Nörodejeneratif Hastalıkların Tedavisinde Yeniden Programlanmış Kök Hücre Kaynaklı Öncü Hücrelerde Kemogenetik Düzenleme

Burada, bu hücreleri dopaminerjik öncü hücrelere farklılaştırarak, bunları Parkinson hastalığının fare modellerine naklederek ve nakledilen hücrelerin başarılı entegrasyonunu ve fonksiyonel etkinliğini doğrulamak için davranışsal ve elektrofizyolojik sonuçları değerlendirerek hassas nöronal modülasyon elde etmek için kimyasal olarak yeniden programlanmış kök hücrelerin mühendisliği için bir protokol açıklıyoruz.

Tasarımcı ilaçlar (DREADD) tarafından özel olarak aktive edilen tasarımcı reseptörlerinin kök hücre bazlı tedavilerle entegrasyonu, hassas nöronal modülasyon için gelişmiş bir strateji sunar. Burada, Parkinson hastalığının (PD) bir fare modelinde nakledilen dopaminerjik öncüllerin fonksiyonel entegrasyonunu ve modülasyonunu değerlendirmek için uyarıcı (hM3Dq) veya inhibitör (hM4Di) DREADD reseptörlerini eksprese eden CRISPR tarafından tasarlanmış insan yeniden programlanmış kök hücreleri kullandık. Anahtar adımlar, füzyon olmayan DREADD eksprese eden kök hücre dizilerinin üretilmesini, bunların orta beyin dopaminerjik öncülerine ayrılmasını ve bu hücrelerin 6-hidroksidopamin (6-OHDA) lezyonlu farelerin striatumuna nakledilmesini içeriyordu. Nakledilen hücrelerin etkilerini analiz etmek için davranışsal değerlendirmeler ve elektrofizyolojik kayıtlar yaptık. Silindir testi gibi davranışsal testler, klozapin-N-oksit (CNO) uygulamasını takiben motor fonksiyonun önemli ölçüde modülasyonunu göstermiştir. Spesifik olarak, hM4Di'nin aktivasyonu kontralateral ön ayak hareketini azaltırken, hM3Dq'nun aktivasyonu gelişmiş motor davranış ile ilişkilendirildi. Elektrofizyolojik kayıtlar belirgin sinaptik yanıtlar ortaya çıkardı. hM4Di aktivasyonu, etkileşimler arası aralıkları arttırdı ve spontan uyarıcı postsinaptik akımların (sEPSC'ler) tepe genliklerini azaltırken, hM3Dq aktivasyonu, gelişmiş uyarıcı sinyallemeyi yansıtarak etkileşimler arası aralıkları azalttı ve tepe genliklerini artırdı. Özetle, davranışsal ve elektrofizyolojik değerlendirmelerin entegrasyonu, tasarlanmış kimyasal olarak yeniden programlanmış kök hücrelerin konakçı nöral devrelere kesin işlevsel olarak dahil edilmesini doğrular.

Tasarımcı ilaçlar (DREADD) tarafından özel olarak aktive edilen tasarımcı reseptörleri, aksi takdirde inert sentetik ligandlar¹ tarafından seçici olarak aktive edilebilen tasarlanmış G-proteinine bağlı reseptörlerdir. Kemogenetik yaklaşım, araştırmacıların nöral devre bağlantısını yüksek hassasiyetle araştırmalarını sağlayarak ve belirli beyin bölgelerinin veya hücre tiplerinin seçici aktivasyonu veya inhibisyonu yoluyla hem in vivo hem de in vitro hücresel işlevler hakkındaki anlayışımızı geliştirerek sinirbilimde önemli bir araç haline gelmiştir ^2,3.

Kök hücre bazlı tedavi, nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için umut verici bir strateji sunar. Greft hücrelerinin etkinliği, konak dokulara uygun entegrasyon, sağkalım ve fonksiyonel katkıya dayanır. Kontrolsüz hücresel aktivite, tümör^{oluşumu 4} dahil olmak üzere olumsuz sonuçlara yol açabilir; transplantasyon sonrası bu hücrelerin hassas kontrolünü gerektirir. İnsan tarafından yeniden programlanmış kök hücrelerde ve türetilmiş nöronlarda DREADD teknolojisinden yararlanmak, tasarımcı ilaç CNO ^2,5'in uygulanması yoluyla nöronal aktiviteyi hassas bir şekilde kontrol etmek için bir araç sağlar. Dopaminerjik nöronların kaybı ile karakterize olan Parkinson hastalığı (PD) bağlamında, kök hücre kaynaklı dopaminerjik nöronların aktivitesini manipüle etmek, kemirgen modellerinde^sinaptik girdilerini ve projeksiyon modellerini araştırmak için çok önemlidir 6,7,8,9,10. Uyarıcı hM3Dq ve inhibitör hM4Di reseptörlerinin bu modellere dahil edilmesi, nöronal aktivitenin hassas modülasyonunu sağlar ^11,12.

Hayvan davranışsal değerlendirmelerinin ve elektrofizyolojik kayıtların kombinasyonu, kemogenetik modülasyonun nakledilen hücreler üzerindeki etkilerinin in vivo¹³ kapsamlı bir değerlendirmesine olanak tanır. Apomorfin kaynaklı rotasyon, silindir testi ve rotarod testi dahil olmak üzere davranışsal değerlendirmeler, motor koordinasyonu değerlendirir ve PD^14'ün deneysel modelleriyle ilişkili motor fonksiyondaki değişiklikler hakkında bilgi sağlar. Yama-kelepçe kayıtları gibi elektrofizyolojik teknikler, sinaptik tepkilerin ve aksiyon potansiyellerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayarak, nakledilen hücrelerin mevcut sinir ağlarına nasıl entegre olduğuna dair kapsamlı bir görünüm sağlar¹⁵. Davranışsal değerlendirmeleri elektrofizyolojik değerlendirmelerle birleştirerek, kemogenetik modülasyonun bu hücrelerin konak nöral devreleri içindeki entegrasyonunu ve işlevselliğini nasıl etkilediğini araştırabiliriz¹⁶. Ön bulgular, CNO uygulamasının nakledilen hücrelerde nöronal aktiviteyi etkili bir şekilde modüle ettiğini ve bunun da hayvan modellerinde daha iyi fonksiyonel sonuçlara yol açtığını göstermektedir.

Bu protokolde, insan tarafından yeniden programlanan kök hücreler, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) teknolojisi kullanılarak hM3Dq veya hM4Di reseptörlerini eksprese etmek üzere tasarlandı. Modifiye edilmiş yeniden programlanmış kök hücreleri orta beyin dopaminerjik öncü hücrelerine farklılaştırdıktan sonra, bu hücreler, davranışsal değerlendirmeler ve elektrofizyolojik kayıtlar kullanılarak konakçı sinir devreleri içindeki entegrasyonlarını ve fonksiyonel düzenlemelerini değerlendirmek için PD'nin fare modellerine nakledildi.

Tüm hayvan deneyleri, Pekin Laboratuvar Hayvanları Bilimi Derneği ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. İnsan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), önceki bir çalışmada açıklandığı gibi yazılı bilgilendirilmiş onam ile sağlıklı bir donörden elde edildi¹⁷.

1. Füzyon olmayan DREADD kök bazlı hücre hatlarının inşası

1. DREADD donör plazmidini oluşturun.
   NOT: Sindirim bölgeleri vektör dizisine göre tasarlanmalıdır. Parçalar, montaj verimliliğini artırmak için parça kollarına uygun 20-30 bp örtüşme ile sentezlenmeli ve büyütülmelidir.
   1. T2A-ZsGreen parçasını (Fragman I) tasarlayın ve sentezleyin.
   2. PCR (Fragman II) kullanarak orijinal plazmitten hM3Dq/hM4Di-T2A fragmanını yükseltin. PCR reaksiyonunu (50 μL toplam hacim) 1x PCR tamponu, her dNTP karışımından 200 μM, 0.5 μM ileri ve geri primerler, 10-50 ng plazmit DNA şablonu ve 1.25 U yüksek kaliteli DNA polimeraz içerecek şekilde ayarlayın. Aşağıdaki koşullar altında termodöngü gerçekleştirin: şablonu tamamen denatüre etmek için 98 ° C'de 2.75 dakika boyunca ilk denatürasyon; 15 sn için 98 °C (denatürasyon), 30 sn için 60 °C (astar tavlama) ve 60 sn için 72 °C'den (uzatma) oluşan 32 amplifikasyon döngüsü; son uzatma 72 ° C'de 7 dakika.
   3. Doğrusallaştırılmış vektörü elde etmek için vektör plazmidini uygun enzimle sindirin. Tüm parçaları agaroz jel elektroforezi ile saflaştırın ve bir spektrofotometre kullanarak miktarını belirleyin.
      NOT: Burada, orijinal plazmit MluI ve SalI ile sindirildi.
2. 50-100 ng doğrusallaştırılmış vektör, Fragman I ve Fragman II'yi 1:3:3 molar oranında ve 2x Klonlama Karışımı ile nazikçe karıştırın. Gibson Assembly ile homolog rekombinasyonu kolaylaştırmak için karışımı 55 °C'de 1 saat inkübe edin.
3. AAVS1 bölgesini hedefleyen kılavuz RNA'yı pX458 vektörünün BbsI bölgesine yerleştirin.
   NOT: Sanger dizilemesini kullanarak oluşturulmuş tüm plazmitlerde dizi doğrulaması yapın.
4. 2-5 × 10⁶ hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu hedefleyerek yeniden programlanmış kök hücreleri ortamda tutun.
   NOT: Burada kullanılan yeniden programlanmış kök hücreler, önceki bir çalışmada açıklandığı gibi insan PBMC'lerinden indüklenmiştir¹⁷. Hücre durumu elektroporasyon verimliliğini önemli ölçüde etkilediği için hücre sağlığının izlenmesi çok önemlidir. Ortamların karşılaştırması için Malzeme Tablosuna bakın.
5. 2-5 × 10⁶ hücre, her donör plazmidinden 2 μg (hM4Di-T2A-ZsGreen veya hM3Dq-T2A-ZsGreen) ve 2 μg gRNA plazmitini 100 μL elektroporasyon tamponunda karıştırın ve elektroporasyon için bir küvete aktarın.
   NOT: Elektroporasyona devam etmeden önce karışımın iyice karıştığından ve kabarcık içermediğinden emin olun. Farklı cihazlar özel ayarlamalar gerektirebileceğinden, transfeksiyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için elektroporasyon parametrelerini hücre tipine göre optimize edin.
6. Nükleofektörü B16 programına ayarlayın ve hedef iNSC'lerin verimli bir şekilde iletilmesini kolaylaştırmak için elektroporasyonu başlatın.
7. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL 50 μg / mL poli-D-lizin (PDL) ekleyin ve oda sıcaklığında en az 2 saat inkübe edin. Tüm PDL'leri kuyucuklardan çıkarın ve her bir oyuğa 1.5 mL 5 μg / mL laminin ekleyin ve 37 ° C'de 2-4 saat inkübe edin. Kaplamalı plakayı hemen kullanın veya 2-8 °C'de 1 hafta saklayın.
8. Elektroporasyonlu hücreleri, PDL ve laminin ile kaplanmış altı oyuklu plakalara aktarın. Kuyucuk başına 2 mL kültür ortamı hacminde kuyu başına yaklaşık 500.000 hücre dağıtın.
9. 72 saatlik elektroporasyondan sonra, floresan pozitif hücreleri sıralamak için bir akış sitometresi kullanın.
   1. DPBS'de ayrışmış hücreleri yeniden askıya alın ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
   2. ZsGreen algılaması için sıralayıcıyı FITC kanalıyla yapılandırın. Temel floresansı tanımlamak için işlenmemiş iNSC'leri negatif kontroller olarak dahil edin.
   3. Cihazı 20 psi kılıf basıncında 100 μm nozul kullanarak kalibre edin. Tek hücre onayı ile dört yönlü saflık sıralama modu uygulayın.
10. PDL ve laminin ile önceden kaplanmış 96 oyuklu plakalarda tek ZsGreen ⁺ hücrelerini plakalayın ve ilk büyümeyi desteklemek için oyuk başına 200 μL kültür ortamı ekleyin. Kültür ortamında 7-14 gün koruyun
    NOT: Başarılı entegrasyonu gösteren büyüme ve floresan belirtileri için kuyuları günlük olarak izleyin ve pozitif kuyuyu etiketleyin.
11. Bir GFP filtre seti ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak floresan sergileyen tek klonları izole edin. 10x büyütmede ekran klonları. Monoklonal koloniler içeren kuyuları sürekli, tekdüze ZsGreen sinyali ile işaretleyin. Morfolojiyi ve floresan yoğunluğunu belgelemek için parlak alan ve floresan görüntüleri yakalayın.
    NOT: Görüntülemeden önce, arka plan floresansını azaltmak için yeni ortamı değiştirin. Düzensiz morfolojiye veya otofloresansa sahip kolonileri hariç tutun.
12. Kaplanmış 48 oyuklu plakalar üzerindeki pozitif hücreleri genişletin. Daha sonra biri kültür, diğeri genotipleme için olmak üzere iki kısma bölün.
13. Aday klonlardan genomik DNA'yı çıkarın. PCR reaksiyonlarını iki primer çifti ile hazırlayın: bir çift ilgilenilen genin yerleştirilmesini doğrulamak için, diğer primer homozigot ve heterozigot klonları ayırt etmek için. Aşağıdaki koşullar altında termosiklasyon gerçekleştirin: 95 ° C'de 5 dakika boyunca ilk denatürasyon; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 60 °C ve 45 sn için 72 °C'de 38 döngü; son uzatma 72 ° C'de 7 dakika. PCR ürünlerini %2'lik bir agaroz jeli üzerinde çözün.
    NOT: Astarlar için Malzeme Tablosuna bakınız. İlgilenilen genin tek bir 650 bp bandı (primer 1) tarafından yerleştirildiğini onaylayın. Heterozigot klonları tek bir 630 bp bandının varlığıyla ve homozigot klonları bu bandın yokluğuyla tanımlayın (primer 2).
14. Kaplanmış altı oyuklu plakalar üzerindeki pozitif hücreleri genişletin.
15. Hücreleri sindirin ve 250 × g'da 3 dakika santrifüjleyerek fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde yıkayın. Hücreleri, flakon başına 2.5 × 10⁶ hücre yoğunluğunda% 10 DMSO ile kriyoprezervasyon ortamında dondurun.

2. Nakledilen DREADD kök hücre türevi öncü hücreler PD model farelere

1. Ameliyattan 30 dakika önce immün yetmezliği olan farelere 5 mg / mL (10 mg / kg) konsantrasyonda intraperitoneal desipramin enjeksiyonu uygulayın. Fareleri% 2 izofluran ile uyuşturun.
2. 3 μL 6-hidroksidopamin (6-OHDA, 5 μg / μL) tek taraflı stereotaksik enjeksiyonlar yapın. Aşağıdaki koordinatları kullanarak sağ korpus striatumu hedefleyin: anteroposterior = 0.5 mm, lateral = 2.1 mm ve dikey = -3.2 mm.
   NOT: 6-OHDA,% 0.2 askorbik asit içeren tuzlu su içinde çözülmelidir. Lezyon şiddetindeki değişkenliği en aza indirmek için hassas hedefleme sağlayın.
   DİKKAT: 6-OHDA sitotoksiktir ve hücresel strese neden olan reaktif oksijen türleri üretir. Dikkatli tutun.
3. Ameliyattan 4 hafta sonra lezyonları doğrulamak için intraperitoneal apomorfin enjeksiyonu (1 mg / kg, salin içinde çözülmüş 0.5 mg / mL) uygulayın. Sonraki deneyler için 30 dakikalık bir gözlem süresi içinde 100'den fazla kontralateral rotasyon sergileyen lezyonlu fareleri seçin.
   NOT: Apomorfin, denerve striatumdaki süper duyarlı postsinaptik reseptörleri doğrudan aktive eden ve bilateral nigrostriatal devre aktivitesini dengesiz hale getiren bir dopamin reseptörü agonistidir. Apomorfinin neden olduğu rotasyon, 6-OHDA ile tek taraflı dopaminerjik lezyonların şiddetini değerlendirmeye yarar.
4. Kaplanmış altı oyuklu plakalarda tohum ve kültür hücreleri (oyuk başına 150.000 hücre). Faz 1 farklılaşma ortamında 10 gün inkübe edin, ortamı her 2 günde bir yenileyin. 11. Günde, Faz 2 farklılaşma ortamına geçin ve her gün ortamı değiştirerek 13. güne kadar inkübasyona devam edin.
   NOT: Farklılaşma ortamının karşılaştırması için Malzeme Tablosuna bakın.
5. Farklılaşmanın 10. ve 13. günlerinde hücreleri hasat edin, ardından 1: 7 oranında karıştırın. Karışımı 100.000 hücre / μL'lik bir konsantrasyonda transplantasyon tamponunda askıya alın.
   NOT: Transplantasyon tamponunun karşılaştırması için Malzeme Tablosuna bakınız.
6. Hazırlanan hücre süspansiyonunun toplam hacmi 4 μL'lik bir stereotaksik enjeksiyonu bir PD faresine uygulayın.
7. Hücre nakli sonrası silindir testini çeşitli zaman noktalarında gerçekleştirin. Düz, yansıtıcı olmayan bir yüzeye bir cam kab (çap: 20 cm, yükseklik: 30 cm) yerleştirin. Tam çapı yakalamak için silindirin üzerine bir üstten görüş kamerası yerleştirin.
   NOT: Dış görsel uyaranları ortadan kaldırmak için silindiri siyah perdelerle kapatın.
8. Her fareyi silindirin ortasına yerleştirin ve eşzamanlı video kaydını başlatın (3 dk/oturum). Seanstan sonra fareyi ev kafesine geri koyun.
   NOT: Fareleri ışık koşullarında 30 dakika boyunca test odasına alıştırın. Koku alma ipuçlarını ortadan kaldırmak için silindirleri denemeler arasında %70 etanol ile temizleyin.
9. Farelerin üst ekstremite hareket kabiliyetini 3 dakika boyunca değerlendirin. Bozulmuş ön ayak tarafından yapılan duvar temaslarının sayısını, her iki ön ayak tarafından yapılan toplam temas sayısına göre hesaplayın.
10. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla 1.2 mg / kg'lık bir dozda salin veya CNO uygulayın. CNO uygulamasını takiben PD fare modelindeki davranışsal modülasyonu değerlendirmek için silindir testini yapın
    NOT: Değerlendirmeye devam etmeden önce yaklaşık 40 dakikalık bir kurtarma süresi bekleyin.

3. Kemogenetik olarak modüle edilmiş hücrelerin in vivo elektrofizyolojik profillemesi

1. 250 mg / kg pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile fareleri uyuşturun. Beyni çıkarın ve hücresel bütünlüğü korumak için hemen buz gibi soğuk sükroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısına (s-ACSF) yerleştirin. Bir vibratom kullanarak beyni 300-400 μm kalınlığında bölümlere ayırın.
   NOT: Hücresel işlevi korumak için beyni düşük sıcaklıklarda tutmak için hızlı çalışın. Taze beyin kesiti hazırlığında kullanılan s-ACSF için Malzeme Tablosuna bakınız.
2. Numuneleri 34 °C'de %95_O2 ve %5 CO₂ ile dengelenmiş ACSF ile dolu bir odaya aktarın ve bu sıcaklığın deney boyunca korunmasını sağlayın.
   NOT: ACSF için Malzeme Tablosuna bakın.
3. Cam pipetleri, elektrot direnci 7 ila 10 MΩ arasında değişen buzlu hücre içi çözelti ile yükleyin.
   NOT: Hücre içi çözelti için Malzeme Tablosuna bakınız. Cam pipetler, bir mikropipet çektirmesi¹⁸ ile cam kılcal damarlardan yapılır. Deneylere başlamadan önce cam pipetlerde sızıntı olup olmadığını kontrol edin ve uçların hücre zarına nüfuz edecek kadar keskin olduğundan emin olun. Hücre içi çözeltideki sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek için pipetleri hızlı bir şekilde hazırlayın.
4. Dilimleri, 34 °C'de oksijenli ACSF ile süper kaynaşmış (2 mL/dak) batık bir kayıt odasına monte edin. Pipetleri kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında motorlu mikromanipülatörler kullanarak konumlandırın. Greft bölgelerindeki yamalı nöronlara hafif emme (1 GΩ'> direnç) uygulayarak tüm hücre konfigürasyonunu oluşturun. Bir yama kelepçesi amplifikatörü kullanarak hücreleri -70 mV'de sıkıştırın; 10 kHz örnekleme hızında (2 kHz'de filtrelenmiş) 8 dakika boyunca temel sEPSC'leri alın ve erişim direncini sürekli olarak izleyin (hedef: <20 MΩ; >25 MΩ veya dalgalanıyorsa >%10) atın).
   NOT: İstenmeyen hücre yer değiştirmesini veya yırtılmasını önlemek için emme uygularken uygun basınç kullanın ve iyi bir sızdırmazlık elde etmek için pipet konumunu dikkatlice ayarlayın. Sızdırmazlık kalitesi düşükse, pipeti atın ve tekrar deneyin.
5. Temel ölçümü tamamladıktan hemen sonra kayıt odasına 50 μM CNO ekleyin ve sEPSC frekansı veya genliğindeki değişiklikleri gözlemlerken 16 dakika daha veri kaydetmeye devam edin.
6. CNO'yu kayıt odasından etkili bir şekilde çıkarmak için CNO solüsyonunu yeni ACSF ile değiştirerek bir yıkama prosedürü gerçekleştirin. Sinaptik aktivitedeki herhangi bir iyileşmeyi değerlendirmek için deneyin geri kalanı için veri kaydetmeye devam edin.

Şekil 1 , Parkinson hastalığının (PD) bir fare modelinde türetilmiş dopaminerjik öncüllerin fonksiyonel entegrasyonunu ve modülasyonunu değerlendirmek için uyarıcı (hM3Dq) veya inhibitör (hM4Di) DREADD reseptörlerini eksprese eden tasarlanmış insan yeniden programlanmış kök hücreler için bu metodolojik yaklaşımın temel adımlarını göstermektedir. Şekil 2 , hM4Di-T2A-ZsGreen ve hM3Dq-T2A-ZsGreen'in f...

Bu protokol, uyarıcı hM3Dq ve inhibitör hM4Di reseptörlerini eksprese etmek için insan yeniden programlanmış kök hücreleri tasarlamak için CRISPR teknolojisini kullandı. Nöronal aktivitenin CNO ile modülasyonu, davranışsal değerlendirmeler ve elektrofizyolojik kayıtlar eşliğinde Parkinson hastalığının fare modellerine hücre nakli yoluyla değerlendirildi.

Kemogenetik olarak yeniden programlanmış kök hücrelerde stabil bir şekilde ek...

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7242068), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82171250), Pekin Belediye Sağlık Komisyonu Fonu (PXM2020_026283_000005) ve Pekin'e bağlı Tıbbi Araştırma Enstitülerinin Teknoloji Geliştirme Projesi (11000023T000002036310) tarafından desteklenmiştir.