Структурная информация о том, как ферменты эксцизионной репарации оснований удаляют повреждения ДНК в контексте хроматина, была скудной. Это представляет собой значительный пробел в нашем понимании механизмов, участвующих в этиологии заболеваний человека. Основным преимуществом нашего протокола является то, что мы оптимизировали пробоподготовку с использованием стандартного лабораторного оборудования.
Это позволит другим биохимикам в этой области дополнить свою биохимическую работу технически осуществимыми крио-ЭМ-исследованиями. Наш протокол также может быть использован для исследования того, как другие факторы, в том числе пионерные факторы транскрипции, взаимодействуют с нуклеосомой. Это область, где структурная информация также была ограничена.
Оптимизация пробоподготовки перед переходом к условиям замораживания была ключом к продвижению нашего проекта, и это лучше всего делать с помощью стандартных биохимических анализов в дизайне субстрата, условиях связывания и сшивания. Для начала инкубируйте NCP и интересующий фактор репарации ДНК на льду в течение 15 минут, используя оптимальный буфер для конкретного комплекса. Затем добавьте глутаровый альдегид до конечной концентрации 0,005%Хорошо перемешав, инкубируйте при комнатной температуре в течение 13 минут.
Гасить одним молярным Tris-CL до конечной концентрации 20 миллимолярных Tris-CL с pH 7,5. Затем сконцентрируйте примерно до 50 микролитров и замените буфер на замораживающий буфер с помощью обессоливающей колонны. Затем определите поглощение при оптической плотности 280 и 260 нанометров и при необходимости сконцентрируйтесь дальше, чтобы достичь от 1,3 до 3 миллиграммов на миллилитр на основе оптической плотности 280 нанометров.
После подготовки кнопки диализа поместите кнопку, содержащую образец, на верхнюю часть слоя полиэтиленгликоля мембраной вниз. Чтобы выполнить очистку с помощью эксклюзионной хроматографии, промойте и уравновесьте колонну исключения 60 миллилитрами дистиллированной воды, а затем 80 миллилитрами замораживающего буфера в течение ночи со скоростью 0,4 миллилитра в минуту. Затем немедленно проанализируйте пиковые фракции и сконцентрируйте те фракции, которые содержат инфузионный белок гистона MBP-PolBeta-APE1.
Следующие процедуры продемонстрирует Элизабет Виверетт, стажер после получения степени бакалавра из крио-ЭМ-ядра здесь, в NIH. Включив погружную морозильную камеру и наполнив увлажнитель 50 миллилитрами дистиллированной воды, установите температуру камеры на 22 градуса Цельсия и влажность на 98%Затем поместите чашку этана и чашку с жидким азотом в соответствующие держатели. После этого накройте этановую чашку дозатором этановой крышки и осторожно полейте ее жидким азотом, а также наполните азотную чашку жидким азотом.
Когда уровень жидкого азота стабилизируется и достигнет 100%, а температура достигнет минус 180 градусов по Цельсию, осторожно откройте этановый клапан и наполните этановую чашку до образования пузырьков на прозрачной крышке. Затем снимите дозатор этана. Поместите две фильтровальные бумаги на промокательное устройство и закрепите их металлическим кольцом.
Перейдите к настройке и установите параметры блоттинга, как описано в рукописи, затем выберите A-Plunge и нажмите OK. На главном экране нажмите «Загрузить щипцы» и загрузите их сеткой стороной углеродного нанесения, обращенной влево. Откалибруйте щипцы, отрегулировав ось Z, чтобы обеспечить сплошное пятно. Нажмите на Нижнюю камеру и нанесите три микролитра комплекса.
Затем нажмите на Blot A-Plunge, который повернет сетку для промокания спереди и погрузит-заморозит ее. После переноса храните решетку в сетчатой коробке в камере жидкого азота. Когда все четыре решетки замерзнут и помещены в решетку, поверните крышку в нейтральное положение, где все решетки будут закрыты крышкой, и затяните винт.
Перед загрузкой образцов в микроскоп поместите остекленные сетки на кольцо и закрепите его с помощью C-образного зажима под жидким азотом в помещении с контролируемой влажностью, чтобы избежать загрязнения льдом. При загрузке микроскопа вставьте сетки в кассету с 12 слотами. Перетасуйте кассету в капсулу nanocab и загрузите ее в автомат заряжания.
Затем перенесите сетку с кассеты на столик микроскопа. Отрегулируйте ступень на эуцентрическую высоту, раскачивая сцену на 10 градусов и одновременно перемещая высоту по оси Z до тех пор, пока на изображениях не будет наблюдаться минимальный плоский сдвиг. Как только эуцентрическая высота будет достигнута, начните визуализацию, сделав монтажное изображение сетки размером 3 на 3, в котором каждый монтаж делается с 62-кратным увеличением, чтобы получить атлас.
Выбрав три квадрата разного размера и взяв эуцентрическую высоту, изображение с 210-кратным увеличением. После того, как квадрат изображен, выберите по одному отверстию от края, центра и между ними внутри квадратов. Затем сфотографируйте каждое отверстие с увеличением 2 600 раз.
Сделайте изображение с большим увеличением от центра отверстия с увеличением 36 000 раз и временем экспозиции 7,1 секунды, 60 кадрами, размером пикселя 1,18 и расфокусировкой на три микрометра. Смотрите репрезентативные изображения скрининга. Для определения отношения NCP к MBP-PolBeta-APE1 с образованием стабильного комплекса были проведены электрофоретические анализы сдвига подвижности, которые показали единично смещенную полосу NCP с пятикратным молярным избытком MBP-PolBeta-APE1.
В меньшем объеме сборка комплекса NCP-PolBeta-APE1 показала, что образец был чрезмерно сшит и привел к агрегатам без различимых отдельных комплексов. Однако десятикратное разбавление в NCP привело к значительному снижению агрегации и улучшению стабильности частиц. Препараты гель и методы исключения размера могут быть объединены в тех случаях, когда препаративный гель улучшает качество НКП, когда они содержат значительное количество высокомолекулярных агрегатов, с последующей очисткой комплекса путем исключения по размеру.
Результаты показывают, что оба метода могут быть использованы независимо друг от друга для генерации устойчивых комплексов. Кроме того, данные, собранные из обеих сеток, показывают почти идентичные двумерные классы и трехмерные карты с разрешением примерно 3,2 ангстрема. Сначала следует определить оптимальное соотношение NCP к фактору репарации ДНК, затем провести сшивание комплекса глутаровым альдегидом, по крайней мере, в 10 раз более разбавленное, чем концентрация, необходимая для замораживания.
После получения крио-ЭМ 3D-карты комплекса потребуется дальнейшее структурное уточнение, чтобы определить, как находится фактор репарации ДНК, и определить, какие области важны для этих взаимодействий.
