Этот метод позволит исследователю исследовать трудноизучаемые системы, такие как пептиды и ионы переходных металлов первого ряда, оба из которых, как правило, сложны при использовании более стандартных приложений. Основным преимуществом здесь является использование ортогональных методов, потому что они хорошо дополняют друг друга, и это может дать больше понимания системы и помочь нам не пропустить ни одного явления. Метод, подробно описанный в этом видео, очень хорошо подходит для изучения других систем.
Хотя мы показываем его с Cu(II) и пептидом, его можно использовать для многих различных взаимодействий пептидов металлов и белков металлов. Я думаю, что самой сложной частью будет найти хороший выбор буфера для вашего иона металла и пептида. Я бы обратился к литературе, чтобы увидеть, какие буферы использовались другими раньше.
Продемонстрировать процедуру будет Сохи Чой, аспирант моей исследовательской лаборатории. Для начала включите электронный абсорбционный спектрофотометр и дайте ему прогреться примерно за 15-20 минут до использования. Затем запустите программное обеспечение спектрофотометра и настройте параметры, такие как диапазон сканирования от 200 до 900 нанометров, диапазон сканирования 200 нанометров в секунду и скорректированная базовая линия двойного луча.
Затем соберите базовую линию без кювет или образцов на путях луча. Используя две совпадающие кюветы в двухлучевом спектрофотометре, загрузите одну кювету со 115 микролитрами сверхчистой воды, а другую кювету со 115 микролитрами пептидного образца, гарантируя, что в кюветах нет пузырьков воздуха, поскольку они будут мешать сигналу. После этого поместите кювету со сверхчистой водой в опорный пучок и кювету с пептидом в пучок образца.
Затем собирают спектр поглощения безметаллового пептида. Добавьте субстехиометрическое количество раствора Cu(II) в кювету с образцом пептида и запишите объем для анализа позже. Аккуратно проложите его вверх и вниз, чтобы перемешать раствор, избегая образования пузырьков воздуха.
После уравновешивания в течение пяти минут поместите кювету обратно в держатель ячейки образца и запишите спектр поглощения. Затем повторяют добавление Cu(II)аликвот в пептидный раствор для различных эквивалентов и записывают общий объем Cu(II), добавленный в кювету. После инициализации программного обеспечения, как описано ранее, в двух согласованных кюветах загрузите одну кювету со 115 микролитрами сверхчистой воды, а другую кювету с 115 микролитрами медно-фенного комплексного раствора.
Поместите кювету с водой в опорный пучок и кювету с раствором медно-фенного комплекса в пробоотборный пучок. Затем собирают спектр поглощения комплекса лигандов металлов. После этого добавьте стехиометрическое количество пептида в раствор медно-фенного комплекса и осторожно проложите его вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать, стараясь не вводить пузырьки воздуха.
Далее инкубируют раствор в течение пяти минут, чтобы достичь равновесия. Поместите кювету обратно в держатель ячейки образца и запишите спектр поглощения. Позже повторяют добавление пептидных аликвот в раствор медно-фенного комплекса для различных эквивалентов, и записывают объем добавленного пептида, чтобы можно было определить разбавленную концентрацию.
Сначала включите ITC и запустите программное обеспечение ITC для запуска прибора. После первой инициализации верните бюретку и следуйте инструкциям на экране. Затем снимите бюретку и крышку с эталонной ячейки.
Затем удалите любую воду из эталонной ячейки и трижды промойте 450 микролитрами дегазированной ультрачистой воды. Медленно подтягивайте сверхчистую воду до отметки 450 микролитров загрузочного шприца, стараясь не вводить пузырьки воздуха в шприц. Затем вставьте загрузочный шприц в опорную ячейку до тех пор, пока он не окажется примерно в одном миллиметре от дна, и медленно впрыскивайте часть раствора до тех пор, пока в загрузочном шприце не останется 150 микролитров.
После этого быстро перемещайте плунжер загрузочного шприца вверх и вниз примерно на 25 микролитров несколько раз, чтобы выбить любые пузырьки на поверхности ячейки. Затем медленно впрыскивайте до тех пор, пока плунжер не достигнет отметки в 100 микролитров на загрузочном шприце, тем самым дозируя в общей сложности 350 микролитров сверхчистой воды в эталонную ячейку и заменяя крышку эталонной ячейки. После удаления любого остаточного раствора из ячейки образца загрузите 450 микролитров 10 миллимоляров ЭДТА с помощью нагрузочного шприца и замочите в течение 10 минут, чтобы обеспечить удаление следовых ионов металлов, поскольку ЭДТА будет связывать следовые металлы.
После удаления раствора ЭДТА тщательно промойте загрузочный шприц обильным количеством сверхчистой воды. Очистите ITC в соответствии с указаниями производителя, промыв ячейку образца ультрачистой водой. Удалите любую остаточную воду из ячейки образца, а затем кондиционируйте ячейку образца, промыв 450 микролитров буфера по меньшей мере три раза.
Затем удалите остаточный буфер, который обусловливает клетку образца, и загрузите пептидный раствор в ячейку образца с помощью загрузочного шприца. Затем промыть шприц титрования 200 микролитрами буферного раствора, сначала удалив плунжер. Используя микропипетку, пипетку буферного раствора через отверстие в верхней части стеклянного титрационного шприца через шприц и наружу иглу внизу.
Позже полностью вставьте поршень в шприц титрования. Затем окуните наконечник иглы шприца титрования в металлический раствор и медленно потяните плунжер вверх, в результате чего металлический раствор заполнит шприц и в результате образуется пустой объем в верхней части стеклянной части титрующего шприца. Чтобы удалить пустоту объема, поверните шприц титрования параллельно полу.
Затем снимите поршень и слегка наклоните стеклянную часть к полу. Аккуратно встряхните шприц титрования так, чтобы раствор переместился в стеклянную часть титрационного шприца и заполнил большую часть объема пустоты. Но убедитесь, что осталось два-три микролитра пустого объема.
Держа шприц параллельно полу, снова вставьте плунжер. Затем держите шприц титрования в вертикальном положении и окуните кончик иглы обратно в металлический раствор. Затем толкните плунжер вниз до тех пор, пока воздух не перестанет выходить из иглы, и загрузите шприц титрования, медленно подтягивая плунжер чуть выше отметки в 50 микролитров, сохраняя кончик иглы в растворе.
Осторожно вставьте стеклянную часть шприца титрования в бюретку и вкрутите до плотного зажима пальца. После этого с помощью легкого тонкого стеклоочистителя поглощайте раствор, который выходит из шприца титрования из-за сжатия плунжера, не касаясь кончика иглы. Затем вставьте бюретку со шприцем титрования в ячейку образца и надежно закрепите ее.
Чтобы настроить параметры программного обеспечения ITC, выберите Управление приборами. Установите скорость перемешивания и температуру. Затем в разделе «Подробности эксперимента» введите шприц и концентрации клеток в миллимолярных единицах.
Затем в разделе Метод эксперимента выберите Добавочное титрование. Нажмите «Настройка» и укажите 20 инъекций по 2,5 микролитра, а если требуется большее разрешение для наблюдения за событием связывания, увеличьте количество инъекций и уменьшите объем на инъекцию. После этого введите временной интервал между каждой инъекцией, чтобы он был достаточно длинным, чтобы сигнал уравновешивался и возвращался к базовому уровню, обычно 300 секунд.
Затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать эксперимент и указать, где хранятся данные. Титрование Cu(II) было выполнено в C-пептид, демонстрируя, что добавление 150 микромоляров Cu(II) вызвало немедленное увеличение в диапазоне на 600 нанометров, приписываемых d-d диапазону Cu(II), и продолжало увеличиваться до тех пор, пока не было добавлено 300 миллимоляров Cu(II). Дальнейшее добавление выше 300 микромоляров Cu(II) не увеличивало поглощение d-d бана, указывающего на насыщение и на то, что Cu(II)связывается с C-пептидом в комплексе 1:1 со значением log K более шести.
С-пептид титровали примерно в 10 микромолярный медно-фенный комплекс, и поглощение из полосы переноса заряда на 265 нанометров уменьшалось, что указывает на то, что С-пептид был способен хелатировать Cu(II) из лиганда фенантролина со значением log K от 7,4 до 7,8. Термограмма ITC показывает титрование 1,4 миллимоляра Cu(II) в 154 микромолярный C-пептид в 15-миллимолярном буфере MOPS. Было обнаружено, что сродство связывания имеет значение log K, равное восьми с изменением энтальпии как 8 килоджоулей на моль.
Свободная энергия Гиббса составляет минус 46 килоджоулей на моль, а энтропия изменяется как 120 джоулей на моль на кельвин. Контролируемое титрование 1,4 миллимоляра Cu(II) в 15-миллимолярный буфер MOPS в отсутствие C-пептида не показывает связывания в термограмме. Я бы сказал, чтобы убедиться, что все чисто.
Если есть ионы металлов или пептиды, оставшиеся от предыдущих экспериментов, это может резко повлиять на стехиометрию и обеспечить неизвестную конкуренцию в экспериментах по связыванию. Круговой дихроизм является еще одним методом изучения взаимодействия пептидов металлов или белков металлов, поскольку он рассматривает хиральность. Масс-спектрометрия также может исследовать эти комплексы, глядя на изменения массы.
Этот набор методов использовался многими лабораториями, которые изучают ионы металлов, взаимодействующие с пептидами или белками.
