В исследовании изучается развитие атеросклеротического поражения в дуге аорты и корне нокаутированных мышей ЛПНП, предлагается протокол выделения, окрашивания и анализа для оценки состава бляшек тяжести атеросклероза. Помимо гистологического исследования, используемого в этом исследовании, практические методы оценки атеросклероза также включают биохимические маркеры, молекулярно-биологические тесты и ультразвуковое исследование сосудов. Точность процедуры диссекции представляет собой самое большое техническое препятствие при выполнении in vivo стриппинга аорты на мышиной модели атеросклероза.
Для начала поместите усыпленных мышей в лежачем положении на пенопластовую доску, покрытую одним-двумя слоями впитывающей бумаги. Зафиксируйте конечности булавками для стабилизации тела. Распылите 75% этанол на брюшную полость мышей, чтобы очистить и увлажнить шерсть.
С помощью щипцов захватите брюшную кожу мыши. Затем с помощью тонких ножниц разрежьте кожу от основания живота до верхней части шеи. Откройте брюшную стенку и с помощью щипцов подтяните грудину.
Разрежьте диафрагму и ребра, чтобы обнажить грудную полость. Удалите пищевод и трахею, чтобы облегчить очищение сонных артерий. Аккуратно удалите органы, включая печень, легкие, селезенку, желудочно-кишечный тракт и поджелудочную железу, сохранив при этом почки и брюшную аорту.
При рассечении брыжеечных артерий поднимите кишечник и сделайте разрезы в сторону от аорты, чтобы избежать повреждения. Теперь поместите мышь под стереомикроскоп, чтобы обеспечить четкое поле наблюдения, и совместите источник холодного света с областью вскрытия. С помощью шприца объемом 10 миллилитров, наполненного PBS, медленно введите иглой в верхушку левого желудочка и наблюдайте за расширением аорты.
Аккуратно сотрите кровь и жидкость в области вскрытия папиросной бумагой, чтобы полностью обнажить поле зрения. Затем обхватите щипцами диафрагмальный сегмент грудной аорты и с помощью пружинных ножниц разрежьте соединительную ткань между аортой и стенкой грудной мышцы. Аккуратно потяните сердце щипцами и приподнимите грудную аорту.
Понаблюдайте за ветвями дуги аорты и рассеките адвентициальный жир и соединительную ткань вокруг дуги аорты и ее ветвей вверх по грудной аорте. Рассеките брюшную аорту и общие подвздошные артерии вниз по грудному отделу аорты. Обрежьте сердечную ткань и разрежьте нижнюю половину сердца по плоскости, параллельной предсердиям, и поместите обрезанное сердце в подходящую среду для хранения.
Перед рассечением дуги аорты подложите под нее небольшую прокладку темного цвета для создания контраста. Сделайте фотографию области дуги аорты. Разрежьте общие подвздошные артерии на один-два миллиметра ниже их разветвления, а небольшие ответвления аорты обрежьте вдоль позвоночника, чтобы освободить ее.
После отсоединения почечных артерий рядом с почками отрежьте три сосуда на шейке от их дистальных концов. Наконец, разрежьте восходящую аорту рядом с сердцем. Заранее приготовьте один миллилитр 4%-ного раствора параформальдегида в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров.
Поместите аорту в подготовленную трубку, и зафиксируйте ее при комнатной температуре не менее чем на 24 часа. Затем перенесите аорту в чашку Петри, содержащую PBS, чтобы предотвратить ее высыхание. Под стереомикроскопом осторожно удалите оставшийся адвентициальный жир с помощью щипцов и пружинных ножниц, чтобы уменьшить помехи при количественном определении бляшек.
С помощью пружинных ножниц аккуратно разрежьте аорту по ее внутренней продольной оси. Последовательно разрежьте три ветви дуги аорты вдоль боковой стороны до уровня кривизны дуги аорты, позволяя ей полностью разойтись. На этом этапе либо продолжайте окрашивание маслом Red O, либо храните аорту в 4% параформальдегиде для будущего анализа.
Поместите разрезанную аорту в шестилуночную пластину. Добавьте в каждую лунку по одному миллилитру стерильной дважды дистиллированной воды и промывайтесь в течение пяти минут на шейкере. Поместите пластину с шестью лунками в вытяжной шкаф и высушите на воздухе в течение 20 минут, пока не останутся видимые водяные знаки.
Добавьте в каждую лунку по одному миллилитру свежеприготовленного рабочего раствора Oil Red O. Встряхнув пластину в течение 20 минут, удалите из лунок раствор Oil Red O. Добавьте в каждую лунку по два миллилитра стерильной дважды дистиллированной воды и промывайтесь в течение пяти минут.
После трех промываний держите аорту в воде двойной дистилляции. Перенесите аорту на предметное стекло и подложите под предметное стекло черную резиновую прокладку для усиления контраста. Раздвиньте аорту во время просмотра под стереомикроскопом.
Теперь поместите слайд на белую бумагу, чтобы еще больше усилить контраст. Расположите линейку рядом со слайдом и сделайте фотографию с помощью фотоаппарата. Храните обработанную аорту в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, содержащей один миллилитр PBS, чтобы она оставалась влажной.
Масса тела мышей с нокаутом из ЛПНП, которых кормили диетой в западном стиле, значительно увеличилась по сравнению с теми, кого кормили диетой чау. Уровни триглицеридов и общего холестерина в плазме крови были значительно выше в группе западной диеты, чем в контрольной группе. Окрашивание Aortic Oil Red O показало значительное накопление липидов в артериях мышей с нокаутом ЛПНП, которых кормили диетой в западном стиле, по сравнению с теми, кто сидел на диете чау.
Увеличение липидных отложений коррелировало с более тяжелыми атеросклеротическими поражениями. Область поражения корня аорты и некротическое ядро были значительно больше у мышей, которых кормили западной диетой, по сравнению с мышами, которых кормили чау-диетой. Количественная оценка области поражения корня аорты и области некроза подтвердила, что западная диета усугубляет образование атеросклеротических бляшек у мышей с нокаутом ЛПНП.
