Спектрометрическая визуализация Maldi MS является признанным и полезным инструментом для идентификации и визуализации обилия и распределения липидов без чрезмерной модификации образца. Основным преимуществом визуализации Maldi является ее способность обнаруживать липиды in situ без маркировки и одновременно анализировать большую популяцию образцов. Практика - путь к совершенству.
Убедитесь, что вы хорошо потренировались, прежде чем обрабатывать реальные экспериментальные образцы. Минимизируйте время подготовки образца и избегайте загрязнения на протяжении всей процедуры. Для начала добавьте оптимальную температуру резания или OCT в пластик криомоль до половины глубины криоформы, избегая при этом образования пузырьков.
Оставьте форму на ровной поверхности на несколько минут, а затем переложите ее на сухой лед. Держите криомольд плоским на сухом льду и позвольте ОКТ сформировать плоскую и ровную поверхность. Подождите, пока OCT полностью затвердеет в пресс-форме.
Немедленно используйте замороженные стадии OCT или храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После обезболивания взрослых мух с помощью углекислого газа приготовьте чашку Петри, содержащую кусочек лабораторной салфетки. Используйте воду для увлажнения части салфетки, чтобы уменьшить статическое электричество.
Держите салфетку наполовину влажной и наполовину сухой. После разрезания головки мухи под рассекающим прицелом один, соберите четыре-пять головок и положите их на сухую область лабораторной салфетки. Пройдите стадию OCT от сухого льда до микроскопа два.
Немедленно перенесите головки на стадию OCT и быстро расположите их, что занимает от 30 до 60 секунд, чтобы избежать плавления OCT. Оставьте около одного миллиметра пустого пространства вокруг каждого мозга мухи, чтобы обеспечить адекватную поддержку со стороны OCT, и от четырех до пяти миллиметров пустого пространства от края блока, чтобы обеспечить достаточное пространство для обработки секции. Поместите стадию OCT обратно на сухой лед и дайте ей оставаться включенной в течение примерно трех минут, чтобы убедиться, что стадия OCT остается замороженной и твердой.
После того, как все головки мух выровнены, дайте этапу OCT посидеть на сухом льду еще пять-10 минут. Перенесите стадию OCT из сухого льда на плоскую поверхность, а затем быстро добавьте большое количество соединения OCT, чтобы покрыть все образцы и заполнить весь криомольд, что занимает около трех секунд. Немедленно перенесите криомольд обратно на сухой лед и заморозьте весь блок OCT, содержащий внедренные ткани.
Оставьте стадию OCT на сухом льду еще пять-10 минут. Маркируйте образцы на краю криомольда и храните замороженные образцы при температуре минус 80 градусов цельсия до готовности к разделению. Подтвердите закодированную сторону ITO, проверив проводимость слайдов ITO с помощью вольтметра, установленного на сопротивление.
Отметьте сторону с измерением сопротивления как сторону, к которой нужно прилипнуть к ткани. Нанесите метку и всегда устанавливайте лабораторную салфетку на нижнюю часть слайда, чтобы избежать загрязнения слайда. Затем дайте тканям уравновеситься в криостатной камере в течение 30-45 минут.
Очистите криостат, желательно с 70% этанолом. Протрите рулонную пластину в стадии и удалите использованные лезвия. Используйте дополнительные чистые салфетки, чтобы убедиться, что этанол испарился и что все поверхности высохли до начала секционирования.
Затем отрегулируйте температуру головки образца песка криостатной камеры в соответствии с типом ткани. Установите ткань на держатель образца с помощью OCT. Будьте осторожны, чтобы использовать достаточное количество OCT, чтобы покрыть основание блока OCT и установить блок как можно более плоским.
Поместите чистое лезвие на сцену и зафиксируйте его. Расположите головку образца по направлению к ступени по мере необходимости для достижения желаемого угла резания. Затем начинайте резку толстыми участками до тех пор, пока не будет найдена интересующая область.
Постоянно смахивайте лишние части предварительно охлажденной кистью артиста, чтобы сохранить сцену в чистоте. Отрегулируйте температуру камеры немного по мере необходимости и измените толщину секций до 10-12 микрометров, как только будет достигнута желаемая область. Тщательно соберите нужный раздел.
Возьмите слайд ITO комнатной температуры и расположите его над секцией. Подойдите к секции осторожно и приклейте ее к слайду, не оставляя следов на стадии криостата. Поместите слайд в сторону в стойку или лабораторную протирайте вне криостата между коллекциями нескольких секций.
Если требуется сравнение между различными образцами одной и той же когорты, поместите секции из нескольких образцов на один слайд, чтобы их можно было анализировать одновременно, чтобы свести к минимуму вариации. При необходимости разделььте два слайда, так как держатель мишени Maldi может вместить две горки за один прогон. Транспортируйте слайды в вакуумной коробке в осушитель с осушением в качестве нижнего слоя.
Проведите слайды под вакуумом в течение 30-60 минут, затем приступайте к матричному осаждению. Используйте две пятидигидроксибензойной кислоты, или DHB, в метанольной воде в качестве матрицы. Поместите слайды в транспортер для слайдов и надежно закройте отверстие восковой пленкой.
Запечатайте пакетом-молнией. Поместите его в другой пакет-молнию, содержащий влагопоглотители. Маркировка снаружи и отправка образца на основные объекты Maldi с достаточным количеством сухих глаз.
Для матричного осаждения используйте 40 миллиграммов на миллилитр воды DHB и метанола в качестве матрицы и распыляйте ее с помощью автоматического матричного опрыскивателя HTX M5. Используйте давление газообразного азота 10 фунтов на квадратный дюйм. Используйте время полета Мальди, прибор MS и режим положительных ионов для получения масс-спектра.
Откалибруйте прибор, обнаружив 0,5 микролитра эмульсии красного фосфора в ацето-нитро на слайдах ITO. Используйте его спектры для калибровки прибора в диапазоне масс от 100 до 1000 МЗ, применяя квадратичную калибровочную кривую. Установите диаметры лазерных пятен на средние, так как это модулированный профиль луча для ширины растра 40 микрометров, и соберите данные изображения, суммируя 500 снимков с частотой повторения лазера 1000 герц на позицию массива.
Затем запишите спектральные данные. Выполните анализ данных визуализации с использованием среднеквадратичной нормализации для генерации ионных изображений с пропускной способностью плюс минус 0,10 Дальтона. Выровняйте спектры как OCT, так и мозговой ткани из одного и того же эксперимента, используя программное обеспечение для оценки перекрывающихся пиков в интерференции подавления ионов OCT.
Наконец, обработайте слайды MALDI, содержащие образцы тканей, гематоксилином и эозином или окрашиванием H и E. Изображения из анализа Maldi MS показали общее снижение содержания липидов в нокаутированном мутантном мозге LPR1. Здесь показаны репрезентативные H и E окрашенные участки мозга взрослой мухи.
На этом изображении также указаны липидные виды, их соответствующие значения MZ и масштабы тепловой карты. Средняя величина сокращения нокаутирующего мутанта LPR1 по сравнению с контрольной группой по крайней мере четырех биологических реплик показана в виде чисел рядом со стрелками. Массовый спектр выбранной пустой области ОКТ в области мозговой ткани как от контрольных, так и от мутантных мух показан в диапазоне от MZ1 до 1000 и MZ520 до 900.
Интерференция OCT связана как с явлениями подавления ионов, так и с проблемами перекрывающегося сигнала. Для поддержания точности данных о липидомике решающее значение имеют соответствующая пробоподготовка, рассечение и криосекция. После выполнения эксперимента Мальди идентичность липидов может быть проверена с помощью LCMS, также известной как жидкостная хроматография, липодомика на основе масс-спектрометрии.
Этот метод дает молекулярное представление о гомеостазе липидов головного мозга, используя мощную и мягкую модельную систему, которая прокладывает путь к пониманию метаболических изменений в мозге, связанных с заболеваниями человека.
