Наше исследование направлено на измерение двух важнейших биофизических свойств псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей, которые могут быть получены путем дифференцировки нормальных эпителиальных клеток бронхов человека в воздушной жидкости. Мы идентифицировали различные особенности различных респираторных вирусов с помощью псевдостратифицированного эпителия дыхательных путей. Например, респираторно-синцитиальное воспаление цитоскелета, вызванное вирусом, которое является неканоническим механизмом бронхиолита.
Мы также идентифицировали гиперплазию бокаловидных клеток, увеличивающую репликацию SARS-CoV-2 при хронической обструктивной болезни легких эпителия дыхательных путей. Мы сосредоточились на выяснении механизма респираторно-синцитиальной вирус-индуцированной модуляции цитоскелетной сигнализации для выявления новых терапевтических мишеней для борьбы с РСВ-инфекцией и вирус-индуцированным бронхиолитом. Для начала примите нормальную суспензию клеток бронхиального эпителия человека, или NHBE.
С помощью пипетки P200 добавьте 50 000 ресуспендированных клеток в 200 микролитрах полной эпителиальной клетки дыхательных путей, или AEC, среды на апикальную сторону вставки. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для клеточных культур с влажностью углекислого газа от 85% до 95%. Как только клетки сольются, перенесите вкладыши в пустую лунку с помощью стерильных щипцов.
С помощью пипетки P1000 аспирируйте всю базальную AEC-среду. Затем добавьте в базальную лунку 500 микролитров свежей среды для полной дифференцировки ALI с добавлением 2% пенициллин-стрептомицина и 1% амфотерицина B. С помощью стерильных щипцов перенесите вставки в базальную лунку с добавлением полной среды ALI.
С помощью пипетки P200 аккуратно отасуньте апикальную среду AEC из лунки и инкубируйте ее. Через 48 часов перенесите вкладыши в пустую лунку с помощью стерильных щипцов. С помощью пипетки P1000 отсадите старую среду и добавьте 500 микролитров свежей полной среды ALI.
Поместите вкладыши обратно в лунку со свежей средой с помощью стерильных щипцов. На 26 день с помощью пипетки Р200 добавьте 100 микролитров DPBS на апикальную сторону вкладышей. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур в течение 30 минут.
Затем аспирируйте DPBS с помощью пипетки P200. Для начала включите микроскоп, подключенный компьютер и камеру окружающей среды. Откройте дверцу камеры и поместите пластину со вставками с элементами NBHE на предметный столик микроскопа.
Как только тарелка окажется на сцене, закройте камеру. Затем с помощью ручки управления столиком микроскопа переместите пластину и поместите вставки в поле зрения. На экране компьютера нажмите на значок системы SAVA, чтобы открыть программу SAVA.
В интерфейсе программного обеспечения нажмите «Настроить эксперимент». В следующей вкладке нажмите «Создать эксперимент». Затем в новой вкладке введите директорию, в которой будут храниться данные, в поле «Введите имя директории эксперимента» и укажите подробности в поле «Введите описание эксперимента», затем нажмите «ОК». Теперь нажмите на созданный эксперимент, который отображается в каталоге в разделе «Эксперименты».
После этого нажмите «Изменить» и укажите сведения об образце в поле «Описание образца». Нажмите «Добавить», затем нажмите «Выйти», чтобы выйти из вкладки. В главном интерфейсе программы выберите созданный эксперимент из выпадающего меню в слоте Эксперимент.
Затем нажмите «Записать видео», чтобы отслеживать частоту биения ресничек на экране компьютера. На экране будет отображаться сфокусированное движение ресничек. Для каждой вставки запишите шесть различных случайных полей в течение 2,1 секунды со скоростью 120 кадров в секунду.
Нажмите «Сохранить видео», чтобы отслеживать данные о частоте биения ресничек. Чтобы проанализировать данные, нажмите «Анализировать видео» в интерфейсе программного обеспечения. И в следующей вкладке нажмите OK. Затем перейдите на следующую вкладку и нажмите «Проанализировать все».
Загрузите электронную таблицу, созданную для каждого эксперимента, в папку SAVA Data Acquisition на компьютере. Возьмем среднюю частоту Гаусса для представления данных. Частота биения ресничек достигала не менее трех герц как для эпителия дыхательных путей здоровых взрослых, так и для пациентов с ХОБЛ, демонстрируя сопоставимую функцию ресничек.
Для начала включите вольт-омметр EVOM2 с помощью выключателя питания. Подключите тестовый резистор к EVOM2 через входной слот. Следите за показаниями на экране EVOM2.
Если показания выше или ниже 1 000, поверните переключатель ADJ на EVOM2 с помощью щипцов до тех пор, пока он не покажет равномерное показание 1 000 для калибровки устройства. Теперь возьмем пустую вставку для показаний экспериментального контроля. С помощью пипетки P200 добавьте 100 микролитров DPBS на апикальную сторону пустого вкладыша.
Затем добавьте 500 микролитров DPBS на базальную сторону с помощью пипетки P1000. После этого отсоедините тестовый резистор и подключите электрод STX2 к входному слоту на EVOM2. Затем аккуратно очистите электрод STX2 70% этанолом.
Вставьте электрод STX2 в пустую вставку с помощью DPBS, держа более короткую ножку электрода на апикальной части, а длинную — на базальной. Теперь запишите стабильные показания на экране EVOM2. Далее с помощью пипетки P200 добавьте 100 микролитров DPBS на апикальную сторону вкладыша.
Вставьте электрод STX2 во вставку с 26-дневным дифференцированным эпителием дыхательных путей, как показано ранее. Затем запишите стабильные показания на экран EVOM2. Значения трансэпителиального электрического сопротивления увеличивались у взрослых с ХОБЛ, что указывает на повышенную непроницаемость мембраны при ХОБЛ.
