Изучение in Vitro и клеточной фторогенной кинетики аптамера позволяет пользователю оценить, являются ли взаимодействия аптамерных красителей достаточно быстрыми для изучения интересующего процесса в режиме реального времени. Представленные методы позволяют проводить количественные кинетические измерения как внутри, так и снаружи клетки, любой из которых может быть релевантным в зависимости от применения аптамера. Представленные способы могут быть применены к любой фторогенной РНК-системе, включая альтернативные аптамеры и биосенсоры на основе РНК для малых молекул.
Для начала настройте программу ренатурации РНК от термоциклера. Создайте программу, выбрав создать новую программу "добавить новую фазу" и добавить новый шаг"несколько раз, чтобы добавить шаги, специфичные для температуры, прежде чем нажать кнопку сохранить"Настроить дополнительные настройки в соответствии с программой. Чтобы реконструировать две РНК шпината и брокколи, подготовьте два микромолярных стебля каждой РНК в двойной дистиллированной воде в тонкостенной ПЦР-трубке объемом 0,5 миллилитра.
Затем добавьте равные объемы двух-х ренатурационного буфера, чтобы получить один микромолярный раствор РНК. Поместите трубки в термоциклер. Откройте сохраненную программу ренатурации и нажмите «Выполнить» Далее, настройте программу инжектора пластинчатого считывателя.
На считывателе флуоресцентной пластины выберите «температуру» и установите ее на 37 градусов цельсия. Прежде чем начать кинетику, убедитесь, что температура уравновешена до этого значения. Откройте программное обеспечение для чтения пластин.
Выберите настройки "затем просмотр захвата" для ввода программы для кинетических измерений, выберите петлю" для каждой скважины. Затем установите базовую настройку на 60 базовых считываний и интеллектуальные настройки впрыска для впрыска 10 микролитров. Установка флуоресценции считывает длину волны возбуждения до 448 нанометров, длину волны излучения до 506 нанометров и картридж до моно.
Установите общее время чтения равным 10 минутам с интервалом считывания 0,5 секунды. Установите PMT и оптику на шесть вспышек на считывание. Затем введите цикл в следующую скважину.
Для подготовки пластинчатого считывателя инжектора выберите инжектор "на пластинчатом считывателе" и подайте пластину для сбора отходов по указанию. Затем выберите «промывка» и очистите инъекционную трубку, следуя инструкциям на пластинчатом считывателе, с помощью одного миллилитра объемов двойной дистиллированной воды, 75% этанола, а затем дистиллированной воды. Затем выберите аспират», позволяющий инжектору выбрасывать лишнюю жидкость.
Затем выберите прайм», чтобы загрунтовать инжектор двумя 260 микролитрами по 100 микромоляров D F H B I.To выполнить один кинетический эксперимент, добавить 80 микролитров связывающей буферной мастер-смеси в одну лунку из 96 лунок чистой нижней пластины. Затем добавляют 10 микролитров ренатурированной РНК. Дайте пластине и раствору D F H B I в инжекторе, чтобы уравновесить до 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
Далее выберите скважину для анализа в настройках программного обеспечения под областью считывания. Затем на вкладке «Домой» выберите «Выполнить», чтобы выполнить программу кинетики, описанную выше. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все эксперименты не будут завершены.
После запуска промыть инжектор, чтобы удалить оставшийся раствор D F H B I из инъекционной трубки, как показано ранее. Для настройки экспериментальных файлов включите проточный цитометр и компьютер. Создайте новый файл на вкладке обозревателя экспериментов, щелкнув правой кнопкой мыши имя пользователя проточного цитометра.
Затем выберите новый эксперимент"в раскрывающемся окне и когда появится новое окно на экране компьютера, выберите тип эксперимента как трубки", а затем выберите OK"В новом файле эксперимента щелкните правой кнопкой мыши папку группы и выберите добавить новую пробу"Пометьте пробы для каждого конкретного момента времени и реплицируйте, щелкнув правой кнопкой мыши по образцу"и выбрав переименовать" в раскрывающемся меню. Далее готовят разбавленный клеточный раствор, добавляя 1,5 миллилитра одного X P B S и три микролитра индуцированных клеток в среде ИИ в культуральную трубку. Прежде чем добавлять краситель, измерьте фоновую флуоресценцию клеток, чтобы наблюдать, как складка включается с течением времени.
После добавления красителя поместите культуральную трубку, содержащую клетки p B S, в подъемник пробоотборника и поднимите лифтер к игле для инъекции образца. Затем выберите правильный файл образца на вкладке панели сбора и нажмите «Запись»После завершения запуска опустите подъемник пробоотборника с культуральной трубкой вручную. Инициировать этап промывки, промыть жидкостную систему и свести к минимуму перенос между каждым биологическим реплицированным образцом.
Чтобы перейти к следующему образцу, выберите следующий файл образца, щелкнув значок стрелки вправо рядом с именем пробы под значком записи. Для измерения флуоресценции клеток с красителем добавляют 1,4 микролитра концентрированного запаса красителя в один X P B S с клетками, чтобы получить конечную концентрацию 50 микромоляров D F H B I один T. Закрепите крышку культуральной трубки и переверните три-пять раз, чтобы равномерно перемешать раствор. Затем снимите крышку и поместите культуральную трубку в подъемник пробоотборника.
Подняв держатель к образцу инъекционной иглы, нажмите на значок «запись» под соответствующим файлом образца. Затем начинайте таймер нажатием кнопки start"In vitro кинетика фторогенных аптамеров шпината два и брокколи, отображающих двухфазную ассоциативную кинетику для связывания с красителем D F H B I. Для обоих аптамеров кинетические данные лучше соответствовали двухфазной ассоциации, чем однофазной при длительном времени измерения.
Кривая наилучшего соответствия определяла константы скорости и значения периода полураспада для быстрых и медленных ассоциаций. Шпинат два в состоянии связывающей компетенции, показали более быстрое включение, чем брокколи. Кинетика второй фазы для обоих аптамеров сходна и может соответствовать общей стадии ограничения скорости.
Кинетические кривые аптамеров состоят из аналогичной степени быстро ассоциирующихся РНК. Для клеток, экспрессирующих шпинат две Т-РНК, средняя интенсивность флуоресценции или M F I увеличивается сразу в нулевую точку времени. Кроме того, клеточная флуоресценция достигла своего максимального уравновешенного значения M F I в течение пяти минут.
Напротив, контрольные клетки показали низкую фоновую флуоресценцию и отсутствие изменений в значениях M F I с добавлением D M S O Представленные методы позволяют исследователям определить, как они могут быстрее создавать датчики на основе РНК во фторогенных аптамерах.
