Увековеченные клубочковые эндотелиальные клетки со стабильными флуоресцентными митохондриями являются отличным инструментом для изучения влияния различных раздражителей на структуру митохондрий in vitro. Описанный способ в настоящей статье дает большое количество клубочковых эндотелиальных клеток. Тестируя небольшие молекулы на GEC, мы могли бы провести скрининг для монотерапии диабетической болезни почек, где затронуты GEC.
Описанный способ прост в исполнении и не требует специального оборудования. Тем не менее, важно следовать описанным шагам и стерилизовать оборудование, чтобы избежать загрязнения. Для начала поместите перфузионные и изоляционные материалы, необходимые для изоляции клубочковых клеток почек, на рабочее пространство.
Отфильтруйте свежеприготовленный раствор сбалансированной соли Хэнкса, или HBSS, с помощью 0,2-микронного фильтра и держите его под капотом, чтобы избежать загрязнения. Затем смешайте 200 микролитров магнитных шариков с 20 миллилитрами HBSS. Предваряют RPMI с 10% FCS и питательной средой эндотелиальных клеток на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем предварительно обмазываем две лунки шестилуночной пластины двумя миллилитрами по 10 мкг на миллилитр коллагена IV в течение 45 минут при комнатной температуре. Дважды вымойте пластину PBS, чтобы удалить уксусную кислоту, используемую для разбавления коллагена. Немедленно используйте пластины с покрытием или храните их при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение четырех недель.
Очистите хирургические инструменты и рабочее пространство 70% этанолом. Впоследствии автоклавируют хирургические инструменты в течение 30 минут. После вскрытия брюшка анестезированной мыши вставьте иглу бабочки в левый желудочек.
Ввести 100 микролитров бисерного раствора для расширения кровообращения, аккуратно разбить нижнюю полую вену ниже почек иглой 19-го калибра и продолжить перфузию бисерного раствора. Далее аккуратно удаляют жировую ткань пинцетом, иссекают обе почки тонкими хирургическими ножницами С, и кладут их на тарелку с одним миллилитром HBSS на льду. Измельчите почку стерильным скальпелем на одномиллиметровые мелкие кусочки.
Инкубировать измельченную почку одним миллиметром свежеприготовленной коллагеназы типа II в течение 35 минут при 37 градусах Цельсия с легким наклоном на горизонтальном шейкере. После пищеварения добавьте четыре миллилитра RPMI с 10% FBS для нейтрализации коллагеназы. Отфильтруйте переваренную ткань через стерильный 100-микронный клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку.
Используйте дно стерильной 1,5-миллилитровой трубки, чтобы перемешать переваренную ткань против ситечка, позволяя клубочкам пройти. Промыть клеточный ситечко 15 миллилитрами HBSS. Затем центрифугируйте проточную обработку при 200 XG в течение пяти минут при комнатной температуре.
На этом этапе трубка содержит три слоя. Верхний слой содержит более мелкие структуры, такие как канальцы, средний слой представляет собой бусины с клубочками, а нижний слой содержит мусор. Тщательно аспирируйте супернатант и верхний белый слой.
Затем повторно суспендируют гранулы, содержащие шарики, несущие клубочки и мусор в 1,5 миллилитрах HBSS, и переложите его в двухмиллилитровую трубку. Поместите трубку в магнитный концентратор и аспирируйте супернатант перед тем, как дважды промыть шарики одним миллилитром HBSS. Поместите 20 микролитров клеточной суспензии на слайд.
Затем понаблюдайте за скольжением под микроскопом на предмет присутствия клубочков. Затем повторно суспендируют гранулу в среде роста эндотелиальных клеток и перенесут суспензию в двухмиллилитровую трубку. Добавьте один микролитр интерферона гамма на каждые три миллилитра среды и поместите клетки в шестилуночную пластину для инкубации при 33 градусах Цельсия.
После трех дней посева тщательно замените одну миллилитровую среду свежей средой. На этой стадии клетки неоднородны со смесью клубочковых клеток. Через семь дней замените среду двумя миллилитрами свежей среды роста эндотелиальных клеток, дополненной интерфероном гамма, чтобы начать пролиферацию клеток.
Через 10 дней, когда клетки достигнут 80% сливаемости, проходят их с помощью трипсина и переносят в колбу Т-25, покрытую коллагеном IV.После 21 дня культивирования переложите клетки в колбу Т-75. Добавьте три миллилитра 0,25% трипсина в колбу Т-75 и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем нейтрализуют трипсин тремя миллилитрами эндотелиальной питательной среды и перенесут суспензию в 15-миллилитровую трубку для центрифугирования при 200 ХГ в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант и промыть клетки в одном миллилитре PBS, содержащем 1%BSA, двухмиллимолярный ЭДТА, 1% пенициллин/стрептомицин. Опять же, центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах шариков с покрытием антител CD31 и 800 микролитрах PBS. Инкубируйте клетки в течение 45 минут с непрерывным встряхиванием при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Затем поместите трубку в магнитный концентратор и промойте клетки четыре раза PBS, содержащим BSA, EDTA и пенициллин / стрептомицин. После последней промывки повторно суспендируют клетки в трех миллилитрах эндотелиальной питательной среды, дополненной интерфероном гамма. Пластина 1,5 миллилитра клеток на лунку в коллагеновых IV покрытых лунках на шестилуночной пластине и культурируется в разрешительных условиях при 33 градусах Цельсия.
Через четыре дня заменить 750 микролитров среды свежей эндотелиальной питательной средой, дополненной интерфероном гамма. После 10-14 дней культивирования, используя эпифлуоресцентный микроскоп с 488-нанометровым фильтром, наблюдайте за ростом CD31 положительных клубочковых эндотелиальных клеток, или GEC, колоний, которые экспрессируют флуоресцентные митохондрии. Через 21 день или когда клетки достигнут слияния от 80 до 90%, переместите их в колбу Т-25.
Поддерживайте культуру с помощью среды роста RPMI, содержащей 10% FCS. Альтернативно, клетки могут быть криоконсервированы. Прохождение клеток с использованием трипсина, как показано ранее.
Затем центрифугируют клетки и повторно суспендируют гранулу в трех миллилитрах морозильной среды. Аликвотируют ячейки в криотрубки и хранят их в жидком азоте, температуре паров. Этот протокол описывал метод выделения клубочковых эндотелиальных клеток.
Из изолированных клубочков клетки начали медленно расти после трех дней культивирования. Через семь дней клетки казались гетерогенными и показывали другие типы клубочковых клеток, такие как подоциты, теменные, эпителиальные и мезангиальные клетки. После достижения слияния от 70 до 80% другие клубочковые клетки удалялись с помощью положительного отбора эндотелиальных клеток.
MitoDendra2 GECs экспрессировали CD31 и были отрицательными для маркера подоцитов, о чем свидетельствует отрицательное окрашивание синаптоподина. Изучено влияние концентрации глюкозы на структуру митохондрий. По сравнению с удлиненными митохондриями, видимыми в клетках при нормальной глюкозе, высокая глюкоза индуцировала фрагментацию или деление митохондрий, наблюдаемую выдающимися сфероидными митохондриями.
Кроме того, 405-нанометровый лазер был использован для фотоконверсии выбранной субпопуляции митохондрий в одном живом MitoDendra2 GEC. Показана успешная фотопереключение митохондрий с зеленого на красный в выбранной области для нормальных и высокой концентрации глюкозы обработанных клеток. Это переключение позволило наблюдать за событиями слияния в MitoDendra2 GEC.
При нормальной глюкозе наблюдалась желтая слитая зеленая и красная флуоресценция из-за слияния матриц митохондрий. Напротив, в ГЭС с высоким содержанием глюкозы митохондрии были в основном фрагментированы. Размещение ячеек в одной лунке из шести лунок с небольшим объемом питательной среды имеет важное значение для того, чтобы ячейки прикреплялись к тарелке.
Изолированные эндотелиальные клетки могут быть использованы для выполнения митохондриальной функции и структурных исследований. Использование увековеченных эндотелиальных клеток с флуоресцентными особенностями митохондрий проложит путь к открытию лекарств. Небольшие молекулы могут быть протестированы на клетках, и выполняется живая визуализация для изучения их влияния на функцию митохондрий.
