В нашем исследовании используется модель рыбок данио для изучения заболеваний крови человека, уделяя особое внимание выявлению новых биомаркеров, терапевтических мишеней и методов лечения таких заболеваний, как лейкемия. Используя уникальные преимущества рыбок данио, мы стремимся изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе гематологических заболеваний, и разработать инновационные терапевтические стратегии для улучшения результатов лечения пациентов. Внутривенное введение взрослым рыбкам данио затруднено из-за их небольшого размера и сложной сосудистой системы.
Мы разработали оптимизированный метод внутривенного введения для точной и эффективной доставки веществ или клеток взрослым рыбкам данио. По сравнению с внутрисердечной и ретроорбитальной инъекцией, метод внутривенного введения, который мы представляем здесь, привел к лучшей выживаемости рыб и лучшему приживлению клеток. Этот метод делает взрослых рыбок данио более пригодными для внесрочных исследований.
Преодолевая некоторые ограничения новых моделей, усовершенствованная техника внутривенного введения повышает точность моделей заболеваний и скрининга лекарств, помогая продвигать новые методы лечения. Для начала поместите усыпленную трансгенную рыбу данио-рерио mpo:EGFP на стол для препарирования. Препарируйте рыбок данио, чтобы выделить почечный мозг.
Затем перенесите костный мозг в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую клеточную суспензию. Пипеткой с помощью суспензии необходимо дезагрегировать клетки почечного мозга. Отфильтруйте клеточную суспензию через нейлоновое сетчатое фильтр 40 микрометров.
Затем центрифугируйте клетки при 500G в течение восьми минут и выбросьте надосадочную жидкость, прежде чем повторно суспендировать гранулу в 500 микролитрах клеточной суспензионной среды. С помощью автоматизированного счетчика ячеек подсчитывают клетки с помощью аликвоты в 10 микролитров. Тщательно промойте шприц Hamilton три-четыре раза с 75% этанолом.
Затем промойте шприц три-четыре раза сверхчистой водой, чтобы убедиться, что все остатки этанола удалены. После введения анестезии рыбкам данио-рерио подтвердите глубину анестезии уменьшением движений и потерей рефлекторных реакций. Расположите рыбу спинной стороной вверх так, чтобы голова была направлена влево на чистую влажную папиросную бумагу, чтобы стабилизировать ее для инъекции.
Крепко возьмитесь за шприц Гамильтона и направьте иглу примерно под углом 45 градусов к каудальной вене. Для рыбки данио Каспер нацельтесь на видимую часть судна через полупрозрачное тело. Осторожно введите иглу в сосуд и введите два микролитра цельных клеток почечного мозга, выделенных из трансгенных рыбок данио mpo:EGFP.
После инъекции слегка надавите ватной палочкой на место инъекции в течение 10 секунд, чтобы остановить кровотечение. Понаблюдайте за введенными рыбками данио под микроскопом, чтобы подтвердить сигналы GFP внутри сосуда. Дайте введенной рыбке данио восстановиться в только что стерилизованной рыбьей воде в течение 10 минут.
Затем пересадите рыбок в статичный резервуар. Метод внутривенной инъекции показал наивысший процент успеха: сигналы GFP были видны у 41 из 43 рыб. В то время как ретроорбитальный метод показал GFP только у трех из 37 рыб, а внутрисердечный метод показал успех у 11 из 40 рыб.
Метод внутривенной инъекции привел к улучшению показателей выживаемости у инъекционных рыб, особенно при более высоких дозах клеточных доз по сравнению с ретроорбитальными и внутрисердечными методами. Сигналы GFP были обнаружены уже на третий день после трансплантации у внутривенно введенных рыб, в то время как ретроорбитальные и внутрисердечные методы показали отсроченное начало сигнала GFP. К 17-му дню внутривенные инъекции рыб показали наиболее выраженные сигналы GFP в почном мозге.
Проточная цитометрия почечного мозга показала около 18% GFP-положительных клеток в рыбе, вводимой внутривенно в три раза по 10 в степени пяти клеток, выравнивающихся с уровнями GFP в донорском почечном мозге. Напротив, внутрисердечный и ретроорбитальный методы показали 5% и 2% GFP-положительных клеток соответственно.
