Этот протокол сравнивает нагрузку бета-амилоидных бляшек в полных разделах, представляющих интерес, и субрегионах, представляющих интерес в отделах мозга трансгенных мышей APP / PS1. Метод и результаты, представленные в этом конкретном протоколе, позволят читателям или исследователям выбирать между полной областью интереса или анализом подобласти интереса для определения бета-нагрузки в разделах мозга мыши. Для начала загрузите программное обеспечение для анализа изображений.
После установки запустите программное обеспечение и нажмите на файл, затем откройте и выберите образ для анализа. На панели инструментов программного обеспечения выберите прямой инструмент и нарисуйте прямую линию по длине шкалы. Нажмите на анализ, затем нажмите на заданные вкладки масштабирования.
Опять же, нажмите на анализ, затем измерьте вкладки, чтобы отметить длину или расстояние шкалы в пикселях. Во всплывающем окне введите расстояние в пикселях, известное расстояние шкалы и введите единицу длины в виде микрометра. Затем установите глобальный флажок, чтобы применить новый параметр масштабирования ко всем следующим изображениям, если обрабатывается несколько изображений.
Нажмите кнопку ОК, чтобы применить параметры. Чтобы установить нужное измерение для области раздела, перейдите к анализу, затем установите измерения, выберите область и отобразите поля с метками. Убедитесь, что анализируемое изображение выбрано на вкладке Перенаправить на.
Для удобства визуализации гиппокампа или коры головного мозга перейдите к изображению и отрегулируйте яркость или контрастность. Постепенно перетаскивайте максимальную скользящую панель влево, чтобы увеличить прозрачность тканей до тех пор, пока не будут идентифицированы интересующие области мозга или рентабельность инвестиций. Используйте инструмент выделения полигона или от руки, чтобы очертить область гиппокампа.
Как только область будет обозначена, нажмите на опцию сброса настроек яркости или контрастности, чтобы вернуться к исходной яркости. Чтобы измерить общую площадь тканей выбранной области, нажмите на правку и очистите снаружи. Как только выбранная область станет единственным изображением на экране, нажмите на анализ, а затем измерьте вкладки, чтобы получить общую площадь ткани, проанализированную во всплывающем окне.
Затем сохраните данные в файле Excel. Чтобы измерить положительную область окрашивания 6-E10, перейдите к изображению, отрегулируйте и цветовые пороговые вкладки по порядку. Готовый фильтр под методом пороговых значений обеспечивает желаемые результаты, выделяя самые сильные сигналы красным цветом.
После выбора соответствующего порога проверьте темный фон, чтобы выделить бета-амилоидные пятна на черном фоне. Нажмите на выбранный, затем оригинальный, и снова выберите, давая темные сигналы бета-амилоидных отложений на белом фоне. Когда появится всплывающее окно, нажмите на вкладку «Анализ и анализ частиц» и нажмите OK. Скопируйте сводные выходные данные, сгенерированные программным обеспечением, нажав на кнопки редактирования и копирования.
Затем вставьте в ранее запущенный файл Excel с соответствующими метками. Рассчитайте процент положительной области 6E-10 с помощью формулы После загрузки программного обеспечения для анализа изображений выполните шаги, пока ROI мозга не будет идентифицирован, как показано ранее. Затем, используя инструмент «Прямоугольник», выберите ROI в коре или гиппокампе.
На панели инструментов нажмите «Редактировать», затем выберите и укажите вкладку, изменив высоту и ширину на предопределенное значение. Отрегулируйте коробку так, чтобы она была полностью покрыта тканью. Сбросьте яркость или контрастность к исходной яркости.
Продублируйте выбранную рентабельность инвестиций, щелкнув правой кнопкой мыши поле и щелкнув дубликат. Откроется новое окно с выбранным регионом. Переименуйте дублированное изображение, чтобы отобразить регион, в котором оно находится.
Отрегулируйте повторяющийся тип изображения, используя панель инструментов и щелкнув по изображению, затем введите 8-битные клавиши, чтобы преобразовать дублированное изображение RGB в 8-битное, чтобы лучше проанализировать таблички. Инвертируйте изображение, нажав на редактирование, а затем инвертируйте. Чтобы измерить положительную область 6E-10, перейдите к изображению, затем отрегулируйте и порог.
Предопределенный фильтр под методом пороговых значений обеспечит желаемые результаты, выделяя самые сильные сигналы красным цветом. После выбора соответствующего порогового значения нажмите кнопку Применить. Чтобы проанализировать положительную область 6E-10, используйте панель инструментов и нажмите на вкладки анализа и анализа частиц, обеспечив проверку итоговых результатов.
Скопируйте сводный вывод с процентной областью, щелкнув вкладки редактирования и копирования. Затем вставьте сводные выходные данные в ранее запущенный файл Excel с соответствующими метками. Повторите процедуру для различных областей в ткани, гарантируя, что размещение каждой коробки, чтобы очертить рентабельность инвестиций, согласуется между каждым изображением.
В этой репрезентативной оценке сравниваются методы полного и суб-ROI-анализа для количественной оценки положительной области 6E-10 в ткани мозга коры и гиппокампа. Полный анализ ROI включает в себя описание всей ROI. В отличие от этого, суб-анализ ROI включает в себя выбор предопределенного региона в пределах ROI.
Здесь показана пошаговая процедура количественной оценки полной и суб-ROI 6E-10 положительной площади с ротацией ROI для количественной оценки sub ROI. Корреляция между полным и суб-анализом ROI демонстрируется здесь. Значительная положительная корреляция наблюдалась между положительной областью 6E-10, о которой сообщили два читателя, выполняющие суб-анализ ROI для коры и гиппокампа.
Кроме того, усредненная положительная область sub ROI 6E-10 имела сильную, значительную положительную корреляцию с областью, полученной с использованием полной ROI. Для средней положительной области 6E-10 в полном объеме в суб-ROI анализах не наблюдалось существенных различий в коре и гиппокампе. Была отмечена значительная корреляция между измерениями гомогената всего мозга и растворимого бета-амилоида 1-42 Элизой, и полный анализ ROI из исследования Выбор порога является ключом к получению точной количественной оценки данных.
Вмешательство пользователя необходимо для обеспечения точного отбора положительных пятен с помощью выбранного фильтра. Помимо количественной оценки бета-амилоида, этот метод может быть использован для других флуоресцентных иммунокрасителей. Например, Iba-1, из количественной оценки микроглиальной положительной области.
