Мы стремимся разработать практичный и доступный настольный протокол для выявления потенциальных тромбогенных горячих точек в желудочковых вспомогательных устройствах, преодолевая критический разрыв между ранним прототипированием и испытаниями на животных. Испытания на животных остаются основным методом оценки тромбоза в желудочковых вспомогательных устройствах. Несмотря на то, что вычислительная гидродинамика стала бесценным инструментом для верификации конструкций, она пока не может вытеснить валидацию in vitro и in vivo.
Сложный характер наличия свертываемости крови и многочисленные искажающие факторы затрудняют различие между фактической тромбогенностью устройства и экспериментальными артефактами. Методы in vitro для оценки тромбоза при VADs остаются недостаточно используемыми, и на сегодняшний день не существует стандартизированного метода. Предлагая всеобъемлющий протокол и видеоруководство, мы надеемся способствовать более широкому внедрению настольных методов.
Этот метод решает как техническую, так и этическую проблему при разработке медицинского оборудования, снижая зависимость от испытаний на животных, одновременно улучшая способность выявлять риски тромбоза на ранних этапах процесса разработки. Для начала заполните тестовый контур 150 миллилитрами крови. Устраните весь воздух, попавший в петлю.
Если вы используете аксиальный насос для крови, поверните его в вертикальное положение, чтобы выпустить воздух за счет плавучести. Если вы используете центробежный насос, переверните его вверх дном и поворачивайте, чтобы воздух не попал во вторичные потоки. Осторожно постучите по поверхностям трубок и резервуара и сожмите все пузырьки воздуха, чтобы вытеснить их.
Внимательно осмотрите горизонтальные участки трубок и соединения между трубками и соединителями, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха. Сожмите мешок для внутривенного введения, чтобы приблизить уровень жидкости к узкой верхней части. Затем зажмите мешок с гемостатом поперек линии жидкости, чтобы устранить границу раздела жидкость-воздух, и закройте запорный кран вентиляционного отверстия.
Далее закройте запорный кран в конце напорных линий. Снимите трубку манометра и прикрепите к нему трехмиллилитровый шприц. Откройте запорный кран и наберите один-два миллилитра жидкости в удлинительную линию, примерно на четыре сантиметра.
Закройте запорный кран, отсоедините шприц и снова подсоедините трубку манометра. Откройте запорный кран, чтобы включить показания давления. Наконец, загрунтуйте отверстие для отбора проб с помощью шприца.
Далее разрежьте или порвите безворсовую салфетку на три равных фрагмента. Закрутите угол одного осколка, чтобы получился наконечник и вставьте его в отверстие для инъекций для впитывания остатков крови. Скручиваем второй фрагмент.
Смочите его солевым раствором и вставьте влажный кончик в порт, чтобы удалить всю оставшуюся кровь. Используйте третий фрагмент, чтобы впитать остатки физиологического раствора в порту. Теперь запустите вспомогательное желудочковое устройство, или VAD, на низкой скорости и работайте им около пяти секунд, чтобы выбить все захваченные пузырьки воздуха внутри насоса.
Остановите насос. Если в пакете появились пузырьки, повторите проветривание. Перезапустите насос на низкой скорости, чтобы кровь циркулировала в контуре.
Переложите в отдельные пробирки один миллилитр гепарина натрия, два миллилитра приготовленного раствора хлорида кальция и 1,5 миллилитра ЭДТА. Чтобы добавить гепарин в кровь в петле, аспирируйте 75 единиц гепарина в микропипетку и дозируйте его в трехмиллилитровый шприц, одновременно дозируя пипетку и извлекая поршень шприца, не проливая его. Используйте поперечный порт трехстороннего запорного крана для введения веществ в петлю с помощью шприца.
Поверните фиксатор приманки с наружной резьбой на запорном кране так, чтобы отверстие для впрыска было направлено вверх, чтобы улавливать пузырьки воздуха в верхней части. Теперь прикрепите шприц к порту для инъекций с помощью замка приманки портом вверх, а шприц направлен вертикально вниз. Возьмите поршень шприца, чтобы наполнить его кровью, и смешайте гепарин с кровью, втягивая воздух в шприц.
Дайте пузырькам воздуха подняться до верхней части шприца. Затем введите смесь в контур, следя за тем, чтобы воздух не попадал внутрь. Внесите кровь в шприц и выйдите из него четыре-пять раз, чтобы убедиться, что гепаринизированная кровь не остается в пространстве в порту.
Чтобы титровать активированное время свертывания крови, или ACT, в петле, сначала добавьте 750 микролитров одномолярного раствора хлорида кальция на 150 миллилитров крови в петле. Чтобы предотвратить свертывание крови, быстро вводите жидкость после удаления остатков воздуха. В качестве альтернативы разбавьте хлорид кальция в шприце одним миллилитром трис-буферного физиологического раствора, чтобы уменьшить преждевременную коагуляцию.
Дав введенному хлориду кальция циркулировать не менее двух минут, приложите к порту для отбора проб шприц объемом один миллилитр. Наберите и выбросьте 0,5 миллилитра отработанной крови, чтобы очистить порт от застоявшейся крови. Далее приложите новый одномиллилитровый шприц к порту для забора материала и возьмите 0,5 миллилитра крови для анализа.
Измерьте активированное время свертывания крови с помощью системы свертывания цельной крови в месте оказания медицинской помощи. Очистите отверстие для отбора проб с помощью безворсовых салфеток, как было показано ранее. Обратитесь к значениям титрования, чтобы узнать целевую концентрацию хлорида кальция.
Постепенно увеличивайте концентрацию кальция для достижения активированного времени свертывания 300 секунд. Начните тест на тромбоз in vitro, как только в петле будет достигнут ACT продолжительностью 300 секунд. Отрегулируйте насос до желаемого расхода и давления, изменяя частоту вращения ротора и регулируя сопротивление с помощью зажима Хоффмана.
Измеряйте ACT каждые 15 минут, беря образец крови из петли и помещая каплю крови в инструмент ACT, как было показано ранее. Если ACT падает ниже 200 секунд, введите в петлю еще 25 единиц гепарина натрия. Через час введите в петлю 1,5 миллилитра 0,5-молярной ЭДТА, чтобы подавить дальнейшую коагуляцию.
Дайте ЭДТА циркулировать и перемешайте в течение двух минут, затем остановите насос. С помощью гемостатиков зажмите трубку, соединенную с входом и выходом насоса, расположив зажимы на расстоянии трех-четырех сантиметров от входных и выпускных штучек. Осторожно отсоедините трубку, чтобы освободить насос.
Затем слейте кровь из насоса и проточной петли в емкость. Наконец, пипеткой введите физиологический раствор через входное и выходное отверстия насоса, чтобы смыть остатки крови. Отложение тромбоцитов последовательно наблюдалось вдоль корней лопастей в прототипах насосов.
Электрополировка титановых компонентов устранила образование тромбов на этих участках. Прототип также имел несовершенную кооптацию в носовой и кормовой частях корпуса, что привело к образованию щели, в которую просачивалась кровь и сворачивалась. Притирка и полировка улучшили прилегание компонентов и снизили тромбообразование.
Процедурные ошибки и неполное отключение цикла могут привести к появлению артефактов. В этом случае экспериментальная ошибка во время инъекции хлорида кальция вызвала локализованную коагуляцию, и образовавшийся тромб попал в центробежный насос маглева, закупорив проточный путь. Сферические, слабо прилипшие сгустки, наблюдаемые на поверхностях, часто являются результатом пузырьков воздуха, заключенных в сгустки.
Инородные материалы и мусор, циркулирующие в контуре, также инкапсулировались в тромбы и прилипали к поверхностям насоса. Кольцевые тромбы на стыках соединительных трубок указывали на оптимальный диапазон ACT во время испытания.
