Этот протокол включает в себя простой подход к оптимизации этапов культивирования, получению высококачественных эксплантов и будет способствовать изучению и раскрытию молекулярных механизмов кохлеарных клеток. Основным преимуществом этого метода является минимальное непосредственное воздействие на орган за счет координации этапов диссекции, соответствующего полимерного покрытия поверхности, оптимизированного объема среды и времени прикрепления эксплантатов. Этот метод представляет собой популярный in vitro подход к изучению нейросенсорной тугоухости.
Это может быть использовано для создания ототоксических моделей, выполнения структурного анализа, оценки сигнальных путей и проведения скрининговых исследований лекарственных препаратов. В принципе, этот метод можно применять к разным тканям эксплантатов. Он также может быть использован в исследованиях внутреннего уха, чтобы получить представление о стадиях эмбрионального развития.
Для начала положите обезглавленную голову крысы на стерильную подушечку. Используйте ножницы и щипцы, чтобы удалить нижнюю челюсть, затем поднимите кожу и снимите ее с черепа. Поместите щипцы в орбитальные полости, чтобы удерживать череп.
Острым лезвием скальпеля аккуратно разрежьте череп по сагиттальному шву, а затем по области венечного шва, не повреждая улитку. Теперь извлеките мозг из двух половин черепа. Под микроскопом локализовать улитку в височной кости и ослабить окружающие ткани между улиткой и височной костью.
Затем поместите щипцы в верхний полукружный канал. Осторожно оттяните височную кость от улитки и удерживайте улитку, прикрепленную к преддверию, височной костью. Вставьте кончики щипцов в область верхушки, которая видна в виде белой линии, и удалите хрящевую капсулу улитки по частям, чтобы обнажить кохлеарный проток.
Поместите щипцы под улитку и отделите их от вестибулярного органа и височной кости. Переложите улитку в новую 60-миллиметровую чашку, содержащую ледяной PBS. Чтобы изолировать кортиевские экстраплантированные органы, удерживайте орган у основания и кохлеарный проток в области базального крючка и осторожно отмотайте улитковый проток от модиолюса, не разрывая его.
Затем удерживайте улитковый проток у основания и оттягивайте спиральную связку и сосудистые полосы. Для изоляции кохлеарных эксплантов используйте щипцы, чтобы отделить спиральный ганглий от костной спиральной пластинки и размотать модиол во время отслоения. Щипцами возьмитесь за область крючка и удалите спиральную связку с васкулярной полосой.
Далее, снимаем мембрану Рейсснера по частям. Для переноса кохлеарных эксплантов обмакните лабораторный шпатель в чашку, содержащую эксплант. Поднимите эксплантат волосковыми клетками вверх вместе с несколькими микролитрами PBS, взмахнув шпателем.
Поместите эксплант в горку с восемью лунками, осторожно помахивая шпателем в среде. Дайте экспланту скользнуть в камеру. С помощью пипетки объемом 100 микролитров извлеките 80 микролитров среды и выбросьте ее.
Проверьте видимость волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов под микроскопом. При необходимости используйте щипцы, чтобы раздвинуть перекрывающиеся ткани. Удалите оставшуюся среду из лунки.
Теперь эксплант будет лежать более плоской на поверхности камеры. Через 10 секунд пипеткой отожмите одну или две капли среды рядом с эксплантом, а оставшуюся среду на некотором расстоянии, чтобы избежать отслоения эксплантата. Следите за тем, чтобы эксплантаты не двигались во время добавления среды.
Инкубируйте камеру в течение двух часов, чтобы прочно прикрепить органы ко дну камеры. После инкубации среду следует аспирировать. И с помощью пипетки объемом 100 или 200 микролитров осторожно добавьте 300 микролитров свежей, предварительно подогретой полной среды.
Конфокальные микроскопические изображения вращающегося диска показали, что кортинские эксплантаты органов крыс сохраняли свою структуру и общую длину как в нормальных, так и в стрессовых условиях. Кроме того, сканирующий конфокальный микроскоп продемонстрировал сохранившиеся волосковые клетки эксплантов из органов мышей вместе с волосковыми клетками, подвергающимися апоптозу. Протокол позволил осуществлять мониторинг биологических процессоров в живых кохлеарных клетках с использованием соответствующих проницаемых для клеток зондов и конфокального микроскопа с вращающимся диском.
Культура этих кохлеарных эксплантов улучшает анализ взаимодействия между волосковыми клетками и спиральными ганглиозными клетками. Волосковые клетки кохлеарных имплантов были обнаружены с помощью маркера волосковых клеток MYO7A. Аналогичным образом, здоровые и поврежденные тела спиральных ганглиозных клеток и нейриты были идентифицированы с помощью нейронального маркера Tuj 1.
В увеличенном обзоре были видны клеточные тела волосковых клеток, помеченных антителами MYO7A. Были идентифицированы наружные стереоцилии волосковых клеток и деконволютированные изображения отдельных внутренних стереоцилий волосковых клеток, меченных фаллоидином. Необходимо соблюдать осторожность во время процедур под микроскопом, особенно при отделении спирального ганглия от костной спиральной пластинки.
Неповрежденные экспланты следует переносить и выравнивать с осторожностью. Этот протокол оптимизировал исследования in vitro на эксплантах внутреннего уха. Результаты этих исследований, такие как сигнальные пути и токсичность препарата, могут служить ориентиром для разработки дальнейших исследований in vivo.
