В этом протоколе описывается, как комбинация инфекции EcoHIV с мышами Tmem119-EGFP предлагает ценную биологическую систему для исследования изменений микроглии и вирусных резервуаров в моделях нейрокогнитивных расстройств, ассоциированных с ВИЧ, у грызунов. Комбинированная антиретровирусная терапия значительно улучшила качество жизни людей, живущих с ВИЧ. Чтобы понять, как ВИЧ влияет на центральную нервную систему, необходима надежная и осуществимая модель ВИЧ.
Ранее на модели крыс была разработана новая биологическая система, использующая химерный ВИЧ, EcoHIV в составе для исследования нейрокогнитивных нарушений и синаптической дисфункции. Серьезной проблемой остается выяснение нейроанатомического распределения EcoHIV, в частности, его дифференциальной экспрессии в различных типах клеток мозга. В текущем исследовании EcoHIV с флуоресцентным мечением mScarlet был модифицирован и ретроорбитально введен мышам Tmem119-EGFP, чтобы определить, являются ли микроглии основным типом клеток, ответственным за экспрессию вируса и резервуаром ВИЧ в мозге.
Для начала перенесите диссоциированные клетки мозга крысы плода в предварительно покрытый поли-L-лизином 12-луночный планшет со стеклянными вставками, содержащими один миллилитр DMEM-F12 плюс 10% FBS. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На следующий день замените среду нейробазальной средой с добавлением B27 и продолжайте культивирование клеток при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение трех недель.
Затем добавьте 60 микролитров EcoHIV-mScarlet в культуру клеток мозга и инкубируйте в течение шести дней. После инкубации зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом. Выполняйте иммуноокрашивание инфицированных клеток мозга с использованием специфических первичных антител и визуализируйте их на конфокальном микроскопе с 40-кратным объективом.
Микроглия была идентифицирована как основной инфицированный тип клеток в культурах клеток мозга крыс, о чем свидетельствует колокализация mScarlet с маркерами CD11b/c и Iba1. Для начала вскройте кожу головы обезглавленной взрослой мыши и перенесите мозговую ткань в другую чашку Петри, содержащую пять миллилитров стерилизованного HBSS. Снимите мозговые оболочки и перенесите лобную кору в два миллилитра HBSS.
Далее добавьте в смесь 20 микролитров 0,25% трипсина-ЭДТА. Выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре, вращая трубку каждые несколько минут. Перенесите диссоциированные клетки в предварительно покрытую поли-L-лизином колбу площадью 75 квадратных сантиметров, содержащую 10 миллилитров среды DMEM-F12 и 10% FBS.
Культивируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом до тех пор, пока они не достигнут 90% конфлюенции. Затем расщепите клетки мозга двумя миллилитрами 0,25% трипсина-ЭДТА. Субкультивируйте переваренные клетки мозга в 35-миллиметровой стеклянной нижней чашке, содержащей пять миллилитров питательной среды DMEM-F12, пока они не достигнут 80% конфлюенции.
Затем добавьте восемь микролитров EcoHIV-mScarlet в глиальные клетки мыши и инкубируйте в течение двух дней. Первичные глиальные клетки взрослых мышей были успешно инфицированы EcoHIV-mScarlet после двух дней лечения. Для начала закрепите мышь под наркозом Tmem119-EGFP в боковом положении.
Разморозьте EcoHIV-mScarlet на льду. Залейте вирусный раствор во внутриглазной инъекторный шприц с помощью тупой иглы 33-го калибра. Поместите мышь в правое боковое лежачее положение головой влево.
Определите область инъекции вокруг области глаза. Медленно и осторожно введите иглу в медиальный кантус глаза. Затем введите иглу в сосуды за глазным яблоком.
Введите 6,5 микролитров EcoHIV-mScarlet в ретроорбитальный синус. После инъекции осторожно извлеките иглу. Поместите мышь, находящуюся под наркозом, в лежачее положение внутри вытяжного шкафа для химических веществ.
Раскройте кожу вдоль средней линии грудной клетки. Затем отделите диафрагму и откройте грудную клетку ножницами. Теперь введите полуторную иглу 22-го калибра в левый желудочек.
Откройте правое предсердие ножницами. Профузируйте правое предсердие 50 миллилитрами предварительно охлажденного 100 миллимолярного PBS, затем перфузируйте 100 миллилитров предварительно охлажденного 4%-ного параформальдегида. Удалите весь мозг мыши.
После фиксации мозга в 4% параформальдегиде, закрепите мозговую ткань с помощью тканевого клея на металлической платформе вибратома. Вырежьте корональные секции толщиной 50 микрометров лезвиями из углеродистой стали. Затем поместите срезы мозга на предметные стекла с помощью кисти.
Немедленно добавьте по 0,1 миллилитра монтажной среды, препятствующей выцветанию, в каждую секцию. Наденьте на участки мозга защитный стеклоподъемник размером 22 на 50 миллиметров и просушите стекла Superfrost в темноте в течение одного дня. На следующий день используйте конфокальный микроскоп с длиной волны 488 нанометров и длиной волны 594 нанометра для получения многоканальных изображений интересующей области мозга.
Сигналы EcoHIV-mScarlet в основном наблюдались в микроглиальных клетках, помеченных EGFP в мозге мыши Tmem119-EGFP. В культивируемых клетках мозга крыс, получавших EcoHIV-mScarlet, не было обнаружено значительной нейрональной инфекции.
