Эта модель стимулирует биомеханические раздражители, испытываемые гладкомышечными клетками в аорте человека. В сочетании с клетками, полученными от пациентов, эта система может быть использована для скрининга лекарств и персонализированной медицины заболеваний аорты. Эта модель может имитировать и точно контролировать голые механические параметры гладкомышечных клеток в аорте человека, что обеспечивает новую платформу in vitro для изучения и патогенеза заболеваний аорты.
Продемонстрировать процедуру будет Миерадилицзян Абудубат, врач-плакат из нашей лаборатории. Начните с промывания правой боковой области восходящей аорты стерильными pbs, один или два раза. Удалите слои интимы и адвентиции ткани двумя офтальмологическими щипцами и сохраните слой среды для сбора клеток.
Поместите слой носителя на 10-сантиметровую посуду и разрежьте ее на две-три миллиметровые части. Затем добавьте пять миллилитров SMCM, содержащих 10% fbs и 1% пенициллина стрептомицина, к образцам тканей. Переместите мелкую ткань во флакон для культивирования стерильной капельницей, равномерно распределив ткань.
Выбросьте питательную среду как можно больше. Затем переверните бутылку вверх ногами. Добавьте два миллилитра SMCM в перевернутую бутылку для культивирования и поместите его в инкубатор с 5% углекислым газом при 37 градусах Цельсия в течение одного-двух часов.
Затем медленно поверните его правой стороной вверх и добавьте еще два миллилитра SMCM. После пяти-семи дней инкубации замените SMCM четырьмя миллилитрами свежего SMCM. Медленно отбрасывайте и добавляйте SMCM при смене среды.
Как правило, спорадические гладкомышечные клетки вылезают примерно через две недели. Осторожно транспортируйте бутылку с культурой при перемещении к микроскопической станции. В противном случае ткани будут плавать, и клетки будут расти медленно.
Когда клетки вырастут, разделите их на две новые бутылочки культуры с четырьмя миллилитрами свежего SMCM. Идентификация клеток с помощью иммунофлуоресцентного анализа четырех специфических маркеров гладкомышечных клеток. Для полимеризации PDMS добавляют отверждающий агент или компонент B к основанию или компоненту A и перемешивают комплекс в течение пяти минут.
Объем будет зависеть от необходимости исследования. Поместите приготовленный гель PDMS в вакуумный экстракционный резервуар на 30-60 минут и поддерживайте давление ниже отрицательных 0,8 миллипаскалей. Используя программное обеспечение для автоматизированного проектирования, разработайте пресс-форму.
Изготовленные на заказ формы из трех слоев с помощью высокоточной компьютерной гравировальной машины с числовым программным управлением. После вырезания каркаса пресс-форм и микроканалов с помощью плит из ПММА приклейте их на другую пластину. Вылейте приготовленный гель PDMS на разработанную форму.
Затем перекрестное соединение при 70 градусах Цельсия в течение одного-двух часов. Снимите сшитые плиты PDMS от формы и разрежьте коммерческие мембраны PDMS на участки размером 100 на 40 миллиметров. Пробивайте отверстия на трех плитах PDM с помощью перфоратора с одним миллиметровым отверстием для создания входных и выходных каналов воздуха и средних микроканалов на чипе PDMS.
Обработайте три подготовленные плиты PDMS и две мембраны PDMS кислородной плазмой в течение пяти минут для активации поверхности PDMs. Установите воздух в помещении для обработки газа, давление до отрицательных 100 килопаскалей, ток до 180-200 миллиампер пирсов, напряжение до 200 вольт, а время обработки до пяти минут. Соедините три плиты PDMS и две мембраны PDMS вместе под стереоскопическим микроскопом, так что верхний слой состоит из плиты воздушного канала PDMS, а затем мембраны PDMS.
Средний канал состоит из плиты PDMS, затем мембраны PDMs, а нижний слой представляет собой плиту PDMS воздушного канала. Поместите собранный чип PDMS в инкубатор с температурой 70 градусов Цельсия на один час. Подготовьте несколько латексных шлангов внутреннего диаметра в один миллиметр и длиной три сантиметра.
Вставьте один миллиметр наружного диаметра и одну сантиметровую иглу из нержавеющей стали в один конец подготовленного шланга. Затем вставьте приманку в другой конец шланга, чтобы создать трубку, соединенную с воздушными и средними микроканалами чипа PDMS. Вставьте подготовленные трубки в выпускные и входные отверстия воздушных и средних микроканалов на чипе PDMS.
Вливайте два миллилитра по 80 миллиграммов на миллилитр мышиного коллагена в средний микроканал чипа PDM, используя шприц из двух миллилитров, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации извлеките коллаген из канала с помощью двухмиллилитрового шприца. Поместите коллагеновые чипы PDMS в инкубатор с температурой 60 градусов Цельсия на ночь.
Поместите чипы PDMS в УФ-стерилизатор более чем на один час. Поместите стерилизованные чипы PDMS на сверхчистый стенд для подготовки к эксперименту с клетками. Культивируйте четыре раза от 10 до пяти первичных гладкомышечных клеток аорты человека от пациентов, использующих SMCM, содержащий 2% FBS и 1% пенициллина стрептомицина в инкубаторе с 5% углекислым газом, установленном при 37 градусах Цельсия.
Когда плотность гладкомышечных клеток достигнет 80%, откажитесь от SMCM, и промыте клетки двумя миллилитрами PPS. Переваривайте клетки, используя один миллилитр 0,25% трипсина в течение двух минут и центрифугу при 100 RCF в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в одном миллилитре свежего SMCM.
Используйте восемь миллилитров SMCM для культивирования клеток на 10-сантиметровой чашке для культивирования. С помощью цитометра рассчитайте число клеток и приступайте к конечной концентрации от двух раз 10 до пяти клеток на миллилитр. Медленно налейте два миллилитра PBS в коллаген, закодированный и стерилизованный чип PDMS среднего микроканала, а затем выбросьте с помощью двухмиллилитрового шприца.
Медленно влейте два миллилитра в два раза по 10 до пяти ячеек на миллилитр гладкомышечной суспензии в микроканал среды чипа PDMS. Затем закройте приманку на входе и выходе чипа PDMS. Поместите чип PDMS в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа в течение одного дня.
После инкубации, когда клетки прикреплены к мембране PDMS в чипе PDMS, подключите выходное отверстие воздушного микроканала на чипе PDMS к системе управления вакуумом. Удлиненная нормальная клеточная форма будет видна под микроскопом, когда клетка прикреплена. Контраст с взвешенными круглыми клетками.
Включите электромагнитный клапан и вакуумный насос. Откройте вакуумный регулятор и отрегулируйте уровень давления в зависимости от деформаций. Затем поместите чипы PDMS и инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислым газом в течение 24 часов.
Подготовьте несколько электромагнитных клапанов, вакуумные фильтры, вакуумные регуляторы, вакуумный насос, перистальтический насос и ПЛК, управляющий электромагнитным клапаном. Запрограммируйте контроллер ПЛК и установите интервал времени включения на один герц. Подключите электромагнитные клапаны к программируемому контроллеру.
Подключите входное отверстие вакуумного насоса к вакуумным фильтрам, а затем подключите выходное отверстие вакуумных фильтров к вакуумным регуляторам. Подключите выходное отверстие вакуумных регуляторов к электромагнитным клапанам. И, наконец, подключите выходное отверстие электромагнитных клапанов к выходам воздушных микроканалов чипов PDMS.
Подключите выходное отверстие перистальтического насоса к входу среднего микроканала микроканала чипа PDMS и входное отверстие перистальтического насоса к выходу среднего микроканального чипа PDMS для замены питательной среды и обработки лекарственного средства. Отрегулируйте амплитуду деформации регулятором и частоту деформации микроконтроллером. Жизнеспособность клеточной линии гладкой мускулатуры аорты человека, CRL 1990, в чипе PDMS, была оценена с использованием живого и мертвого анализа на третий и пятый день клеточной культуры.
Жизнеспособность клеток была обнаружена выше 90% на третий и пятый день. Окрашивание цитоскелетом F-актина CRL 1990 в чипе PDMS показало нормальную морфологию клеток и клетки, выровненные перпендикулярно штамму после растяжения в течение 24 часов. Иммунофлуоресценция сократительных маркеров SM22 и CNN1 была выше в условиях деформации по сравнению со статическими условиями.
Кроме того, гены SM22 и CNN1 регулировались в условиях деформации гладкомышечных клеток. Окрашивание F-актином BAV и TAV, аневризма грудной аорты и расслоение первичных гладкомышечных клеток аорты человека, полученных пациентом, показали нормальную морфологию клеток и клетки, выровненные перпендикулярно направлению деформации после растяжения в течение 24 часов. Флуоресценция SM22 и CNN1 при аневризме и расслоении грудной аорты BAVTAAD и TAV была выше в условиях деформации, чем в статических условиях.
Аналогично уровням экспрессии генов SM22 и CNN1, которые также регулировались в условиях штамма по сравнению со статическими условиями. Следует обратить внимание на принцип стерильности при выделении первичного HASMC. После того, как лаборатории PDMS и мембраны обработаны плазмой, поверхности не должны быть загрязнены.
Основываясь на этом протоколе, эндотелиальные клетки могут быть совместно культивированы с гладкомышечными клетками, и явный стресс может быть дан клеткам с циклическим напряжением для дальнейшего моделирования большего количества механических сил.
