L’étude étudie le développement de lésions athéroscléreuses dans l’arc aortique et la racine de souris knock-out LDLR, offrant un protocole d’isolement, de coloration et d’analyse pour évaluer la composition de la plaque de gravité de l’athérosclérose. Outre l’examen histologique utilisé dans cette étude, les techniques pratiques d’évaluation de l’athérosclérose comprennent également des marqueurs biochimiques, des tests de biologie moléculaire et des échographies vasculaires. La précision de la procédure de dissection constitue le plus grand obstacle technique à la réalisation d’un stripping aortique in vivo dans le modèle murin de l’athérosclérose.
Pour commencer, placez les souris euthanasiées en position couchée sur un panneau de mousse recouvert d’une à deux couches de papier absorbant. Fixez les membres avec des épingles pour stabiliser le corps. Vaporisez de l’éthanol à 75 % sur l’abdomen des souris pour nettoyer et humidifier la fourrure.
Utilisez des pinces pour saisir la peau ventrale de la souris. Ensuite, à l’aide de ciseaux fins, coupez la peau de la base de l’abdomen jusqu’au haut du cou. Ouvrez la paroi abdominale et utilisez des pinces pour soulever le sternum.
Coupez à travers le diaphragme et les côtes pour exposer la cavité thoracique. Enlever l’œsophage et la trachée pour faciliter le nettoyage des artères carotides. Retirez soigneusement les organes, y compris le foie, les poumons, la rate, le tractus gastro-intestinal et le pancréas tout en préservant les reins et l’aorte abdominale.
Lors de la dissection des artères mésentériques, soulevez les intestins et faites des incisions en vous éloignant de l’aorte pour éviter les dommages. Maintenant, placez la souris sous un stéréomicroscope pour fournir un champ d’observation clair et alignez une source de lumière froide avec la zone de dissection. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres remplie de PBS, injectez lentement dans l’apex ventriculaire gauche à l’aide d’une aiguille et observez la dilatation de l’aorte.
Essuyez doucement le sang et le liquide dans la zone de dissection avec du papier de soie pour exposer complètement le champ de vision. Ensuite, saisissez le segment diaphragmatique de l’aorte thoracique à l’aide d’une pince et utilisez des ciseaux à ressort pour couper le tissu conjonctif entre l’aorte et la paroi musculaire thoracique. Tirez doucement le cœur avec une pince et soulevez l’aorte thoracique.
Observez les branches de l’arc aortique et disséquez la graisse adventice et le tissu conjonctif autour de l’arc aortique et ses branches vers le haut le long de l’aorte thoracique. Disséquez l’aorte abdominale et les artères iliaques communes vers le bas le long de l’aorte thoracique. Coupez le tissu cardiaque et coupez la moitié inférieure du cœur le long d’un plan parallèle aux oreillettes, et placez le cœur coupé dans un support de stockage approprié.
Avant de disséquer l’arc aortique, placez un petit joint de couleur foncée en dessous pour créer un contraste. Prenez une photo de la région de l’arc aortique. Coupez les artères iliaques communes d’un à deux millimètres en dessous de leur bifurcation et coupez les petites branches de l’aorte le long de la colonne vertébrale pour la libérer.
Après avoir détaché les artères rénales près des reins, coupez les trois vaisseaux ramifiés du cou à partir de leurs extrémités distales. Enfin, coupez l’aorte ascendante près du cœur. Préparez à l’avance un millilitre de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Placez l’aorte dans le tube préparé et fixez-la à température ambiante pendant au moins 24 heures. Ensuite, transférez l’aorte dans une boîte de Pétri contenant du PBS pour éviter qu’elle ne se dessèche. Sous un stéréomicroscope, retirez soigneusement toute graisse adventice restante à l’aide de pinces et de ciseaux à ressort pour réduire les interférences dans la quantification de la plaque.
À l’aide de ciseaux à ressort, ouvrez soigneusement l’aorte le long de son axe longitudinal intérieur. Séquentiellement, coupez les trois branches de l’arc aortique le long du côté latéral jusqu’au niveau de la courbure de l’arc aortique, lui permettant de s’étendre complètement. À ce stade, procédez à la coloration au rouge d’huile O ou stockez l’aorte dans du paraformaldéhyde à 4 % pour une analyse future.
Placez l’aorte ouverte coupée dans une assiette à six puits. Ajoutez un millilitre d’eau stérile double distillée dans chaque puits et lavez pendant cinq minutes sur un shaker. Placez la plaque à six puits dans une hotte et faites sécher à l’air libre pendant 20 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste plus de filigranes visibles.
Ajoutez un millilitre de solution de travail Oil Red O fraîchement préparée dans chaque puits. Après avoir secoué la plaque pendant 20 minutes, retirez la solution d’Oil Red O des puits. Ajoutez deux millilitres d’eau stérile double distillée dans chaque puits et lavez pendant cinq minutes.
Après trois lavages, conservez l’aorte dans de l’eau distillée doublement. Transférez l’aorte sur une lame et placez un tampon en caoutchouc noir sous la lame pour améliorer le contraste. Écartez l’aorte tout en observant au stéréomicroscope.
Maintenant, placez la diapositive sur un papier blanc pour améliorer encore le contraste. Placez une règle à côté de la diapositive et prenez une photo à l’aide d’un appareil photo. Conservez l’aorte traitée dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre contenant un millilitre de PBS pour la garder humide.
Le poids corporel des souris knock-out LDLR nourries avec un régime de style occidental a considérablement augmenté par rapport à celles nourries avec le régime chow. Les taux de triglycérides plasmatiques et de cholestérol total étaient significativement plus élevés dans le groupe diététique de style occidental que dans le groupe témoin. La coloration Aortic Oil Red O a montré une accumulation sévère de lipides dans les artères des souris knock-out LDLR nourries avec le régime de style occidental par rapport à celles suivant un régime chow.
L’augmentation des dépôts lipidiques était corrélée à des lésions athéroscléreuses plus graves. La racine aortique, la zone lésionnelle et le noyau nécrotique étaient significativement plus grands chez les souris nourries au régime occidental par rapport aux souris nourries au régime chow. La quantification de la racine aortique, de la zone lésionnelle et de la zone nécrotique a confirmé que le régime occidental exacerbait la formation de plaques d’athérosclérose chez les souris knock-out LDLR.
