Наше исследование направлено на понимание иммунных механизмов, лежащих в основе патогенеза легочного фиброза. Одной из самых больших проблем в этой области остается трансляция моделей in vitro и in vivo на легочный фиброз человека. Существует ряд животных моделей для изучения легочного фиброза.
Мы стремимся стандартизировать одну из наиболее часто используемых моделей, мышиную модель блеомицина, чтобы ее можно было легко адаптировать для использования в других лабораториях. Мы представляем минимально инвазивный, высоковоспроизводимый и безопасный метод введения блеомицина в мышиной модели легочного фиброза. Эта животная модель дополняет in vitro в исследованиях на людях.
Он включает в себя запуск типов клеток, критически важных для патогенеза, и физиологически воспроизводит изменения вентиляции, перфузии и газообмена, которые происходят во время травмы. Мы прогнозируем, что вмешательства, которые значительно снижают гистопатологическую тяжесть in vivo, могут указывать на лучшие клинические исходы. Приступайте к приготовлению растворов блеомицина в химическом колпаке с соблюдением надлежащих химиотерапевтических мер предосторожности.
Сначала растворите порошок блеомицина в стерильном ПБС для приготовления исходной концентрации 10 единиц на миллилитр. В зависимости от конкретного используемого блеомицина и цели эксперимента приготовьте окончательную рабочую концентрацию в соответствии с требуемой дозой в зависимости от массы тела. Чтобы отрегулировать итоговый объем введения, разведите блеомицин до 0,375 единиц на миллилитр, обеспечив общий объем в 50 миллилитров для 25-граммовой мыши.
Подвесьте мышь под наркозом на процедурной платформе под углом от 60 до 80 градусов, подвесив ее за передние резцы, чтобы эффективно открыть ротоглотку. Окклюзируют носовой ход с помощью гладкого микрососудистого зажима для форсирования дыхания через ротоглотку. С помощью щипцов втяните язык из ротоглотки.
С помощью шаговой пипетки с огрызком приманки аккуратно поместите желаемый объем блеомицина или физиологического раствора в заднюю часть ротоглотки. Убедитесь, что видимый пузырь жидкости очень заметен. Продолжайте удерживать язык на месте, пока мышь не начнет всасывать раствор, который явно и часто слышен.
Как только аспирация подтвердится, осторожно снимите носовой зажим. Наблюдайте за мышью в подвешенном положении в течение 15 секунд, чтобы убедиться в отсутствии обратного сброса раствора блеомицина, прежде чем вернуть ее в клетку. Затем поместите животное на бок в клетку, подложив под нее грелку, чтобы сохранить термонейтральность.
Аккуратно ущипните пальцы ног и следите за тем, чтобы животные оставались эвтермическими, чтобы облегчить пробуждение. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не придут в полное сознание, что обычно занимает от одного до двух часов в зависимости от дозы кетамина, размера и метаболизма животного. Ежедневно проводите клиническое наблюдение за мышами на предмет изменений массы тела, груминга, уровня активности и респираторного статуса.
Отслеживайте вес как ключевой маркер эффективности модели. В подходящее время соберите легкие у правильно усыпленных мышей. Для гистологии рассекают легкие на блоке и фиксируют их в 4% параформальдегиде на 24 часа.
Приступайте к заделке, срезам и окрашиванию парафина с использованием гематоксилина и эозина или трихрома Массона. Для измерения растворимого коллагена гомогенизируйте правое легкое. Для проточной цитометрии переваривают правое легкое с помощью диссоциатора тканей и ферментативного раствора для получения одноклеточной суспензии.
Выполняйте проточное цитометрическое окрашивание и анализ в соответствии со стандартными протоколами. По сравнению с контролем PBS, фиброзные изменения в альвеолярных перегородках и небольших воспалительных или фиброзных участках наблюдались в образцах легких, обработанных блеомицином, к седьмому дню. К 14-му дню появились более крупные и сливающиеся фиброзные области со значительным разрушением нормальной альвеолярной архитектуры.
К 21-му дню фиброзные изменения сохранялись без более значительного увеличения. Модифицированная система оценки Эшкрофта подтвердила, что уровни фиброза были одинаковыми между 14 и 21 днями. Анализ гидроксипролина, проведенный на 14-й день, продемонстрировал увеличение общего содержания растворимого коллагена в легких, обработанных блеомицином, по сравнению с контролем.
Количественный анализ полимеразной цепной реакции показал повышение регуляции профибротических генов Col1A1 и TGFB в ответ на блеомицин. Анализ проточной цитометрии выявил устойчивую инфильтрацию миелоидных клеток, включая интерстициальные макрофаги, альвеолярные макрофаги, полученные из моноцитов, и нейтрофилы в легких.
