Nuestra investigación proporciona una guía útil para estudiar la interacción bioquímica entre microbacterium tuberculosis y los sensores microbianos que expresan micrófagos humanos y será relevante para las moléculas más rígidas que juegan un papel en la entrada de microbacterium tuberculosis a los fibrocitos. La interacción de los receptores se ha estudiado a lo largo de los años utilizando enfoques que suelen emplear el uso de máquinas reporteras, moléculas herméticas, proteínas recombinantes niveladas, knockout, knockdown, modelos de menor expresión. Estas técnicas pueden ser desafiantes, requerir mucho tiempo y, a veces, ser costosas.
Utilizando el protocolo publicado, demostramos por primera vez que en los macrófagos, el receptor SLMF1 interactúa con Mycobacterium tuberculosis, promoviendo la absorción bacteriana y conduciendo a la maduración endolisosomal. Hemos superado las dificultades asociadas a los experimentos de expresión génica y hemos descrito una nueva diana para nuevas estrategias terapéuticas. Nuestro protocolo ofrece dos alternativas para detectar la interacción bioquímica entre la microbacteria tuberculosis y el sensor microbiano SLMF1 mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia, dos técnicas habitualmente disponibles y utilizadas fructíferamente.
Esta metodología tiene muchos usos potenciales y puede ser fácilmente adaptada en otros contextos de investigación. Proporcionamos un protocolo sencillo que evalúa la interacción del receptor de Mycobacterium tuberculosis utilizando bacterias inactivadas y sonicadas de células enteras, que puede realizarse en condiciones BSL2, pero se adapta fácilmente a otros receptores y cepas vivas. Si es necesario, estos ensayos también podrían realizarse en condiciones BSL3 con diferentes patógenos vivos.
Para comenzar, transfiera cuidadosamente la sangre recolectada de donantes sanos a tubos de 50 mililitros y dilúyala a la mitad de su volumen con solución salina. Prepare un medio de gradiente de densidad y centrifugue la muestra para separar las células mononucleares de sangre periférica, PBMC. Recoja las PBMC del halo blanquecino.
Después de contar las células en una cámara de recuento de células, realice una selección magnética con perlas de CD14 para recoger los monocitos CD14 positivos. A continuación, vuelva a suspender las células aisladas en el medio RPMI 1640. Siembre 500 microlitros de monocitos CD14 positivos a una concentración de uno por 10 elevado a una potencia de seis células por mililitro en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos en ausencia de suero para promover la adherencia.
Después de dos horas, lave los pocillos con medio RPMI 1640 precalentado para eliminar las células no adherentes. Diferencie los monocitos en macrófagos utilizando un mililitro de medio RPMI 1640 completo durante 16 a 18 horas. Al día siguiente, lave los pocillos con un mililitro de PBS y agregue un mililitro de medios RPMI 1640 completos a cada pocillo.
Estimular los macrófagos con 10 microlitros de antígenos sonicados de mycobacterium tuberculosis durante 24 horas. Al día siguiente, utilizando una pipeta P-1000, deseche el medio RPMI completo de los pocillos de la placa. Agregue PBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para recolectar los macrófagos.
Transfiera las celdas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación suplementado.
Incuba la suspensión en hielo durante una hora, agitando el vórtice cada 10 minutos. Centrifugar la suspensión a 14.000 g durante 15 minutos y recoger el sobrenadante. Incubar una vez 10 a la potencia de seis células enteras de Mycobacterium tuberculosis inactivadas con 50 microlitros de extracto de proteína de una vez 10 a la potencia de seis macrófagos durante la noche a cuatro grados Celsius en un soporte de microtubo giratorio.
Al día siguiente, para teñir el complejo de bacterias proteicas, agregue el anticuerpo antihumano SLAMF1 al microtubo, agite la mezcla e incube durante la noche durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Después de lavar los complejos de bacterias proteicas con FACS, vuelva a suspenderlos en el tampón FACS y adquiera la muestra en un citómetro de flujo. Con pinzas quirúrgicas de punta redonda, coloque cubreobjetos redondos de 12 milímetros en los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos.
Incubar el cubreobjetos con antígenos de rodamina mycobacterium tuberculosis durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue 100 microlitros de extracto de proteína diluido en 300 microlitros de PBS e incube durante dos horas a temperatura ambiente con agitación. Envuelva la tapa de la placa de cultivo con una película de parafina.
Agregue una gota de 60 microlitros de anticuerpo primario anti SLAMF1 previamente titulado sobre la tapa cubierta con película de parafina. Retire con cuidado el cubreobjetos de la placa con pinzas quirúrgicas y agujas curvas de punta fina. Después de la incubación con solución de anticuerpos primarios y secundarios, retire el exceso de líquido y monte el cubreobjetos sobre una gota de líquido de montaje colocada en un portaobjetos de vidrio.
Coloque el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia y observe las células utilizando los filtros adecuados. Los monocitos se aislaron con éxito de las PBMC con una pureza del 95% o más, y se generaron macrófagos derivados de monocitos después de la adherencia y el cultivo nocturno. Se indujo la expresión superficial de SLAMF1 en macrófagos estimulados con antígenos de Mycobacterium tuberculosis y sus niveles se confirmaron mediante citometría de flujo.
La interacción entre SLAMF1 y las células enteras de Mycobacterium tuberculosis se demostró mediante un ensayo de reticulación seguido de citometría de flujo. La interacción entre los antígenos SLAMF1 y Mycobacterium tuberculosis se visualizó mediante microscopía de fluorescencia con colocalización confirmada por imágenes combinadas.
