Эти протоколы предназначены для понимания того, как нейтрофилы человека взаимодействуют с бактериальными биопленками и убивают их. Цель состоит в том, чтобы лучше понять это и ограничить изменчивость от анализа к анализу, понимая, что существуют неотъемлемые проблемы с нейтрофилами человека от донора к донору. Методы, перечисленные здесь, были оптимизированы, чтобы позволить пользователям проводить эксперименты с минимальной изменчивостью, особенно со слабо прикрепленными биопленками.
Кроме того, эти протоколы также могут быть адаптированы для изучения других микробов, которые могут образовывать биопленки. Начните с получения изолированных колоний золотистого стафилококка из криоконсервированного бульона с использованием метода полосовой пластины на богатой питательными веществами агаровой пластине, такой как триптический соевый агар. Обмазывайте отдельные колодцы из 96-луночной плиты 100 микролитрами ФАПЧ, разведенными в стерильной воде, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
Аспирируйте раствор ФАПЧ асептически с помощью вакуумной аспирационной ловушки. Дайте колодцам высохнуть ночью при комнатной температуре. Подготовьте ночную культуру, инокулируя колонию S.aureus в MEM-альфа, дополненную 2% глюкозой и инкубированную при 37 градусах Цельсия в течение 16-18 часов при 200 оборотах в минуту.
Разбавить культуру на ночь, перенеся 50 микролитров на пять миллилитров свежего MEM-альфа, дополненного 2% глюкозой. Затем инкубируют его при 37 градусах Цельсия со скоростью 200 оборотов в минуту до достижения среднелогарифмической фазы. Используйте MEM-альфа для нормализации среднелогарифмической культуры до OD 0,1.
Перенесите 150 микролитров нормализованной культуры в каждую лунку обработанной ФАПЧ 96-луночной пластины. Инкубируйте пластину в увлажненной камере при 37 градусах Цельсия в течение 18-20 часов. Аспирировать супернатант для удаления планктонных клеток.
Осторожно промыть оставшуюся биомассу 150 микролитрами HBSS, чтобы удалить неприкрепленные клетки. Повторите по крайней мере дважды, чтобы удалить все планктонные клетки. Добавьте 100 микролитров 20% нормальной сыворотки человека, разведенной в HBSS по каплям, в промытую биопленку и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы опсонизировать биопленку.
Аспирировать сывороточный раствор и промыть биопленки по каплям 150 микролитрами HBSS. Аспирировать HBSS, оставляя после себя колодцы с опсонизированными биопленками. Добавьте люминол к нейтрофилам, повторно суспендированным в HBSS, чтобы составить конечную концентрацию пяти микромолярного люминола.
Этот раствор готов к применению для групп А и С.Добавляют нейтрофилы, смешанные с люминолом, в лунки с опсонизированными биопленками. Для группы D готовят 50 микромолярного раствора люминола в HBSS в отдельной пробирке без каких-либо нейтрофилов и добавляют его в лунку, содержащую биопленку. Aliquot 350 микролитров нейтрофилов смешивают с люминолом и добавляют PMA в конечной концентрации 500 нанограмм на миллилитр в смесь.
Для группы В добавляют нейтрофилы из этой смеси в лунки без биопленки. Это служит положительным контролем. Центрифугируйте пластину при 270 RCF в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия.
Убедитесь, что считыватель пластин установлен на 37 градусов цельсия, люминесценция и кинетическое чтение в течение 60 минут с трехминутными интервалами. Поместите пластину в считыватель пластин, чтобы измерить выработку АФК нейтрофилами в течение 60 минут. Используйте флуоресцентный штамм S.aureus, такой как USA300, экспрессирующий GFP, чтобы облегчить микроскопическую визуализацию.
Инкубировать нейтрофилы со 100 микромолярами BCD в течение 30 минут в коромысле при 37 градусах Цельсия с 5% атмосферным углекислым газом. Убедитесь, что образцы инкубируются в темноте, и ограничьте воздействие света. Чтобы промыть избыток BCD, центрифугируют нейтрофилы при 270 RCF в течение пяти минут и аспирируют супернатант.
Повторно суспендировать нейтрофилы в свежем HBSS. Затем добавляют гомодимер этидия-1 к окрашенным БКД нейтрофилам в конечной концентрации четырех микромоляров для мониторинга нейтрофилов и бактериальной гибели. Промыть биопленку HBSS и добавить 150 микролитров нейтрофилов в биопленку S.aureus, которая была выращена в микрослайдах.
Высиживайте микрополости в увлажненной камере в течение 30 минут. Количество бактериальных клеток будет основано на количестве клеток, полученных в результате 18-часового покрытия биопленки. Представьте взаимодействие биопленки нейтрофилов с помощью флуоресцентных каналов, соответствующих флуоресцентным красителям, или длин волн возбуждения и излучения белков.
Бактериальные питательные среды минимизировали жизнеспособность нейтрофилов примерно до 60% через 30 минут инкубационного периода. Питательные среды клеток млекопитающих, однако, не влияют на жизнеспособность нейтрофилов, а также могут поддерживать рост биопленок S.aureus. Нейтрофилы, обработанные ПМА, используемые в качестве контроля, показали повышенную продукцию АФК.
В отсутствие биопленок нейтрофилы, обработанные PMA, показали надежную продукцию АФК. В присутствии биопленки S.aureus общая продукция АФК нейтрофилами, обработанными PMA, уменьшалась, в то время как в отсутствие PMA нейтрофилы полагались исключительно на свое взаимодействие с биопленкой, что еще больше снижало производство АФК. Широкоугольная флуоресцентная микроскопия показала, что многие нейтрофилы были локализованы на поверхности, в то время как некоторые находились в биопленках S.aureus.
Большинство клеток S.aureus, взаимодействующих с нейтрофилами, были мертвы, в то время как некоторые остались живыми, как определено окрашиванием LIVE /DEAD. Биопленки, окрашенные гомодимером этидия-1, выявили часть мертвой популяции S.aureus в биопленке. Эффект промывки биопленки и нейтрофилов после 30 минут инкубации для удаления неприлипших нейтрофилов показал, что около 33% мертвых нейтрофилов все еще были прикреплены к биопленке.
Перечисленные здесь протоколы также могут быть использованы для дальнейшего изучения других функциональных возможностей нейтрофилов, таких как фагоцитоз и формирование внеклеточных ловушек нейтрофилов, когда нейтрофилы сталкиваются с биопленками.
