Клетки нервного гребня эмигрируют из черепных нервных складок в эмбрионах или при помещении в культуру. Это обеспечивает удобный метод выделения первичных мигрирующих клеток нервного гребня без диссоциации клеток. В то время как миграция нейронного гребня обычно происходит в трехмерной эмбриональной среде, двумерная культура позволяет визуализировать и исследовать процессы, связанные с миграцией.
Хотя существуют протоколы культивирования черепных нервных складок, этот метод требует обучения и специфических для организма шагов. Это видео демонстрирует методы, облегчающие воспроизводимую подготовку культур черепно-мозговых складок цыплят. Новички часто борются с препарированием и покрытием нейронных складок и оценкой результатов культуры.
Следование рекомендациям по вскрытию и применение морфометрического анализа, описанного здесь, позволяет получить последовательные, количественные результаты. Для начала поместите оплодотворенные яйцеклетки в вертикальное положение внутри увлажненного инкубатора при температуре 38 градусов по Цельсию. После извлечения яиц из инкубатора дезинфицируйте скорлупу, тщательно распыляя 70% этанола и давая им высохнуть.
Для фиксации и окрашивания культур используют стеклянные крышки, помещенные в многоскважинную посуду для культивирования тканей, и пипетку достаточно раствора фибронектина, чтобы покрыть дно колодца. Затем замените крышку и инкубируйте пластину раствором фибронектина в увлажненном инкубаторе при температуре 38 градусов Цельсия в течение не менее одного часа, рассекая нервные складки. Используйте тупые щипцы, чтобы проткнуть небольшое отверстие в скорлупе на 1/4-1/3 длины яйца.
Осторожно вставьте тупые щипцы в небольшое отверстие, чтобы не нарушить работу желтка. Затем разрежьте яичную скорлупу вокруг яйца, удалите верхнюю часть яичной скорлупы и поместите эмбрион для выделения. Подготовьте эмбрион, осторожно используя плоский край закрытых тупых щипцов, чтобы вытереть избыток альбумина на поверхности желтка, покрывающего эмбрион.
Используйте щипцы, чтобы поместить опорную рамку из фильтровальной бумаги поверх эмбриона, а эмбрион находится в окне рамки. Осторожно надавите на фильтровальную бумагу, чтобы прилипнуть к желтку. Вырежьте вокруг внешней стороны рамки фильтровальной бумаги ножницами для рассечения.
Используйте щипцы или кончики ножниц, чтобы схватить край рамки, и осторожно поднимите эмбрион от желтка. Поместите эмбрион с бумажной рамкой вниз в 60 или 100-миллилитровую чашку Петри, наполненную рингером со стрептококком. Держите чашку эмбрионов на льду, если собираете их для РНК или белково-чувствительного последующего применения.
Перенесите эмбрион в чистую посуду, содержащую раствор Рингера со стрептококковым раствором. Осторожно смахните эмбрион взад и вперед, чтобы очистить любой желток, который скрывает вид, и замените раствор стрептококка Рингера или перенесите его в свежую посуду, если она станет мутной. Расположите дорсальную и рамочную сторону эмбриона вверх под рассекающим микроскопом.
Оставьте эмбрион на бумажной рамке, чтобы он был растянут и удерживался на месте. Затем удалите вителлиновую мембрану, используя щипцы, чтобы обнажить нервные складки. Включите тканевый каудальный к расширяющимся зрительным пузырькам и ростральный к заднему мозгу, где ромбомерные сужения только начинают появляться.
С помощью пружинных ножниц тщательно иссейте средние мозговые складки. Позаботьтесь о том, чтобы иссечь спинной аспект нервной складки с минимальным загрязнением нервной трубки и ненейронной эктодермы, и перенесите нервные складки в чистую посуду, содержащую раствор Рингера из стрептококкового пера, используя пипетку P20 или стерильную стеклянную пипетку Пастера, промытую раствором стрептококкового пера Желтка Рингера. Храните собранные складки на льду при вскрытии дополнительных складок.
После извлечения чашки для культуры из инкубатора используйте пипетку или пипетку Пастера, чтобы удалить раствор фибронектина из крышки, тарелки или колодца. После промывки субстрата, покрытого фибронектином, раствором Рингера со стрептококковым раствором, добавьте соответствующий объем полной культуральной среды в блюдо или колодец. Чтобы заблокировать пластик и предотвратить прилипание ткани, используйте пипеттор P20 или P200 и промойте кончик пипетки раствором желточного рингера.
Затем переместите изолированные нервные складки к центру покрытого фибронектином покровного скольжения, позаботившись о том, чтобы перенести как можно меньше раствора Рингера с ручкой и стрептококком. После того, как экспланты осядут в течение 10-15 минут, поместите их в увлажненную камеру при температуре 38 градусов цельсия, медленно и осторожно перенося культуральную посуду с покрытыми нервными складками. Удалите питательные среды пипеткой Пастера и промойте колодцы стерилизованным фильтром PBS.
Добавьте 4% параформальдегида и держите его на платформе шейкера в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации удалите параформальдегид, трижды промойте лунки PBS и добавьте PBST, содержащий 5% сыворотки. Теперь пипетка 30 микролитров 200-наномоляра Oregon Green конъюгировала фаллоидин на гладкую поверхность для каждого скольжения крышки.
Используя пару щипцов, снимите крышку с PBST, содержащей 5% сыворотки, обеспечив ориентацию клеток вверх. Отведите лишнюю жидкость, ненадолго коснувшись края скольжения крышки к деликатному стеклоочистителю. Аккуратно поместите каждую скользящую клетку крышки вниз на каплю разбавленного фаллоидина и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
После инкубационного периода снимите крышку с окрашивающего раствора и поместите ее обратно в чашку для культивирования, перевернув ее так, чтобы сторона клетки была поднята. Убедитесь, что крышка покрыта PBST и поместите ее на шейкер платформы на 10 минут, сохраняя крышку закрытой и в темноте. Удалите PBST и повторите стирку крышки дважды, в общей сложности три 10-минутные стирки.
Поместите одну каплю монтажного носителя на предметное стекло микроскопа. Установите скользящую ячейку крышки стороной вниз, медленно опуская проскальзывание крышки под углом на монтажный носитель, чтобы избежать образования пузырьков и позволить носителю установиться перед съемкой. Наконец, создайте изображение окрашенных ячеек и экспортируйте их в виде файлов TIFF.
Клетки нервного гребня начали выходить из адгезивных эксплантов нервной складки в течение трех-четырех часов после инкубации, и миграция была завершена примерно через 20 часов. Мигрирующие клетки нервного гребня были помечены с использованием HNK-1, и большинство клеток оказались HNK-1 положительными. Мигрировавшие клетки нервного гребня были визуализированы путем окрашивания нитевидного актина фаллоидином.
Изображения клеток, окрашенных фаллоидином, были обработаны с использованием ImageJ для получения порогового изображения, в котором клетки казались черными с белым фоном. Пороговое изображение было проанализировано и различные измерения отображены в контрастных гистограммах или скрипичных графиках. Например, средняя площадь 69 проанализированных клеток составляла примерно 802,11 квадратных микрометра, в диапазоне от 60,27 до 2 664,53 квадратных микрометров.
Циркулярность отражает протрузивность клетки и колеблется от 0,101 до 0,875. Нижние значения указывают на вытянутую форму, в то время как значение единицы указывает на идеальный круг. Большинство клеток демонстрировали вытянутую форму, которую легче всего увидеть на скрипичном сюжете.
Мигрирующие клетки нервного гребня в этой области имели среднее соотношение сторон примерно 2,13, а соотношение сторон один указывает на симметричную форму. Тщательное иссечение и эксплантирование имеют решающее значение для успешных культур. Дайте нервным складкам осесть вниз в течение 10-15 минут, а затем медленно перенесите в инкубатор, чтобы стимулировать адгезию.
Вариации этих методов включают преходящие генетические манипуляции перед культивированием и покадровую визуализацию во время инкубации. Кроме того, этот протокол позволяет собирать популяции предмиграторных и мигрирующих клеток нервных гребней для анализа на уровне омики.
