında kimyasal bilgi elde etmek için kullanılabilir 9,10. Bununla birlikte, bu ölçekteki MSI ölçümleri, hücreler arasındaki boş bölgeleri görüntülemek için harcanan süre nedeniyle, özellikle düşük hedeflenen hücre yoğunluğuna sahip numuneler söz konusu olduğunda verimsizdir. Ayrıca, örneklenen küçük hacim nedeniyle birçok analitin saptanabilirliği sınırlıdır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, yüksek verimli tek hücreli analiz için görüntü kılavuzlu bir MALDI MS yaklaşımı geliştirdik11,12. Bu yaklaşımda, dağılmış hücrelerin konumları, tam slayt floresan görüntülerinden programlı olarak belirlenir ve kütle spektrometresi aşamasını, belirli parametrelere (örneğin, boyut ve şekil) sahip tek tek hücrelerin bulunduğu konumlara yönlendirmek için kullanılır ve daha sonra MALDI lazeri ile ışınlama yoluyla analiz edilir. Bu hedefli yaklaşımı kullanan önceki çalışmalar, heterojen hücre popülasyonlarında lipitleri, peptitleri ve diğer biyomolekülleri karakterize etmek için kullanılmıştır 5,13.
Tek hücrelerin kütle sınırlı doğası göz önüne alındığında, bu tür örneklerde tespit edilen analit sayısı genellikle doğrudan dokudan gözlemlenenden daha azdır. Bu nedenle, tek hücreli MS analizinde analit kapsamını artırmak için analit algılama hassasiyetinin arttırılması kritik öneme sahiptir. Bu algılama zorluğunun üstesinden gelmeye yardımcı olan yakın zamanda geliştirilen bir yaklaşım, geniş bir analit9,14,15,16 yelpazesi için hassasiyeti artırdığı gösterilen lazer post-iyonizasyonlu MALDI'dir (MALDI-2). Sonuç olarak, MALDI-2 daha kapsamlı tek hücreli veri kümeleri üretir ve izole hücreler gibi kütle sınırlı numunelerde daha derin moleküler kapsama alanı sağlar.
Bu yöntemin amacı, binlerce ayrı hücreden lipit ölçümleri elde etmektir. Bu amaçla, yüksek verimli tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometrisini mümkün kılan ve genellikle hassas aşama kontrolü17 ile herhangi bir prob tabanlı kütle spektrometrisi yaklaşımına genişletilebilen bir iş akışını tanımlıyoruz. Bu iş akışında, ilgilenilen beyin bölge(ler)inden alınan doku parçalara ayrılır ve bir papain ayrıştırma prosedüründen sonra dokudan tek tek hücreler elde edilir. Hücreler daha sonra bir nükleer leke ile etiketlenir ve yapışmalarına izin verilen referans işaretleyicilerle kazınmış iletken cam slaytlar üzerine dağıtılır. Daha sonra, floresan mikroskobu kullanılarak tüm slayt görüntüleri alınır. Matris, tek hücreli MS analizi için tekrarlanabilir homojen bir kristal tabaka ve yüksek sinyal-gürültü üreterek süblimasyon yoluyla biriktirilir. Açık kaynaklı yazılım microMS11 kullanılarak, mikroskopi görüntüsünden hücre konumlarının göreceli koordinatları, hücrelerin biriktirildiği cam slaytlar üzerine kazınmış referans işaretleyiciler kullanılarak bir nokta seti kaydı ile kütle spektrometresi aşama koordinatları ile eşlenir ve hizalanır. Son olarak, bu bilgiler kullanılarak, her bir hücreden kesin, hedeflenmiş MS spektrumları elde edilir ve binlerce hücrenin tek bir çalışmada (<1 saat) profilinin çıkarılmasına olanak tanır12,13.
Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (23228) tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolüne uygun olarak, hayvanların etik muamelesi ve bakımı için hem ulusal hem de ARRIVE standartlarına sıkı sıkıya bağlı kalınarak yapılmıştır.
1. Malzemelerin ve çözeltilerin hazırlanması
2. Birincil nöral hücrelerin hazırlanması
NOT: Sıçan hipokampal dokusu diseke edilir, papain ile tek tek hücrelere ayrıştırılır ve düşük yoğunlukta iletken cam slaytlar üzerine biriktirilir. Hücrelerin bu şekilde izole edilmesi, endojen lipidlerin yüksek verimli tek hücreli kütle spektrometresini mümkün kılar.
3. Mikroskopi
NOT: Biriken hücrelerin konumunu belirlemek için, her slayt parlak alan/floresan mikroskobu ile görüntülenir. Floresan kanalı, Hoechst lekeli hücrelerin doğru bir şekilde konumlandırılmasına izin verirken, parlak alan görüntüleme morfolojik bilgi sağlar. Döşenmiş görüntü elde edebilen herhangi bir mikroskop bu işlem için uygundur.
4. Matris uygulaması
NOT: Tutarlı ve uygun MALDI matris uygulaması, kaliteli tek hücreli veriler elde etmek için kritik öneme sahiptir. Burada ticari bir aparat kullanılarak süblimasyon kullanılırken, matris uygulaması robotik bir püskürtücü12, airbrush21 veya ev yapımı süblimasyon aparatı22 kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Tek hücreli preparatların, tipik olarak kütle spektrometresi görüntülemesi için kullanılan ince doku kesitlerinden daha az matris gerektirdiğini bulduk. Toplu etkileri azaltmak için, matrisin bir seans sırasında incelenen tüm slaytlara uygulanması ve mümkün olduğunda farklı gruplardan (örneğin, beyin bölgesi veya tedaviye karşı kontrol) hücrelerin aynı slayta bırakılması önerilir. Matris seçimi, hem geleneksel MALDI hem de MALDI-2 tek hücreli iş akışları için çok önemlidir. Tek hücreli MALDI için DHB23, 9-AA24 ve CHCA25 başarıyla kullanılmıştır. MALDI-2'de, biz ve diğerleri DHAP9 ile önemli sinyal artışı gözlemlerken, NEDC16 ve CHCA26 gibi matrisler de etkili bir şekilde uygulanmıştır.
5. Tek Hücreli MALDI MS
NOT: Tek hücreli MS verileri, hücreleri tespit etmek ve kütle spektrometresini yönlendirmek için açık kaynaklı microMS paketi kullanılarak bir MALDI-2 timsTOF cihazında (timsTOF flex) elde edilir. Bu, hedeflenen hücrelerin optik görüntü piksel konumlarının kütle spektrometresi aşamasının fiziksel koordinatlarına çevrilmesini gerektirir.
6. Veri işleme
NOT: Mevcut ticari yazılım paketleri, yüksek verimli tek hücreli kütle spektrometresi verilerini analiz etmek için pek uygun değildir. Bireysel spektrumlar görselleştirilebilirken, anlamlı biyolojik içgörüler elde etmek özel araçlar gerektirir. Bunu ele almak için, tek hücreli MALDI-2 MS veri analizini kolaylaştıran ücretsiz olarak kullanılabilen bir yazılım sunuyoruz. Güncellenen iş akışımız, tek hücreli verilerin açık kaynaklı imzML format27'ye doğrudan dönüştürülmesini kolaylaştırarak SCiLS, MVS ve diğer satıcı yazılımlarıyla uyumluluk sağlar. Daha gelişmiş veri analizi için, tam komut dosyası ayrıca Matplotlib (sürüm 3.7.3) tarafından etkinleştirilen lipid açıklama, kümeleme ve diğer görselleştirme araçları için işlevsellik içerir. Ham verilerin ayrıştırılması ve okunması, TIMSCONVERT iş akışında28 yer alan bir dizi işlev olan pyTDFSDK kitaplığı tarafından kolaylaştırılır.
Floresan kılavuzluğunda tek hücreli MALDI-2 MS için iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. İlk olarak, hedeflenen beyin bölgelerinden (Şekil 1A) diseke edilen doku, tek hücrelere ayrılır ve iletken ITO kaplı mikroskopi slaytları üzerine bırakılır (Şekil 1B). Hücrelerin konumları tam slayt floresan görüntüleme (Şekil 1C), a...
Yüksek verimli, görüntü kılavuzlu tek hücreli MALDI MS, tek hücre ölçeğinde kimyasal heterojenliği anlamak için değerli bir araçtır. Lazer kaynaklı post-iyonizasyon (MALDI-2) ilavesi, izole edilmiş memeli hücreleri gibi kütle ve hacim sınırlı numuneler için kritik olan daha derin analit kapsamı sağlar.
Yayınlanmış tek hücreli lipid ve metabolit MS iş akışlarının ezici çoğunluğu kültürlenmiş hücreleri kullanırken, yakla...
Yazarların ifşa etmek için rekabet eden çıkarları yoktur.
SWC, Peixin He ve Xiaoming Chen PhD4 Bursu ve Illinois Üniversitesi Block Grant Bursu tarafından sağlanan desteği kabul eder. Bu çalışma aynı zamanda Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü tarafından da ödül No. P30DA018310, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü Ödül No. R01AG078797 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Direktörlük Ofisi tarafından S10OD032242 Numaralı Ödül altında.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2',5'-dihydroxyacetophenone | Sigma Aldrich | D107603 | DHAP, 97% purity |
Ammonium acetate | Sigma Aldrich | 238074 | ACS reagent, ≥97% |
Axio M2 Imager | Zeiss | N/A | N/A |
Biopsy punch, 2 mm | Fisher Scientific | 12-460-399 | integra miltex standard biopsy punch, 2mm |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | anhydrous, powder ≥97% |
Eppendorf Centrifuge | Sigma Aldrich | EP5405000441 | centrifuge 5425 with rotor FA-24x2 |
Gentamicin | Sigma Aldrich | G1272 | liquid, BioReagent |
Glass etching pen | Sigma Aldrich | Z225568 | carbide time, pkg of 1 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G7893 | ACS reagent, ≥99.5% |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
Hoechst 33258 Solution | Sigma Aldrich | 94403 | 1 mg/mL in H2O, ≥98.0% (HPLC) |
In line HEPA Filter | Sigma Aldrich | WHA67225001 | VACU-GUARD 60 mm disc, 0.45 PFTE housing |
ITO-Coated Microscopy Slides | Delta Technologies | CG-90IN-S115 | 70-100Ω resistance |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | anhydrous, ≥98% |
Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 208094 | anhydrous, ≥97% |
Microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich | HS4323K | tube capacity 1.5 mL, pack of 500 |
Papain dissociation system | Worthington Biochemical | LK003150 | one box, 5 single use vials |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458 | liquid, BioReagent |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | 529552 | Molecular biology grade |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | Reagent Plus |
Sodium biocarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | ACS reagent, ≥99.7% |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99% |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 221465 | ACS reagent, ≥97%, pellets |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | ACS reagent, ≥99% |
Sublimate | HTX | N/A | N/A |
timsTOF FleX MALDI-2 | Bruker | N/A | microGRID enabled |
Vacuum tubing | Thermo Scientific | 8701-0080 | Nalgene Non-phthalate PVC Tubing |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır