Наше исследование было сосредоточено на разработке простой пошаговой методики подготовки гистологических препаратов и оценки сетчатки глаза грызунов. Результаты гистологического исследования сетчатки могут быть использованы для исследования многих офтальмологических заболеваний, в том числе нейродегенеративных и сосудистых заболеваний. В опубликованной литературе описание методики гистологического исследования глазных яблок грызунов весьма ограничено.
Отсутствуют пошаговые руководства, что затрудняет воссоздание для новичков. Мы считаем, что этот протокол будет полезен и другим исследователям. Несмотря на то, что существуют и другие методы, которые могут быть использованы для оценки морфологии сетчатки, в том числе оптическая когерентная томография, гистопатологическое исследование позволяет оценить отдельные клетки и дает меньше артефактов.
Таким образом, он может оказаться более полезным для исследования патомеханизмов офтальмологических заболеваний. Для начала удалите параформальдегид и сахарозу из морозильной камеры. Разрежьте глазное яблоко пополам по сагиттальной плоскости острым скальпелем.
Затем снимите и выбросьте линзу. Разморозьте глазное яблоко при комнатной температуре. Переместите две половинки в кассету, и промойте под проточной водой в течение 20 минут, чтобы смыть сахарозу.
Обезвоживайте глазное яблоко в возрастающей концентрации этанола в течение 15 минут под вытяжным шкафом, с окончательным обезвоживанием в ацетоне в течение семи минут. Чтобы очистить глазное яблоко, поместите его в ксилол на семь минут под вытяжной шкаф. Добавьте в стакан немного твердого парафина и поместите его в инкубатор, настроенный на температуру выше температуры плавления, указанной производителем парафина.
После того как парафин полностью растает, переместите глазное яблоко в стакан и оставьте стакан в инкубаторе на один час. Помешивайте стакан каждые 10-15 минут во время инкубации на предмет проникновения парафина в ткани. Далее откройте кассету и снимите верхнюю крышку.
Выберите металлическую форму, и налейте небольшое количество парафина, чтобы покрыть дно формы. Затем извлеките глазное яблоко из кассеты с помощью щипцов, и поместите одну половинку глазного яблока дном чашки вверх, а другую вниз на парафин в форме. Когда ткань закрепится на месте, тщательно накройте глазное яблоко парафином, а дно кассеты образует блок.
Перенесите блок на охлаждающую пластину до полного застывания. После застывания извлеките блок из металлической формы и поместите парафиновые блоки обратно на охлаждающую пластину на 15 минут. Закрепите парафиновый блок в микротоме.
Установите микротом, чтобы обрезать излишки парафина из блока, и обрезайте до тех пор, пока не будет достигнут центр глазного яблока. После изменения настроек микротома вырежьте более тонкие срезы по 3,5 мкм. Поместите разрезанный участок на предметное стекло.
Поместите предметное стекло в инкубатор на 15 минут, чтобы парафин растаял. Затем поместите предметное стекло в ксилол. После этого перенесите предметное стекло в 96% этанол.
После обработки этанолом промойте предметное стекло в проточной воде в течение пяти минут. Поместите предметное стекло на две минуты в гематоксилин Майера, а затем на две минуты в гематоксилин Майера с чистым раствором. Дважды промойте горку проточной водой по пять минут каждый.
Добавьте 1% эозина в течение двух минут, затем этанол в течение одной минуты и 30 секунд. Поместите предметное стекло на две минуты в ксилол, а затем на одну минуту ксилол еще одним стаканом с чистым раствором. Запечатайте предметное стекло с помощью автоматического запечатывателя слайдов.
Для начала откройте на компьютере отсканированное изображение глазного яблока крысы с высоким разрешением и найдите поперечные сечения зрачков. Увеличьте выбранное поперечное сечение путем прокрутки с помощью мыши. Затем поверните точку в правом углу, чтобы настроить ориентацию изображения так, чтобы сетчатка была горизонтальной.
Нажмите на поле увеличения в правом верхнем углу и выберите 20 раз, чтобы найти самую толстую часть сетчатки. Далее, кликните правой кнопкой мыши и выберите «Аннотация» и «Линейка». Наведите курсор мыши на внешнюю ограничивающую мембрану в самой толстой части сетчатки и нажмите левую кнопку, чтобы начать измерение.
Затем переместите курсор перпендикулярно внутренней ограничивающей мембране и нажмите левую кнопку еще раз, чтобы завершить измерение. Озаглавьте измерение как Толщина сетчатки и отметьте галочкой, чтобы показать название и длину. Затем с помощью линейки измерьте толщину каждого слоя сетчатки, включая внешний ядерный слой, внешний плексиформный слой, внутренний ядерный слой и внутренний плексиформный слой, и обозначьте их соответствующим образом.
Чтобы подсчитать количество клеток в слое ганглиозных клеток, выберите один участок сетчатки и с помощью линейки измерьте выбранное расстояние вдоль слоя ганглиозных клеток. Чтобы отметить тела ячеек, нажмите правую кнопку мыши и выберите «Аннотация», «Сохранено» и «1 x RBC». Нажмите на каждую клетку, идентифицированную как круглое, окрашенное ядром гематином тело вдоль слоя ганглиозных клеток по заданной длине сетчатки.
Толщина сетчатки, толщина отдельных слоев и количество клеток в слое ганглиозных клеток были измерены и сравнены у разных людей, чтобы оценить особенности нейродегенерации в сетчатке грызунов.
