המחקר שלנו מבקש להבין את המנגנונים החיסוניים העומדים בבסיס הפתוגנזה של פיברוזיס ריאתי. אחד האתגרים הגדולים ביותר בתחום נותר תרגום מודלים in vitro ו-in vivo לפיברוזיס ריאתי אנושי. קיימים מספר מודלים של בעלי חיים לחקר פיברוזיס ריאתי.
אנו מבקשים לתקנן את אחד המודלים הנפוצים ביותר, מודל עכברי הבלאומיצין, כך שניתן יהיה להתאים אותו בקלות לשימוש במעבדות אחרות. אנו מציגים שיטה זעיר פולשנית, ניתנת לשחזור ובטוחה למתן בלאומיצין במודל העכברי של פיברוזיס ריאתי. מודל בעלי חיים זה מחמיא במבחנה במחקרים בבני אדם.
זה כרוך בהפעלת סוגי התאים החיוניים לפתוגנזה ומשכפל פיזיולוגית שינויים באוורור, זלוף וחילופי גזים המתרחשים במהלך פציעה. אנו חוזים כי התערבויות המפחיתות באופן משמעותי את חומרת ההיסטופתולוגית in vivo עשויות להצביע על תוצאות קליניות טובות יותר. המשך להכין תמיסות בלאומיצין במכסה מנוע כימי תוך הקפדה על אמצעי זהירות כימותרפיים נאותים.
ראשית ממיסים אבקת בלאומיצין ב-PBS סטרילי להכנת ריכוז מלאי של 10 יחידות למיליליטר. בהתאם לבלאומיצין הספציפי בו נעשה שימוש ולמטרת הניסוי, הכינו את ריכוז העבודה הסופי לפי המינון הנדרש על סמך משקל הגוף. כדי להתאים את נפח הניהול הסופי, יש לדלל את הבלאומיצין ל -0.375 יחידות למיליליטר, מה שמבטיח נפח כולל של 50 מיליליטר לעכבר של 25 גרם.
תלו את העכבר המורדם כהלכה על הפלטפורמה הפרוצדורלית בזווית של 60 עד 80 מעלות על ידי תלייתו על ידי החותכות הקדמיות שלו כדי לפתוח ביעילות את האורופרינקס. חסום את מעבר האף באמצעות מהדק מיקרו-וסקולרי חלק כדי לאלץ נשימה דרך הפה והלוע. בעזרת מלקחיים, משוך את הלשון מהלוע.
בעזרת פיפטת צעד עם קצה בדל פיתוי, הנח בעדינות את הנפח הרצוי של בלאומיצין או בקרת מי מלח בחלק האחורי של האורופרינקס. ודא שבועת נוזל גלויה נראית לעין. המשך להחזיק את הלשון במקומה עד שהעכבר שואף את התמיסה, הנראית לעין ולעתים קרובות בקול.
לאחר אישור השאיבה הסר בזהירות את אטב האף. התבונן בעכבר במצב תלייה למשך 15 שניות כדי להבטיח שאין ריפלוקס של תמיסת הבלאומיצין לפני החזרתו לכלוב שלו. לאחר מכן הניחו את החיה על צדה בכלוב שלה עם כרית חימום מתחתיה כדי לשמור על ניטרליות תרמית.
צבטו בעדינות את אצבעות הרגליים וודאו שבעלי החיים יישארו אותרמיים כדי להקל על ההתעוררות. עקוב אחר העכברים עד שהם חוזרים להכרה מלאה, מה שבדרך כלל לוקח שעה עד שעתיים בהתאם למינון הקטמין וגודל החיה וחילוף החומרים. עקוב קלינית אחר העכברים מדי יום לאיתור שינויים במשקל הגוף, הטיפוח, רמת הפעילות ומצב הנשימה.
עקוב אחר המשקל כסמן מרכזי ליעילות המודל. בזמן המתאים, קצרו את הריאות מהעכברים שהומתו כהלכה. לצורך היסטולוגיה, נתחו את הריאות בבלוק וקבעו אותן ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות.
המשך בהטמעה, חתך וצביעה של פרפין באמצעות המטוקסילין ואאוזין או הטריכרום של מאסון. למדידת קולגן מסיס, הומוגניזציה של הריאה הימנית. עבור ציטומטריית זרימה, עכל את הריאה הימנית באמצעות דיסוציאטור רקמות ותמיסה אנזימטית לקבלת תרחיף תא בודד.
בצע צביעה וניתוח זרימה ציטומטרית בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. בהשוואה לביקורת PBS, שינויים פיברוטיים במחיצות המכתשית ובאזורים דלקתיים או פיברוטיים קטנים נצפו בדגימות ריאה שטופלו בבלומיצין עד היום השביעי. ביום ה-14 הופיעו אזורים פיברוטיים גדולים ומשולבים יותר עם הרס משמעותי של הארכיטקטורה המכתשית הרגילה.
ביום ה-21, השינויים הפיברוטיים נמשכו ללא עלייה משמעותית יותר. שיטת הניקוד המעודכנת של אשקרופט אישרה שרמות הפיברוזיס היו דומות בין הימים 14 ל-21. בדיקות הידרוקסיפרולין שבוצעו ביום ה-14 הדגימו עלייה בתכולת הקולגן המסיס הכוללת בריאות שטופלו בבלאומיצין בהשוואה לביקורת.
ניתוח כמותי של תגובת שרשרת פולימראז הראה ויסות מוגבר של גנים פרופיברוטיים Col1A1 ו-TGFB בתגובה לבלאומיצין. ניתוח ציטומטריית זרימה חשף חדירה חזקה של תאים מיאלואידיים כולל מקרופאגים אינטרסטיציאליים, מקרופאגים מכתשית שמקורם במונוציטים ונויטרופילים בריאות.
